Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) är en framväxande teknik för bestämning av proteintopografiska förändringar genom ultrasnabb kovalent modifiering av den lösningsmedelsexponerade ytan av proteiner följt av detektion av LC-MS¹. FPOP genererar en hög koncentration av hydroxylradikaler in situ genom UV-laserblixt fotolys av väteperoxid. Dessa hydroxylradikaler är mycket reaktiva och kortlivade, konsumeras på ungefär en mikrosekund tidsskala under FPOP villkor². Dessa hydroxylradikaler sprider sig genom vatten och oxiderar olika organiska komponenter i lösning vid kinetiska satser som generellt sett sträcker sig från snabb (~10⁶ M^-1 s^-1) till diffusionsstyrd³. När hydroxylradikala möter en proteinyta kommer radikalen att oxidera aminosyrans sidokedjor på proteinytan, vilket resulterar i en massförskjutning av den aminosyran (oftast den nettotillsats av en syreatom)⁴. Oxidationsreaktionens hastighet vid någon aminosyra beror på två faktorer: den inneboende reaktiviteten av den aminosyran (som beror på sidokedjan och sekvenssammanhang)⁴,^{5 och}den sidokedjans tillgänglighet till den spridande hydroxylradikala, som nära korrelerar till den genomsnittliga lösningsmedels åtkomliga ytan^6,7. Alla av de standarda aminosyrorna utom glycin har observerats som märkta av dessa mycket reaktiva hydroxylradikaler i FPOP-experiment, om än vid vitt skilda avkastningar; i praktiken, Ser, Thr, Asn, och Ala ses sällan som oxideras i de flesta prover utom under höga radikala doser och identifieras genom noggrann och känslig riktade ETD fragmentering^8,9. Efter oxidation släcks proverna för att avlägsna väteperoxid och sekundära oxidanter (superoxid, singlet oxygen, peptidylhydroxider etc.) De släckta proverna är sedan proteolytiskt rötade för att generera blandningar av oxiderade peptider, där den strukturella informationen fryses som en kemisk “ögonblicksbild” i mönstren för oxidationsprodukter av de olika peptiderna (Figur 1). Vätskekromatografi som kopplas till masspektrometri (LC-MS) används för att mäta mängden oxidation av aminosyror i en given proteolytisk peptid baserat på de relativa intensiteterna hos de oxiderade och ooxiderade versionerna av den peptiden. Genom att jämföra detta oxidativa fotavtryck av samma protein som erhållits under olika konformationsförhållanden (t.ex. ligandbundet kontra ligandfritt) kan skillnader i mängden oxidation av en viss region av proteinet korreleras direkt med skillnader i den lösningsmedelstillgängliga ytan i den^{regionen 6,7}. Förmågan att tillhandahålla protein topografisk information gör FPOP till en attraktiv teknik för högre ordningens strukturbestämning av proteiner, bland annat vid proteinterapeutisk upptäckt och utveckling^10,11.

Bild 1: Översikt av FPOP. Proteinens yta kovalent modifieras av mycket reaktiva hydroxylradikaler. De hydroxylradikaler kommer att reagera med aminosyra sidokedjor av proteinet i en takt som starkt påverkas av lösningsmedel tillgänglighet av sidokedjan. Topografiska förändringar (till exempel på grund av bindningen av en ligand som visas ovan) kommer att skydda aminosyror i regionen av interaktion från att reagera med hydroxylradikaler, vilket resulterar i en minskning av intensiteten av modifierad peptid i LC-MS signalen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Olika beståndsdelar som finns i FPOP-lösningen (t.ex., ligander, hjälpämnen, buffertar) har olika rensningsaktivitet mot de hydroxylradikaler som genereras på laserfotolysen av väteperoxid³. På samma sätt kan en liten förändring i peroxidkoncentration, laserfluens och buffertkomposition ändra den effektiva radikaldosen, vilket gör reproduktionen av FPOP-data utmanande över proverna och mellan olika laboratorier. Därför är det viktigt att kunna jämföra den hydroxylradikala dos som finns att reagera med protein i varje prov med hjälp av en av flera tillgängliga hydroxylradikala dosimeter^{12,13,14,15,16}. Hydroxylradikala dosimeters agera, genom att konkurrera med analyten (och med alla asätare i lösning) för slå samman av hydroxylradikaler; den effektiva dosen av hydroxylradikaler mäts genom mätning av mängden oxidation av dosimetern. Observera att “effektiv hydroxylradikala dos” är en funktion av både den initiala koncentrationen av hydroxylradikala genereras och halveringstiden för den radikala. Dessa två parametrar är delvis beroende av varandra, vilket gör den teoretiska kinetiska modelleringen något komplex (Figur 2). Två prover kunde ha vilt olika inledande radikala halveringstid samtidigt som samma effektiva radikal dos genom att ändra den ursprungliga koncentrationen av hydroxylradikala bildas; de kommer fortfarande att generera identiska fotavtryck¹⁷. Adenin¹³ och Tris¹² är bekväma hydroxylradikala dosimeter eftersom deras oxidationsnivå kan mätas med UV-spektroskopi i realtid, vilket gör det möjligt för forskare att snabbt identifiera när det finns ett problem med effektiv hydroxylradikala dos och att felsöka deras problem. För att lösa detta problem, en inline dosimeter som ligger i flödessystemet direkt efter platsen för bestrålning som kan övervaka signalen från adenin absorbans förändringar i realtid är viktigt. Detta hjälper i utförandet av FPOP experiment i buffertar eller någon annan hjälpämne med vitt skilda nivåer av hydroxylradikala rensning kapacitet¹⁷. Denna radikala doseringskompensation kan utföras i realtid, ger statistiskt omöjlig att skilja resultat för samma conformer genom att justera den effektiva radikal dos.

I detta protokoll, Vi har detaljerade förfaranden för att utföra en typisk FPOP experiment med radikal dosering ersättning med hjälp av adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Med den här metoden kan prövarna jämföra avtryck mellan FPOP-villkor som har olika rensningskapacitet genom att utföra kompensation i realtid.

Figur 2: Kinetisk simulering av dosimetribaserad ersättning. 1 mM adenin dosimeter svar mäts i 5 μM lysozym analyte med en 1 mM initial hydroxylradikala koncentrationen (▪OH t_1/2=53 ns), och som ett mål dosimeter svar (svart). Vid tillsats av 1 mM av asätaren excipient histidin, dosimetern svaret (blå) minskar tillsammans med mängden protein oxidation på ett proportionellt sätt (cyan). Halveringstiden för hydroxylradikala minskar också (▪ H._1/2=39 ns). När mängden hydroxylradikala genereras ökas för att ge en motsvarande avkastning av oxiderad dosimeter i provet med 1 mM histidin asopvenger som uppnås med 1 mM hydroxylradikala i frånvaro av sca med en mängd proteinoxidation som uppträder på liknande sätt blir identiskt (magenta), medan den hydroxylradikala halveringstiden minskar ännu mer (▪OH t_1/2=29 ns). Anpassad med tillstånd från Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.