חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) היא טכניקה מתפתחת לקביעת שינויים טופוגרפיים חלבון על ידי שינוי קוולנטי אולטרה מהיר של שטח הפנים חשוף ממס של חלבונים ואחריו זיהוי על ידי LC-MS¹. FPOP מייצר ריכוז גבוה של רדיקלים הידרוקסיל ב situ על ידי לייזר UV פלאש פוטוליזה של מי חמצן. רדיקלים הידרוקסיל אלה הם מאוד תגובתיים וקצרים, נצרך בערך ציר זמן microsecond בתנאים FPOP². רדיקלים הידרוקסיל אלה לפזר דרך מים וחמצון רכיבים אורגניים שונים בתמיסה בקצבים קינטיים בדרך כלל החל מהיר (~^{10 6} M^-1 s^-1)כדי דיפוזיה^{מבוקרת 3.} כאשר הרדיקלי הידרוקסיל נתקל משטח חלבון, הרדיקלי יהיה חמצון שרשראות צד חומצת אמינו על פני השטח של החלבון, וכתוצאה מכך שינוי המוני של חומצת אמינו (בדרך כלל תוספת נטו של אטום חמצן אחד)^4. קצב תגובת החמצון בכל חומצת אמינו תלוי בשני גורמים: תגובתיות הטבועה של חומצת אמינו זו (התלויה בשרשרת הצדדית ובהקשר הרצף)^{4,,5, ונגישות השרשרת} הצדדית לרדיקל הידרוקסיל המפזר, המתאם באופן הדוק לאזור הממס^{הממוצע הנגיש 6,,7}. כל חומצות אמינו סטנדרטיות למעט גליצין נצפו כפי שכותרתו על ידי רדיקלים הידרוקסיל תגובתיים מאוד אלה בניסויי FPOP, אם כי בתשואות שונות באופן נרחב; בפועל, סר, ת’ר, אסן ועלא נתפסים לעתים נדירות כחמצון ברוב הדגימות למעט במינונים קיצוניים גבוהים ומזדהים על ידי פיצול ETD ממוקד זהיר^{ורגיש 8,9}. לאחר חמצון, דגימות מרווה כדי להסיר מי חמצן וחמצון משני (superoxide, חמצן singlet, הידרופרוקסיד פפטידיל, וכו ‘) הדגימות המיוות מתעכלות לאחר מכן כדי ליצור תערובות של פפטידים מחומצנים, כאשר המידע המבני מוקפא כ”תצלום בזק” כימי בתבניות של מוצרי חמצון של הפפטידיםהשונים (איור 1). כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריה מסה (LC-MS) משמש כדי למדוד את כמות חמצון של חומצות אמינו בפפטיד פרוטאוליטי נתון בהתבסס על העוצמות היחסיות של גירסאות מחומצנות ולא חמצון של פפטיד זה. על ידי השוואת טביעת הרגל החמצונית של אותו חלבון המתקבל בתנאים קונפורמיים שונים (למשל, ליגנד-bound לעומת ליגנד חינם), הבדלים בכמות החמצון של אזור נתון של החלבון יכול להיות מתואם ישירות עם הבדלים באזור פני השטח נגיש ממס של^{אזור זה 6,7}. היכולת לספק מידע טופוגרפי חלבון הופך FPOP טכנולוגיה אטרקטיבית לקביעת מבנה בסדר גבוה יותר של חלבונים, כולל גילוי טיפולי^{חלבון ופיתוח 10,11}.

איור 1: מבט כולל על FPOP. פני השטח של החלבון משתנים באופן קוולנטי על ידי רדיקלים הידרוקסיל תגובתיים מאוד. הרדיקלים הידרוקסיל יגיבו עם שרשראות צד חומצת אמינו של החלבון בקצב כי הוא מושפע מאוד על ידי הנגישות ממס של השרשרת הצדדית. שינויים טופוגרפיים (לדוגמה, בשל הכריכה של ליגנד כפי שהראה לעיל) יגנו על חומצות אמינו באזור של אינטראקציה מתן תגובה עם רדיקלים הידרוקסיל, וכתוצאה מכך ירידה בעוצמה של פפטיד שונה באות LC-MS. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

מרכיבים שונים הנוכחים בתמיסת FPOP (למשל, ליגנדים, excipients, מאגרים) יש פעילות טיהור שונה כלפי רדיקלים hydroxyl שנוצר על פוטו-ליזה לייזר של מי^{חמצן 3}. באופן דומה, שינוי קטן בריכוז מי חמצן, פלור לייזר, והרכב מאגר עשוי לשנות את המינון הרדיקלי היעיל, מה שהופך את הרבייה של נתוני FPOP מאתגר על פני הדגימות ובין מעבדות שונות. לכן, חשוב להיות מסוגל להשוות את המינון הרדיקלי hydroxyl זמין להגיב עם חלבון בכל מדגם באמצעות אחד מכמה dosimeters רדיקלי^{הידרוקסיל זמין 12,,13,,14,,15,16}. הידרוקסיל רדיקל dosimeters לפעול על ידי מתחרה עם analyte (ועם כל אוכלי הנבלות בתמיסה) עבור הבריכה של רדיקלים הידרוקסיל; המינון היעיל של רדיקלים הידרוקסיל נמדד על ידי מדידת כמות חמצון של הדוסימטר. שים לב כי “מינון רדיקלי הידרוקסיל יעיל” היא פונקציה של הריכוז הראשוני של הידרוקסיל רדיקלי שנוצר ואת מחצית החיים של הרדיקלי. שני פרמטרים אלה תלויים זה בזה חלקית, מה שהופך את המודל הקינטי התיאורטי למורכב במקצת(איור 2). שתי דגימות יכול להיות שונה בפראות רדיקלי ים מחצית חיים תוך שמירה על אותו מינון רדיקלי יעיל על ידי שינוי הריכוז הראשוני של הידרוקסיל רדיקלי נוצר; הם עדיין ייצרו עקבות זהות^17. Adenine¹³ ו Tris^{12 הם נוח} הידרוקסיל רדיקלי dosimeters כי רמת חמצון שלהם ניתן למדוד על ידי ספקטרוסקופיה UV בזמן אמת, המאפשר לחוקרים לזהות במהירות כאשר יש בעיה עם מינון רדיקלי הידרוקסיל יעיל כדי לפתור את הבעיה שלהם. כדי לפתור בעיה זו, dosimeter מוטבע הממוקם במערכת הזרימה מיד לאחר האתר של הקרן שיכול לפקח על האות משינויים בספיגת אדנין בזמן אמת חשוב. זה עוזר בביצוע ניסויים FPOP במאגרים או כל excipient אחר עם רמות שונות באופן נרחב של הידרוקסיל רדיקלי קיבולת^{ניבים 17}. פיצוי מינון רדיקלי זה יכול להתבצע בזמן אמת, מניב תוצאות סטטיסטיות לא שונות עבור אותו conformer על ידי התאמת המינון הרדיקלי היעיל.

בפרוטוקול זה, יש לנו הליכים מפורטים לביצוע ניסוי FPOP טיפוסי עם פיצוי מינון רדיקלי באמצעות אדנין כמו מינון רדיקלי אופטי פנימי. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להשוות עקבות בין תנאי FPOP בעלי יכולת נקה שונה על-ידי ביצוע פיצוי בזמן אמת.

איור 2: סימולציה קינטית של פיצוי מבוסס ניסיון. 1 mM אדנין דוסימטר תגובה נמדדת 5 μM ליזוזים analyte עם 1 mM ריכוז רדיקלי הידרוקסיל ראשוני (▪OH t_1/2=53 ns), ולהגדיר כתגובה דוסימטר היעד (שחור). עם תוספת של 1 מ”מ של היסטדין אוכלי נבלות, תגובת הדוסימטר (כחול) פוחתת יחד עם כמות חמצון חלבון באופן פרופורציונלי (ציאן). גם מחצית החיים של הרדיקלי הידרוקסיל פוחתת (▪OH t_1/2=39 ns). כאשר כמות הידרוקסיל רדיקלי שנוצר גדל כדי לתת תשואה שווה ערך של דוזימטר מחומצן בדגימה עם 1 mM היסטידין אוכל נבלות כפי שהושג עם 1 mM הידרוקסיל רדיקלי בהיעדר s נבלות (אדום), כמות חמצון חלבון המתרחשת באופן דומה הופך זהה (מג’טנטה), בעוד המחצית חיים רדיקלי hydroxyl פוחתת עוד יותר (▪OH t_1/2=29 ns). מותאם באישור שארפ J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.