Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) er en ny teknik til bestemmelse af proteintopografiske ændringer ved ultrahurtig kovaent ændring af proteiners opløsningsmiddeludsynlige overfladeareal efterfulgt af påvisning af LC-MS¹. FPOP genererer en høj koncentration af hydroxyl radikaler in situ ved UV laser flash fotolyse af hydrogenperoxid. Disse hydroxyl radikaler er meget reaktive og kortvarig, forbruges på nogenlunde en microsecond tidsskala under FPOP betingelser². Disse hydroxyl radikaler diffus gennem vand og oxidere forskellige organiske komponenter i opløsning ved kinetiske satser generelt spænder fra hurtig (~ 10⁶ M^-1 s^-1) til diffusion-kontrollerede³. Når hydroxyl radikal støder på et protein overflade, den radikale vil oxidere aminosyren sidekæder på proteinoverfladen, hvilket resulterer i en masse skift af denne aminosyre (oftest netto tilsætning af en ilt atom)⁴. Oxidationsreaktionen ved enhver aminosyre afhænger af to faktorer: den iboende reaktivitet af denne aminosyre (som afhænger af sidekæden og sekvenskonteksten)^4,5 og^{tilgængeligheden} af denne sidekæde til den spredende hydroxylrifrielle, som korrelerer tæt til det gennemsnitlige opløsningsmiddel, der er tilgængeligt^{overfladeareal6},⁷. Alle standard aminosyrer undtagen glycin er blevet observeret som mærket af disse meget reaktive hydroxyl radikaler i FPOP eksperimenter, om end ved vidt forskellige udbytter; i praksis ses Ser, Thr, Asn og Ala sjældent som oxideret i de fleste prøver undtagen under høje radikale doser og identificeres ved omhyggelig og følsom målrettet MÅLRETTET ETD-fragmentering^8,9. Efter oxidation slukkes prøverne for at fjerne hydrogenperoxid og sekundære oxidanter (superoxid, singlet oxygen, peptidylhydroxider osv.) De slukkete prøver fordøjes derefter proteolytisk for at generere blandinger af oxiderede peptider, hvor de strukturelle oplysninger fryses som et kemisk “øjebliksbillede” i mønstrene for oxidationsprodukter af de forskellige peptider (figur 1). Flydende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) anvendes til at måle mængden af oxidation af aminosyrer i et givet proteolytisk peptid baseret på de relative intensiteter af de oxiderede og ikke-oxiderede versioner af det pågældende peptid. Ved at sammenligne dette oxidative fodaftryk af det samme protein, der er fremstillet under forskellige konformationsforhold (f.eks. ligandbundet versus ligandfri), kan forskelle i mængden af oxidation af et givet område af proteinet korreleres direkte med forskelle i det opløsningsmiddeltilgængelige overfladeareal i den pågældende region^6,7. Evnen til at give protein topografisk information gør FPOP en attraktiv teknologi til højere orden struktur bestemmelse af proteiner, herunder i protein terapeutisk opdagelse og udvikling^10,11.

Figur 1: Oversigt over FPOP. Overfladen af proteinet er kovalent modificeret af meget reaktive hydroxyl radikaler. Hydroxyl radikaler vil reagere med aminosyre sidekæder af proteinet med en hastighed, der er stærkt påvirket af opløsningsmiddel tilgængelighed af sidekæden. Topografiske ændringer (f.eks. på grund af bindingen af en ligand som vist ovenfor) vil beskytte aminosyrer i interaktionsregionen mod at reagere med hydroxyl radikaler, hvilket resulterer i et fald i intensiteten af modificeret peptid i LC-MS signal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Forskellige bestanddele, der findes i FPOP-opløsningen (f.eks. ligander, hjælpestoffer, buffere), har forskellige skylleaktivitet i forhold til hydroxyldriberne, der genereres på laserfotolyse af hydrogenperoxid³. Tilsvarende kan en lille ændring i peroxid koncentration, laser fluence, og buffer sammensætning ændre den effektive radikale dosis, hvilket gør reproduktion af FPOP data udfordrende på tværs af prøverne og mellem forskellige laboratorier. Det er derfor vigtigt at kunne sammenligne den hydroxylriske dosis, der er til^rådighed,til at reagere med protein i hver prøve ved hjælp af et af flere tilgængelige hydroxylrekromiske dosimeterer^12,13,14,^15,16. Hydroxyl radikale dosimetre handle ved at konkurrere med analysand (og med alle skyllevæsker i opløsning) for puljen af hydroxyl radikaler; den effektive dosis af hydroxyl radikaler måles ved at måle mængden af oxidation af dosimeteret. Bemærk, at “effektiv hydroxyl radikal dosis” er en funktion af både den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale genereret og halveringstid af den radikale. Disse to parametre er delvist afhængige af hinanden, hvilket gør den teoretiske kinetiske modellering noget kompleks (figur 2). To prøver kunne have vildt forskellige indledende radikale halveringsliv og samtidig opretholde den samme effektive radikale dosis ved at ændre den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale dannet; de vil stadig generere identiske fodspor¹⁷. Adenin¹³ og Tris¹² er praktisk hydroxyl radikale dosimeterer, fordi deres niveau af oxidation kan måles ved UV spektroskopi i realtid, giver mulighed for forskere til hurtigt at identificere, når der er et problem med effektiv hydroxyl radikal dosis og til fejlfinding af deres problem. For at løse dette problem er et inline dosimeter placeret i flowsystemet umiddelbart efter bestrålingsstedet, der kan overvåge signalet fra adeninabsorbanceændringer i realtid, vigtigt. Dette hjælper med at udføre FPOP-forsøg i buffere eller andre hjælpestoffer med vidt forskellige niveauer af hydroxylremmelig skyllekapacitet¹⁷. Denne radikale dosering kompensation kan udføres i realtid, giver statistisk skelnes resultater for den samme konforme ved at justere den effektive radikale dosis.

I denne protokol, Vi har detaljerede procedurer for at udføre en typisk FPOP eksperiment med radikale dosering kompensation ved hjælp af adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Denne metode gør det muligt for efterforskere at sammenligne fodspor på tværs af FPOP-forhold, der har forskellige skyllekapacitet ved at udføre kompensation i realtid.

Figur 2: Kinetisk simulering af dosimetribaseret kompensation. 1 mM adenin dosimeter respons måles i 5 μM lysozym analysand med en 1 mM indledende hydroxyl radikal koncentration (▪OH t_1/2=53 ns), og indstilles som et mål dosimeter respons (sort). Ved tilsætning af 1 mM af scavenger excipient histidin, dosimeter respons (blå) falder sammen med mængden af protein oxidation i en proportional måde (cyan). Halveringstiden for hydroxyl radikalen falder også (▪OH t_1/2=39 ns). Når mængden af hydroxyl radikal genereret øges for at give et tilsvarende udbytte af oxideret dosimeter i prøven med 1 mM histidine skyllevæske som opnået med 1 mM hydroxyl radikal i mangel af sca (rød), mængden af proteinoxidation, der opstår på samme måde bliver identisk (magenta), mens hydroxyl radikale halveringstid falder endnu mere (▪OH t_{1 / 2}=29 ns). Tilpasset med tilladelse fra Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Klik her for at se en større version af dette tal.