Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) is een opkomende techniek voor de bepaling van eiwittopografische veranderingen door ultrasnelle covalente modificatie van het oplosmiddel blootgestelde oppervlak van eiwitten, gevolgd door detectie door LC-MS^1. FPOP genereert een hoge concentratie hydroxylradicalen in situ door UV-laserflitsfotolyse van waterstofperoxide. Deze hydroxyl radicalen zijn zeer reactief en van korte duur, verbruikt op ongeveer een microseconde tijdschaal onder FPOP voorwaarden². Deze hydroxylradicalen verspreiden zich door water en oxideren verschillende organische componenten in oplossing tegen kinetische snelheden die over het algemeen variëren van snel (~10⁶ M^-1 s^-1) tot diffusiegecontroleerde³. Wanneer de hydroxylradical een eiwitoppervlak tegenkomt, oxideert de radicaal de aminozuurzijketens op het eiwitoppervlak, wat resulteert in een massaverschuiving van dat aminozuur (meestal de netto toevoeging van één zuurstofatoom)⁴. De snelheid van de oxidatiereactie bij elk aminozuur hangt af van twee factoren: de inherente reactiviteit van dat aminozuur (dat afhankelijk is van de zijketen en de volgordecontext)^4,5 en de toegankelijkheid van die zijketen aan de diffuserende hydroxylradica, die nauw correleert met het gemiddelde oplosmiddel toegankelijk oppervlak^6,7. Alle standaard aminozuren, behalve glycine, zijn waargenomen zoals gelabeld door deze zeer reactieve hydroxylradicalen in FPOP-experimenten, zij het bij zeer uiteenlopende opbrengsten; in de praktijk worden Ser, Thr, Asn en Ala zelden gezien als geoxideerd in de meeste monsters, behalve onder hoge radicale doses en geïdentificeerd door zorgvuldige en gevoelige gerichte ETD fragmentatie^8,9. Na oxidatie worden monsters gedoofd om waterstofperoxide en secundaire oxidanten (superoxide, singlet oxygen, peptidylhydrperoxiden, enz.) te verwijderen De gedoofde monsters worden vervolgens proteolytisch verteerd om mengsels van geoxideerde peptiden te genereren, waarbij de structurele informatie wordt bevroren als een chemische “momentopname” in de patronen van oxidatieproducten van de verschillende peptiden(figuur 1). Vloeibare chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) wordt gebruikt om de hoeveelheid oxidatie van aminozuren in een bepaald proteolytisch peptide te meten op basis van de relatieve intensiteiten van de geoxideerde en niet-geoxideerde versies van dat peptide. Door deze oxidatieve voetafdruk van hetzelfde eiwit te vergelijken die onder verschillende conformatieomstandigheden wordt verkregen (bijvoorbeeld ligand-gebonden versus ligand-vrij), kunnen verschillen in de mate van oxidatie van een bepaald eiwitgebied direct worden gecorreleerd met verschillen in het oplosmiddel-toegankelijke oppervlakte van dat gebied^6,7. De mogelijkheid om eiwittopografische informatie te verstrekken maakt FPOP een aantrekkelijke technologie voor de hogere orde structuur bepaling van eiwitten, ook in eiwit therapeutische ontdekking en ontwikkeling^10,11.

Figuur 1: Overzicht van FPOP. Het oppervlak van het eiwit wordt covalent gewijzigd door zeer reactieve hydroxylradicalen. De hydroxylradicalen zullen reageren met aminozuurzijketens van het eiwit in een tempo dat sterk wordt beïnvloed door de oplosmiddel toegankelijkheid van de zijketen. Topografische veranderingen (bijvoorbeeld als gevolg van de binding van een ligand zoals hierboven afgebeeld) zullen aminozuren in het interactiegebied beschermen tegen reageren met hydroxylradicalen, wat resulteert in een afname van de intensiteit van gemodificeerd peptide in het LC-MS-signaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Verschillende bestanddelen die aanwezig zijn in de FPOP-oplossing (bijvoorbeeld liganden, excipiënten, buffers) hebben verschillende opruimingsactiviteit naar de hydroxylradicalen gegenereerd op de laserfotolyse van waterstofperoxide³. Op dezelfde manier kan een kleine verandering in peroxideconcentratie, laserfluence en buffersamenstelling de effectieve radicale dosis veranderen, waardoor de reproductie van FPOP-gegevens uitdagend is voor de monsters en tussen verschillende laboratoria. Daarom is het belangrijk om de hydroxylradicale dosis die beschikbaar is om te reageren met eiwitten in elk monster te kunnen vergelijken met een van de verschillende beschikbare hydroxylradicale dosimeters^{12,13,14,15,16}. Hydroxyl radicale dosimeters handelen door te concurreren met de analyt (en met alle aaseters in oplossing) voor de pool van hydroxyl radicalen; de effectieve dosis hydroxylradicalen wordt gemeten door de hoeveelheid oxidatie van de dosimeter te meten. Merk op dat “effectieve hydroxyl radicale dosis” is een functie van zowel de initiële concentratie van hydroxyl radicaal gegenereerd en de halftijds van de radicale. Deze twee parameters zijn gedeeltelijk afhankelijk van elkaar, waardoor de theoretische kinetische modellering enigszins complex is (figuur 2). Twee monsters zouden een wild verschillende initiële halflevenshelft kunnen hebben, terwijl ze nog steeds dezelfde effectieve radicale dosis behouden door de initiële concentratie hydroxylradicalen te veranderen; ze zullen nog steeds identieke voetafdrukken genereren¹⁷. Adenine¹³ en Tris¹² zijn handige hydroxyl radicale dosimeters omdat hun niveau van oxidatie kan worden gemeten door UV-spectroscopie in real-time, waardoor onderzoekers snel te identificeren wanneer er een probleem is met effectieve hydroxyl radicale dosis en om hun probleem op te lossen. Om dit probleem op te lossen, is een inline dosimeter die zich direct na de plaats van bestraling in het stroomsysteem bevindt die het signaal van adenine-absorptieveranderingen in real-time kan controleren, belangrijk. Dit helpt bij het uitvoeren van FPOP experimenten in buffers of een andere excipiënt met zeer uiteenlopende niveaus van hydroxyl radicale opruimcapaciteit¹⁷. Deze radicale dosering compensatie kan worden uitgevoerd in real-time, waardoor statistisch niet te onderscheiden resultaten voor dezelfde conformer door het aanpassen van de effectieve radicale dosis.

In dit protocol hebben we gedetailleerde procedures voor het uitvoeren van een typisch FPOP-experiment met radicale doseringscompensatie met adenine als interne optische radicale dosimeter. Met deze methode kunnen onderzoekers voetafdrukken vergelijken tussen FPOP-omstandigheden die verschillende opruimcapaciteit hebben door compensatie in real-time uit te voeren.

Figuur 2: Kinetische simulatie van op dosimetrie gebaseerde compensatie. 1 mM adenine dosimeter respons wordt gemeten in 5 μM lysozyme analyt met een 1 mM initiële hydroxyl radicale concentratie (▪OH t_1/2=53 ns), en ingesteld als een doel dosimeter respons (zwart). Na de toevoeging van 1 mM van de aasgier excipiënt histidine, de dosimeter respons (blauw) afneemt samen met de hoeveelheid eiwit oxidatie op een evenredige manier (cyaan). De halftijd van de hydroxylradicalen neemt ook af (▪OH t_1/2=39 ns). Wanneer de hoeveelheid hydroxylradical gegenereerde wordt verhoogd om een gelijkwaardige opbrengst van geoxideerde dosimeter in het monster te geven met 1 mM histidine-aasgier zoals bereikt met 1 mM hydroxylradical bij afwezigheid van aaseters (rood), wordt de hoeveelheid eiwitoxidatie die op dezelfde manier optreedt identiek (magenta), terwijl de hydroxylradicale halfwaardetijd nog verder afneemt (▪OH t_1/2=29 ns). Aangepast met toestemming van Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.