Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) er en fremvoksende teknikk for bestemmelse av proteintografiske endringer ved ultrarask kovalent modifisering av det løsemiddelutsatte overflatearealet av proteiner etterfulgt av deteksjon av LC-MS¹. FPOP genererer en høy konsentrasjon av hydroksylradikaler in situ ved UV laser flash fotolyse av hydrogenperoksid. Disse hydroksylradikale er svært reaktive og kortvarige, forbrukes på omtrent et mikrosekund tidsskala under FPOP forhold². Disse hydroksylradikale diffuse gjennom vann og oksiderer ulike organiske komponenter i oppløsning ved kinetiske priser generelt fra rask (~ 10⁶ M^-1 s^-1) til diffusjonskontrollert³. Når hydroksylradikale møter en proteinoverflate, vil radikaleren oksidere aminosyresidekjedene på proteinoverflaten, noe som resulterer i et masseskifte av den aminosyren (oftest nettotillegget av ett oksygenatom)⁴. Frekvensen av oksidasjonsreaksjonen ved en hvilken som helst aminosyre avhenger av to faktorer: den iboende reaktiviteten til aminosyren (som avhenger av sidekjeden og sekvenskonteksten)^4,5 og tilgjengeligheten til sidekjeden til den diffuse hydroksylradikale, som nøye korrelerer til gjennomsnittlig løsningsmiddel tilgjengelig overflate^6,,7. Alle standard aminosyrer unntatt glycin har blitt observert som merket av disse svært reaktive hydroksylradikale i FPOP eksperimenter, om enn ved vidt forskjellige utbytter; I praksis blir Ser, Thr, Asn og Ala sjelden sett på som oksidert i de fleste prøver unntatt under høye radikale doser og identifisert ved forsiktig og følsom målrettet ETD fragmentering^8,9. Etter oksidasjon slukkes prøvene for å fjerne hydrogenperoksid og sekundære oksidanter (superoksid, enkeltoksygen, peptidyhydroperoksider osv.) De slukkede prøvene blir deretter proteolytisk fordøyd for å generere blandinger av oksidert peptider, hvor den strukturelle informasjonen er frosset som et kjemisk “øyeblikksbilde” i mønstrene til oksidasjonsprodukter av de ulike peptidene (figur 1). Flytende kromatografi kombinert med massespektrometri (LC-MS) brukes til å måle mengden oksidasjon av aminosyrer i et gitt proteolytisk peptid basert på de relative intensitetene i de oksiderte og ukoksidiserte versjonene av dette peptidet. Ved å sammenligne dette oksidative fotavtrykket av det samme proteinet oppnådd under forskjellige konformasjonsforhold (f.eks. ligand-bundet versus ligand-fri), kan forskjeller i mengden oksidasjon av et gitt proteinområde være direkte korrelert med forskjeller i det løsemiddeltilfredse overflatearealet i den regionen^6,7. Evnen til å gi protein topografisk informasjon gjør FPOP til en attraktiv teknologi for høyere rekkefølge struktur bestemmelse av proteiner, inkludert i protein terapeutisk oppdagelse og utvikling^10,11.

Figur 1: Oversikt over FPOP. Overflaten av proteinet er kovalent modifisert av svært reaktive hydroksylradikaler. Hydroksylradikale vil reagere med aminosyre sidekjeder av proteinet i en hastighet som er sterkt påvirket av løsemiddel tilgjengeligheten av sidekjeden. Topografiske endringer (for eksempel på grunn av bindingen av en ligand som vist ovenfor) vil beskytte aminosyrer i samhandlingsområdet fra å reagere med hydroksylradikale, noe som resulterer i en reduksjon i intensiteten av modifisert peptid i LC-MS-signalet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ulike bestanddeler som finnes i FPOP-løsningen (f.eks. ligands, hjelpestoffer, buffere) har forskjellig scavenging aktivitet mot hydroksylradikale generert på laserfotolyse av hydrogenperoksid³. På samme måte kan en liten endring i peroksidkonsentrasjon, laserflyt og buffersammensetning endre den effektive radikale dosen, noe som gjør reproduksjonen av FPOP-data utfordrende på tvers av prøvene og mellom forskjellige laboratorier. Derfor er det viktig å kunne sammenligne hydroksylradikal dose tilgjengelig for å reagere med protein i hver prøve ved hjelp av en av flere tilgjengelige hydroksylradikale dosimeters^{12,13,,14,,15,,16}. Hydroxylradikale dosimeters handle ved å konkurrere med analytten (og med alle scavengers i løsning) for bassenget av hydroksylradikale; den effektive dosen av hydroksylradikaler måles ved å måle mengden oksidasjon av dosimeteret. Legg merke til at “effektiv hydroksylradikal dose” er en funksjon av både den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikal generert og radikalens halveringstid. Disse to parametrene er delvis avhengige av hverandre, noe som gjør den teoretiske kinetiske modelleringen noe kompleks (figur 2). To prøver kan ha svært forskjellige innledende radikale halveringsliv samtidig som den opprettholder den samme effektive radikale dosen ved å endre den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikale dannet; de vil fortsatt generere identiske fotavtrykk¹⁷. Adenine¹³ og Tris¹² er praktiske hydroksylradikale dosimeters fordi deres oksidasjonsnivå kan måles ved UV-spektroskopi i sanntid, slik at forskerne raskt kan identifisere når det er et problem med effektiv hydroksylradikal dose og for å feilsøke problemet. For å løse dette problemet er det viktig å finne en innebygd dosimeter i strømningssystemet rett etter bestrålingsstedet som kan overvåke signalet fra adeninabsorbansendringer i sanntid. Dette bidrar til å utføre FPOP eksperimenter i buffere eller andre hjelpestoffer med vidt forskjellige nivåer av hydroxyl radikal scavenging kapasitet¹⁷. Denne radikale doseringskompensasjonen kan utføres i sanntid, noe som gir statistisk umulige resultater for samme samsvar ved å justere den effektive radikale dosen.

I denne protokollen har vi detaljerte prosedyrer for å utføre et typisk FPOP-eksperiment med radikal doseringskompensasjon ved hjelp av adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Denne metoden gjør det mulig for etterforskere å sammenligne fotavtrykk på tvers av FPOP-forhold som har forskjellig scavenging kapasitet ved å utføre kompensasjon i sanntid.

Figur 2: Kinetisk simulering av dosimetrybasert kompensasjon. 1 m Adenin dosimeter respons måles i 5 μM lysozymanalytt med en 1 mM innledende hydroksylradikal konsentrasjon (▪OH t_1/2=53 ns), og satt som en måldoserrespons (svart). Ved tilsetning av 1 mM av scavenger hjelpende histidin, dosimeter respons (blå) reduseres sammen med mengden protein oksidasjon på en proporsjonal måte (cyan). Halveringstiden til hydroksylradikalen reduseres også (▪OH t_1/2=39 ns). Når mengden hydroksylradikal generert økes for å gi et tilsvarende utbytte av oksidert dosimeter i prøven med 1 mM histidin scavenger som oppnås med 1 mM hydroksylradikal i fravær av scaveng (rød), mengden proteinoksidasjon som oppstår på samme måte blir identisk (magenta), mens hydroksylradikal halveringstid reduseres ytterligere (▪OH t_1/2=29 ns). Tilpasset med tillatelse fra Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.