L’ossidazione fotochimica rapida delle proteine (FPOP) è una tecnica emergente per la determinazione dei cambiamenti topografici delle proteine mediante modifica covalente ultraveloci della superficie delle proteine esposta al solvente seguita dal rilevamento da parte di LC-MS¹. FPOP genera un’alta concentrazione di radicali idrossili in situ dalla fotolisi laser UV del perossido di idrogeno. Questi radicali idrossili sono molto reattivi e di breve durata, consumati su una scala cronologica di circa un microsecondo in condizioni FPOP². Questi radicali idrossili si diffondono attraverso l’acqua e ossidano vari componenti organici in soluzione a velocità cinetiche generalmente che vanno da veloce (10⁶ M^-1 s^-1) a diffusione controllata³. Quando il radicale idrossile incontra una superficie proteica, il radicale ossiderà le catene laterali degli amminoacidi sulla superficie proteica, con conseguente spostamento di massa di tale aminoacido (più comunemente l’aggiunta netta di un atomo di ossigeno)⁴. Il tasso della reazione di ossidazione a qualsiasi aminoacido dipende da due fattori: la reattività intrinseca di tale aminoacido (che dipende dalla catena laterale e dal contesto di sequenza)⁴,^{5 e}l’accessibilità di tale catena laterale al radicale idrossile di diffusione, che è strettamente correlata alla superficie accessibile del solvente^{medio 6,7}. Tutti gli aminoacidi standard, ad eccezione della glicina, sono stati osservati come etichettati da questi radicali idrossili altamente reattivi negli esperimenti FPOP, anche se a rese ampiamente diverse; in pratica, Ser, Thr, Asn e Ala sono raramente visti come ossidati nella maggior parte dei campioni tranne che sotto alte dosi radicali e identificati da un’attenta e sensibile frammentazione ETD^{mirata 8,9}. Dopo l’ossidazione, i campioni vengono sfociati per rimuovere il perossido di idrogeno e gli ossidanti secondari (superossido, ossigeno singlet, idroperossido di peptidile, ecc.) I campioni spagolati vengono quindi digeriti proteolyticallymente per generare miscele di peptidi ossidati, dove le informazioni strutturali vengono congelate come “istantanea” chimica nei modelli dei prodotti di ossidazione dei vari peptidi (Figura 1). La cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) viene utilizzata per misurare la quantità di ossidazione degli amminoacidi in un dato peptide proteolitico in base alle intensità relative delle versioni ossidizzate e nonidizzate di quel peptide. Confrontando questa impronta ossidativa della stessa proteina ottenuta in diverse condizioni conformazionali (ad esempio, legante-bound contro ligando-free), differenze nella quantità di ossidazione di una determinata regione della proteina possono essere direttamente correlate con le differenze nella superficie accessibile al solvente di quella regione^6,7. La capacità di fornire informazioni topografiche proteiche rende FPOP una tecnologia attraente per la determinazione della struttura di ordine superiore delle proteine, anche nella scoperta terapeutica delle proteine^{e nello sviluppo 10,11}.

Figura 1: Panoramica di FPOP. La superficie della proteina è covallentamente modificata dai radicali idrossili altamente reattivi. I radicali idrossili reagiranno con catene laterali di amminoacidi della proteina ad un tasso fortemente influenzato dall’accessibilità del solvente della catena laterale. I cambiamenti topografici (ad esempio, a causa del legame di un ligando come mostrato sopra) proteggeranno gli aminoacidi nella regione di interazione dalla reazione con i radicali idrossili, con conseguente diminuzione dell’intensità del peptide modificato nel segnale LC-MS. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diversi costituenti presenti nella soluzione FPOP (ad esempio, ligando, escipienti, tamponi) hanno un’attività di scavenging diversa verso i radicali idrossili generati sulla fotolisi laser del perossido di idrogeno³. Allo stesso modo, un piccolo cambiamento nella concentrazione di perossido, nella fluenza laser e nella composizione del buffer può cambiare la dose radicale efficace, rendendo la riproduzione dei dati FPOP impegnativa tra i campioni e tra diversi laboratori. Pertanto, è importante essere in grado di confrontare la dose radicale idrossile disponibile per reagire con proteine in ogni campione utilizzando uno dei diversi dosimetri radicali idrossili^{disponibili 12,13,14,15,16}. I dosimetri radicali idrossili agiscono competendo con l’alyte (e con tutti gli spazzini in soluzione) per la piscina di radicali idrossili; la dose efficace di radicali idrossili viene misurata misurando la quantità di ossidazione del dosimetro. Si noti che “dose efficace idrossile radicale” è una funzione sia della concentrazione iniziale di idrossile radicale generato e l’e half-life del radicale. Questi due parametri sono parzialmente dipendenti l’uno dall’altro, rendendo la modellazione cinetica teorica piuttosto complessa (Figura 2). Due campioni potrebbero avere esigete radicali iniziali molto diverse pur mantenendo la stessa dose radicale efficace modificando la concentrazione iniziale di idrossilo radicale formato; genereranno ancora impronte identiche¹⁷. Adenine¹³ e Tris¹² sono dosmetri radicali idrossili convenienti perché il loro livello di ossidazione può essere misurato dalla spettroscopia UV in tempo reale, consentendo ai ricercatori di identificare rapidamente quando c’è un problema con dose radicale idrossile efficace e di risolvere il loro problema. Per risolvere questo problema, un dosimetro in linea situato nel sistema di flusso direttamente dopo il sito di irradiazione in grado di monitorare il segnale da cambiamenti di assorbimento dell’adenina in tempo reale è importante. Questo aiuta a effettuare esperimenti FPOP in buffer o qualsiasi altro excipient con livelli ampiamente diversi di capacità di scavenging radicale idrossile¹⁷. Questa compensazione radicale dosaggio può essere eseguita in tempo reale, producendo risultati statisticamente indistinguibili per lo stesso conformere regolando la dose radicale efficace.

In questo protocollo, abbiamo procedure dettagliate per l’esecuzione di un tipico esperimento FPOP con compensazione radicale del dosaggio utilizzando l’adenina come dosimetro radicale ottico interno. Questo metodo consente agli investigatori di confrontare le impronte tra condizioni FPOP che hanno capacità di scavenging diverse eseguendo una compensazione in tempo reale.

Figura 2: simulazione cinetica della compensazione basata sulla dosimetria. La risposta di dosimetro dell’adenina da 1 mM è misurata in un alyte di 5 M di lysozyme con una concentrazione iniziale di idrossile radicale di 1 mM (▪OH t_1/2x53 ns) e impostata come risposta dosimetrica target (nero). Con l’aggiunta di 1 mM dell’estito di scavenger, la risposta dosimetro (blu) diminuisce insieme alla quantità di ossidazione proteica in modo proporzionale (ciano). Anche l’emita vita del radicale idrossile diminuisce (▪OH t_1/2–39 ns). Quando la quantità di idrossile radicale generato viene aumentata per dare una resa equivalente di dosimetro ossidato nel campione con scavenger istidina di 1 mM come raggiunto con 1 mM idrossile radicale in assenza di scavenger (rosso), la quantità di ossidazione proteica che si verifica in modo simile diventa identica (magenta), mentre l’idryl radicale half-life diminuisce ancora di più (▪OH t_1/2= Adattato con il permesso di Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.