Быстрая фотохимическая окисление белков (FPOP) является новым методом определения топографических изменений белка сверхбыстрой ковалентной модификацией поверхности растворителя, за которой следует обнаружение LC-MS^1. FPOP генерирует высокую концентрацию гидроксиловых радикалов на месте с помощью ультрафиолетового лазерного флэш-фотолиза перекиси водорода. Эти гидроксиловые радикалы очень реактивны и недолговечны, потребляются примерно на микросекундной шкале времени в условиях FPOP^2. Эти гидроксиловые радикалы рассеиваются через воду и окисляют различные органические компоненты в растворе с кинетической скоростью, как правило, начиная от быстрых^{(10 6 М -1} с^{-1) до}диффузионнно-контролируемых³. Когда гидроксил радикал сталкивается с белковой поверхностью, радикал окисляет аминокислотные боковые цепи на поверхности белка, что приводит к массовому сдвигу этой аминокислоты (чаще всего чистого добавления одного атома кислорода)^4. Скорость реакции окисления у любой аминокислоты зависит от двух факторов: присущей реакции этой аминокислоты (которая зависит от боковой цепи и контекста^{последовательности) 4, 5идоступности этой} боковой цепи к диффузиву гидроксильного радикала, который тесно коррелирует со средней доступной^{площадью поверхности растворителя 6,,7.} Все стандартные аминокислоты, за исключением глицина, были отмечены как помеченные этими высокореактивными гидроксиловыми радикалами в экспериментах FPOP, хотя и с широко отличающимися урожаями; на практике, Ser, Thr, Asn и Ala редко рассматриваются как окисленые в большинстве образцов, за исключением высоких радикальных доз и выявленных тщательной и чувствительной целевой фрагментации ETD^8,9. После окисления, образцы утоляются для удаления перекиси водорода и вторичных окислителей (супероксид, синглетный кислород, пептидил гидропероксиды и т.д.) Утоленые образцы затем протеолитически усваиваются для генерации смесей окисленых пептидов, где структурная информация замораживается как химический “снимок” в моделях продуктов окисления различных пептидов(рисунок 1). Хроматография жидкости в сочетании с масс-спектрометрией (LC-MS) используется для измерения количества окисления аминокислот в данном протеолитическом пептиде на основе относительной интенсивности окисленных и неоксидированных версий этого пептида. Сравнивая этот окислительный след одного и того же белка, полученного при различных конформативных условиях (например, лиганд-связанный по сравнению с лиганд-свободным), различия в количестве окисления данной области белка могут быть непосредственно связаны с различиями в растворительной доступной поверхности^{области этого региона 6,7}. Возможность предоставления белковой топографической информации делает FPOP привлекательной технологией для определения структуры высшего порядка белков, в том числе в белковых терапевтических^{открытиях и разработках 10,,11}.

Рисунок 1: Обзор FPOP. Поверхность белка ковалентно модифицирована высокореактивными гидроксильными радикалами. Гидроксиловы радикалы будут реагировать с аминокислотными боковыми цепями белка со скоростью, которая сильно зависит от растворителя доступности боковой цепи. Топографические изменения (например, из-за связывания лиганда, как показано выше) защитят аминокислоты в области взаимодействия от реакции с гидроксильными радикалами, что приведет к снижению интенсивности модифицированного пептида в сигнале LC-MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Различные компоненты, присутствующие в растворе FPOP (например, лиганды, эксципиенты, буферы) имеют различную активность очистки по отношению к гидроксильным радикалам, генерируемым лазерным фотолизом перекиси^{водорода 3}. Аналогичным образом, небольшое изменение концентрации перекиси, лазерной беглости и буферного состава может изменить эффективную радикальную дозу, что делает воспроизведение данных FPOP сложным в образцах и между различными лабораториями. Поэтому важно иметь возможность сравнить дозу гидроксилового радикала, доступную для реакции с белком в каждом образце с использованием одного из нескольких доступных^{гидроксилов радикальных дозиметров 12,,13,,14,,15,,16.} Гидроксил радикальные дозиметры действуют, конкурируя с аналитом (и со всеми падальщиками в растворе) за пул гидроксиловых радикалов; эффективная доза гидроксиловых радикалов измеряется путем измерения количества окисления дозиметра. Отметим, что “эффективная гидроксиловая радикальная доза” является функцией как начальной концентрации генерируемого гидроксилового радикала, так и полуиллиона радикала. Эти два параметра частично зависят друг от друга, что делает теоретическое кинетическое моделирование несколько сложным(рисунок 2). Два образца могут иметь дико разные первоначальные радикальные периоды полуиму жизни, сохраняя при этом ту же эффективную радикальную дозу, изменяя начальную концентрацию гидроксилового радикала; они будут по-прежнему генерировать идентичные^{следы 17}. Аденин^{13 и} Tris^{12 являются удобными} гидроксильно-радикальными дозиметрами, потому что их уровень окисления может быть измерен с помощью УФ-спектроскопии в режиме реального времени, что позволяет исследователям быстро определить, когда есть проблема с эффективной гидроксиловой радикальной дозой и решить их проблему. Для решения этой проблемы важен стационарный дозиметр, расположенный в системе потока непосредственно после места облучения, который может контролировать сигнал от изменения абсорбции аденина в режиме реального времени. Это помогает в проведении экспериментов FPOP в буферах или любой другой excipient с широко различными уровнями гидроксиловой радикальной очистки потенциала¹⁷. Эта радикальная компенсация дозировки может быть выполнена в режиме реального времени, что дает статистически неразличимые результаты для того же конформера путем корректировки эффективной радикальной дозы.

В этом протоколе, у нас есть подробные процедуры для выполнения типичного эксперимента FPOP с радикальной компенсации дозировки с использованием аденина в качестве внутреннего оптического радикала дозиметра. Этот метод позволяет следователям сравнивать следы в условиях FPOP, которые имеют различную емкость очистки, выполняя компенсацию в режиме реального времени.

Рисунок 2: Кинетическое моделирование компенсации на основе дозиметрии. 1 мМ аденин дозиметр ответ измеряется в 5 мкм лизозима аналит с 1 мм начальной концентрации гидроксилового радикала (▪OH t_{1/2 и}53нс), и установить в качестве целевого дозиметра ответ (черный). При добавлении 1 мМ от мусорщика экстракции гистидина, дозиметр ответ (синий) уменьшается вместе с количеством окисления белка в пропорциональном порядке (голубой). Сокращается также срок полусысли гиоксилового радикала (▪OH t_1/2и39 ns). Когда количество гидроксилового радикала увеличивается, чтобы дать эквивалентный выход окисленного дозиметра в образце с 1 мМ гистидина мусорщика, как достигнуто с 1 мМ гидроксил радикал в отсутствие мусорщика (красный), количество окисления белка, что происходит аналогичным становится идентичным (пурента), в то время как гидроксил радикальных период полуиссяка уменьшается еще больше (▪OH t_1/2).= Адаптировано с разрешения Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.