단백질(FPOP)의 빠른 광화학 산화는 LC-MS^1에의해 검출된 단백질의 용매 노출 표면적의 초고속 공유 변형에 의한 단백질 지형 변화를 측정하기 위한 새로운 기술이다. FPOP는 과산화수소의 UV 레이저 플래시 광분해에 의해 시상에서 고농도의 하이드록실 라디칼을 생성합니다. 이러한 하이드록실 라디칼은 매우 반응적이고 수명이 짧으며, FPOP 조건^2하에서대략 마이크로초 단위로 소비된다. 이러한 하이드록실 라디칼은 물을 통해 확산되고 일반적으로 빠른(~10^{6M -1 s-1)에서}확산^제어3에이르는 운동 속도로 용액의 다양한 유기 성분을 산화한다. 하이드록실 라디칼이 단백질 표면을 만날 때, 라디칼은 단백질 표면의 아미노산 측망을 산화시켜 그 아미노산의 질량 이동(가장 일반적으로 하나의 산소 원자의 순^{첨가)을 생성한다.} 어떤 아미노산에서 산화 반응의 속도는 두 가지 요인에 따라 달라집니다: 그 아미노산의 고유 반응 (사이드 체인 및 서열 컨텍스트에 따라 달라집니다)^4,,5 및 확산 하이드록실 라디칼에 그 측 체인의 접근성, 이는 밀접하게 평균 용매 접근 표면적 6에 상관 관계^6,,7. 글리신을 제외한 모든 표준 아미노산은 FPOP 실험에서 이러한 반응성이 높은 하이드록실 라디칼에 의해 표지된 것으로 관찰되었지만, 이는 널리 다른 수율에도 불구하고; 실제로, Ser, Thr, Asn 및 Ala는 고라디칼 복용량을 제외하고 대부분의 샘플에서 산화된 것으로 거의 보이며 신중하고 민감한 표적 ETD 단편화^8,,9에의해 식별됩니다. 산화 후, 시료는 과산화수소 및 이차 산화제 (슈퍼 산화물, 단일 산소, 펩디딜 하이드로퍼산화물 등)를 제거하기 위해 담금질됩니다. 담금질된 시료는 산화 펩티드의 혼합물을 생성하기 위해 프로테오틸리로 소화되며, 여기서 구조 정보는 다양한 펩티드의 산화 제품의 패턴에서 화학적 “스냅샷”으로 동결된다(도1). 질량 분석법(LC-MS)에 결합된 액체 크로마토그래피는 해당 펩타이드의 산화 및 산화되지 않은 버전의 상대적 강도에 기초하여 주어진 프로테오리틱 펩타이드에서 아미노산의 산화량을 측정하는 데 사용된다. 상이한 형태 조건하에서 수득된 동일한 단백질의 이러한 산화 발자국(예를 들어, 리간드-바운드 대 리간드 프리)을 비교함으로써, 단백질의 주어진 부위의 산화량의 차이는 해당^{6영역6,7의}용매 접근 표면적의 차이와 직접 상관관계가 있을 수 있다. 단백질 지형 정보를 제공하는 능력은 FPOP단백질 치료 발견 및^{개발(10,,11)을}포함한 단백질의 고차 구조 측정을 위한 매력적인 기술이다.

그림 1: FPOP 개요입니다. 단백질의 표면은 반응성이 높은 하이드록실 라디칼에 의해 공유적으로 변형됩니다. 하이드록실 라디칼은 측면 사슬의 용매 접근성에 의해 강하게 영향을 받는 속도로 단백질의 아미노산 측면 사슬과 반응할 것이다. 지형 변화(예를 들어, 위와 같이 리간드의 결합으로 인한)은 하이드록실 라디칼과 반응하지 않도록 상호작용 영역에서 아미노산을 보호하여 LC-MS 신호에서 수정된 펩타이드의 강도의 감소를 초래한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FPOP 용액(예를 들어, 리간드, 부형제, 완충제)에 존재하는 상이한 성분들은 과산화수소^3의레이저 광분해시에 생성된 하이드록실 라디칼을 향한 상이한 청소 활성을 갖는다. 유사하게, 과산화수소 농도의 작은 변화, 레이저 유창및 완충 조성물은 효과적인 라디칼 복용량을 변화시킬 수 있으며, 샘플 전체와 다른 실험실 사이에서 FPOP 데이터의 재생이 도전적일 수 있다. 따라서, 사용 가능한 여러 하이드록실 라디칼 도시미터^{,,12,13,14,15,,16}중 하나를 사용하여 각 시료에서 단백질과 반응할 수 있는 하이드록실 라디칼 용량을 비교할 수 있어야 한다.^, 하이드록실 라디칼 도지계는 하이드록실 라디칼 풀을 위해 마취제(및 용액의 모든 청소부와 경쟁하여) 작용합니다. 하이드록실 라디칼의 유효 용량은 도시계의 산화량을 측정하여 측정됩니다. 참고 “효과적인 하이드록실 라디칼 복용량”은 유체실 라디칼의 초기 농도와 라디칼의 반감기 모두의 기능이다. 이 두 매개 변수는 부분적으로 서로 의존하여 이론적 운동 모델링이 다소 복잡합니다(그림2). 두 샘플은 여전히 형성 된 하이드록실 급진적 인 의 초기 농도를 변경하여 동일한 효과적인 급진적 인 용량을 유지하면서 격렬하게 다른 초기 급진적 인 반감기를 가질 수 있습니다; 그들은 여전히 동일한 발자국을 생성합니다⁽¹⁷⁾. 아데닌¹³ 과 트리스¹² 산화의 그들의 수준을 실시간으로 UV 분광기에 의해 측정 될 수 있기 때문에 편리한 하이드록실 급진적 인 도시미터, 연구원은 신속하게 효과적인 하이드록실 급진적 인 용량에 문제가있을 때 식별하고 자신의 문제를 해결 할 수 있도록. 이 문제를 해결하기 위해, 실시간으로 adenine 흡광도 변화로부터 신호를 모니터링할 수 있는 조사 현장 직후 유량 시스템에 위치한 인라인 도지계가 중요하다. 이것은 버퍼 또는 하이드록실 라디칼 청소^{용량(17)의}광범위하게 다른 수준으로 다른 부형제에서 FPOP 실험을 수행하는 데 도움이 된다. 이러한 급진적인 복용량 보정 실시간으로 수행 될 수 있습니다., 효과적인 라 디 칼 복용량을 조정 하 여 동일한 conformer에 대 한 통계적으로 구별 할 수 있는 결과 산출.

이 프로토콜에서, 우리는 내부 광학 급진적 인 도시계로 아데닌을 사용하여 급진적 인 투여 보상과 전형적인 FPOP 실험을 수행하기위한 자세한 절차가 있습니다. 이 방법을 사용하면 조사관이 실시간으로 보상을 수행하여 용량이 다른 FPOP 조건에서 발자국을 비교할 수 있습니다.

그림 2: dosimetry 기반 보상의 역학 시뮬레이션. 1 mM 아데닌 도시계 응답은 1mM 초기 하이드록실 라디칼 농도(▪OH t_1/2=53ns)로 5 μM 리소지메 단량으로 측정되고 표적 도시계 응답(black)으로 설정한다. 폐포부부율이 1mM을 첨가하면, 체계 반응(blue)은 단백질 산화의 양과 함께 비례적 방식으로 감소(시안). 하이드록실 라디칼의 반감기도 감소합니다(▪OH t_1/2=39ns). 생성된 하이드록실 라디칼의 양이 증가하여 1mM 히스티딘 스캐빈거로 1mM 히스티딘 스캐빈거와 동일한 수율을 부여하여 1mM 하이드록실 라디칼라디칼(red)이 없는 경우, 유사하게 발생하는 단백질 산화의 양이 동일해지는 t반면,▪2.2=ns.2=2.1=2.2.1=2.2.1μg=2.00μg.m.mm-s-29=29μg/tOH=29μg/tOH=29μg=29μg==29μg/tOH=29μg/tOH.는 수압실라디칼의 반감기 감소(nsOH=29)를 더욱 감소시키는 반면, 1mM 히스티딘 스캐빈거로 1mM의 하이드록실 폐약량으로 달성하면 유사하게 발생하는 단백질 산화의 양이 동일해지고 있다(2OH=29)._1/2= 샤프 J.S.의 허가로 적응, Am Pharmaceut 레브 22, 50-55, 2019. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.