タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、溶媒曝露されたタンパク質の表面積の超高速共有修飾によるタンパク質地形変化の測定に新たな技術^であり、続いてLC-MS1による検出を行う。FPOPは、過酸化水素のUVレーザーフラッシュ光分解により、その一部に高濃度のヒドロキシルラジカルを生成する。これらのヒドロキシルラジカルは、非常に反応性と短命であり、FPOP条件²の下でおよそマイクロ秒のタイムスケールで消費される。これらのヒドロキシルラジカルは、水を介して拡散し、一般に高速(〜106^M-1 s^{6 -1)}から拡散制御³に至るまで、運動速度で溶液中の様々な有機成分を酸化する。ヒドロキシルラジカルがタンパク質表面に遭遇すると、ラジカルはタンパク質表面上のアミノ酸側鎖を酸化し、そのアミノ酸(最も一般的には1つの酸素原子の純加量)の質量シフトを生じる^4。任意のアミノ酸における酸化反応の速度は、そのアミノ酸の固有反応性(側鎖および配列コンテキストに依存する^)4、5,5およびその側鎖の拡散ヒドロキシルラジカルへのアクセス可能性の2つの要因に依存し、これは平均溶媒アクセス可能な表面積^6,77と⁶密接に相関する。グリシンを除くすべての標準的なアミノ酸は、FPOP実験でこれらの反応性の高いヒドロキシルラジカルによって標識されているように観察されています, 大きく異なる収率ではあるが;実際には、Ser、Thr、Asn、およびAlaは、高ラジカル用量の下で、慎重かつ敏感な標的ETDフラグメンテーション^88、99によって同定される以外、ほとんどのサンプルで酸化されると見られることはほとんどありません。酸化後、試料を消光して過酸化水素および二次酸化剤(スーパーオキシド、一酸化酸素、ペプチジルヒドロペルオキシドなど)を除去する。次いで、クエンチされたサンプルをタンパク質分解して酸化ペプチドの混合物を生成し、構造情報は、様々なペプチドの酸化生成物のパターンにおいて化学的「スナップショット」として凍結される(図1)。質量分析(LC-MS)に結合された液体クロマトグラフィーは、そのペプチドの酸化および非酸化バージョンの相対的な強度に基づいて、所定のタンパク質分解ペプチドにおけるアミノ酸の酸化量を測定するために使用されます。異なる立体構造条件下で得られた同じタンパク質のこの酸化足跡を比較することにより(例えば、リガンド結合対リガンドフリー)、タンパク質の所定の領域の酸化量の差は、その領域^66,77の溶媒アクセス可能表面積の違いと直接相関することができる。タンパク質の地形情報を提供する能力は、FPOPタンパク質の高次構造決定のための魅力的な技術を作ります, タンパク質の治療の発見と開発中を含みます^10,,11.

図 1: FPOP の概要タンパク質の表面は、高反応性ヒドロキシルラジカルによって共有結合的に修飾される。ヒドロキシルラジカルは、側鎖の溶媒のアクセス性に強く影響される速度でタンパク質のアミノ酸側鎖と反応する。地形変化(例えば、上に示したリガンドの結合に起因する)は、相互作用の領域におけるアミノ酸をヒドロキシルラジカルと反応することから保護し、LC-MSシグナルにおける修飾ペプチドの強度の低下をもたらす。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

FPOP溶液中に存在する異なる成分(例えば、リガンド、賦形剤、緩衝剤)は、^{過酸化水素}3のレーザー光分解に際して発生するヒドロキシルラジカルに対して異なる清掃活性を有する。同様に、過酸化物濃度、レーザーフルエンス、および緩衝剤組成のわずかな変化は、効果的なラジカル用量を変更し、サンプル間および異なる実験室間でFPOPデータの再生を困難にする可能性があります。したがって、利用可能なヒドロキシルラジカル線量^,を^{、12、13、14、15、16,13}の利用可能なヒドロキシルラジカル線量の1つを用いて、各サンプル中のタンパク質と反応させることができるヒドロキシルラジカル用量^15を16比較できることが重要である。^,14ヒドロキシルラジカル線量計は、ヒドロキシルラジカルのプールのための(そして溶液中のすべてのスカベンジャーと)アナライトと競合することによって作用します。ヒドロキシルラジカルの有効用量は、線量計の酸化量を測定することによって測定される。なお、「有効ヒドロキシルラジカル用量」は、発生したヒドロキシルラジカルの初期濃度とラジカルの半減期の両方の機能である。これら2つのパラメータは、部分的に相互に依存しており、理論運動モデリングはやや複雑になる(図2)。2つのサンプルは、形成されたヒドロキシルラジカルの初期濃度を変更することによって同じ効果的なラジカル用量を維持しながら、最初のラジカル半減期を大きく異なることができる。彼らはまだ同じフットプリント¹⁷を生成します。アデニン¹³およびTris¹²は、酸化のレベルをリアルタイムでUV分光法で測定できるため、効果的なヒドロキシルラジカル用量に問題がある場合に研究者が迅速に特定し、その問題をトラブルシューティングすることができるため、便利なヒドロキシルラジカル線量計です。この問題を解決するためには、リアルタイムでアデニン吸光度変化からの信号を監視できる照射部位の直後にフローシステムに位置するインライン線量計が重要である。これは、ヒドロキシルラジカル清掃能力¹⁷の広く異なるレベルを有するバッファーまたは他の賦形剤でFPOP実験を行うのに役立つ。このラジカル投与量補償はリアルタイムで行うことができるが、有効ラジカル用量を調節することによって同じコンフォーマーに対して統計的に区別できない結果をもたらす。

本プロトコルでは、内部光学ラジカルドシメータとしてアデニンを用いたラジカル投与量補償を用いた典型的なFPOP実験を行うための詳細な手順を有する。この方法により、調査員はリアルタイムで補正を実行することにより、異なる清掃能力を有するFPOP条件全体のフットプリントを比較することができます。

図2:ドシメトリー報酬の運動シミュレーション1 mM アデニン線量計応答は、5 μM リソザイム分析物で 1 mM 初期ヒドロキシルラジカル濃度 (▪OH t_1/2=53 ns)で測定し、対象線量計応答(黒)として設定した。スカベンジャー賦形ヒスチジンの1mMを添加すると、量濃度応答(青色)は比例的にタンパク質酸化量(シアン)と共に減少する。ヒドロキシルラジカルの半減期も減少する(▪OH t_1/2=39ns)。生成されたヒドロキシルラジカルの量が増加すると、スカベンジャー(赤色)の不在時に1mMヒスチルラジカル(赤)で達成した1mMヒスチジンスカベンジャーを用いてサンプル中の酸化された線量計の同等の収量を得るために(▪tOH/29=29)、同様に起こるタンパク質酸化量(マゼンタ)が減少する一方で(tOH_19/ns=29)。=シャープJ.S.、アムファーマセウトRev 22、50-55、2019の許可を得て適応。 22,この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。