蛋白质的快速光化学氧化（FPOP）是一种新兴的技术，通过超快速共价修饰蛋白质的溶剂暴露表面积，然后通过LC-MS¹检测，确定蛋白质地形变化。FPOP通过紫外线激光闪光光解过氧化氢，在原位产生高浓度的羟基基。这些羟基基是非常反应和短寿命，消耗约一微秒的时间尺度在FPOP条件^2。这些羟基基通过水扩散，以动力学速率氧化溶液中的各种有机成分，通常从快速（+10^{6 M-1 s-1）}到扩散控制^3。当羟基基遇到蛋白质表面时，该基会氧化蛋白质表面的氨基酸侧链，导致该氨基酸（最常见的是净添加一个氧原子）^的质量转移4。任何氨基酸的氧化反应速率取决于两个因素：该氨基酸的固有反应性（取决于侧链和序列上下文^{）4、5,以及}该侧链与扩散羟基基的可访问性，这与平均溶剂可访问表面积^{6、7,密切相关}。除甘氨酸外，所有标准氨基酸在FPOP实验中被这些高活性羟基基所观察到，尽管产量差别很大;在实践中，Ser，Thr，Asn和Ala很少在大多数样品中被视为氧化，除了在高基剂量下，并经仔细和敏感的针对性ETD碎片^8，9,识别。氧化后，对样品进行淬火，以去除过氧化氢和二次氧化剂（超氧化物、单氧、过氧化氢等）然后对淬火样品进行蛋白质化消化，产生氧化肽的混合物，其中结构信息作为化学”快照”冻结在各种肽的氧化产物的形态中（图1）。与质谱法 （LC-MS） 耦合的液相色谱用于测量给定蛋白糖解肽中氨基酸的氧化量，该肽的氧化和未氧化版本的相对强度。通过比较在不同构象条件下获得的相同蛋白质的氧化足迹（例如，配体结合与无配体），蛋白质给定区域的氧化量差异可与该区域^6、7,的溶剂可访问表面积的差异^直接相关。提供蛋白质地形信息的能力使FPOP成为蛋白质高阶结构测定的有吸引力的技术，包括在蛋白质治疗发现和开发^{10，11。10,}

图1：FPOP概述。蛋白质的表面由高活性羟基基共价修饰。羟基基会以受侧链溶剂可访问性强烈影响的速率与蛋白质的氨基酸侧链发生反应。地形变化（例如，由于上文所示配体结合）将保护相互作用区域的氨基酸，防止与羟基基发生反应，从而降低LC-MS信号中改性肽的强度。 请单击此处查看此图的较大版本。

FPOP溶液中存在的不同成分（例如配体、辅料、缓冲液）对过氧化氢3激光光解产生的羟基基具有不同的清除^活性。同样，过氧化物浓度、激光流量和缓冲成分的一个小变化可能会改变有效的基剂量，使FPOP数据的复制在样品之间和不同实验室之间具有挑战性。因此，重要的是能够比较羟基基剂量可用于与蛋白质在每个样品使用几个可用的羟基基剂量^{计之一12，13，14，15，16。,13,14,15,16}羟基基剂量计通过与羟基基池中的分析剂（以及溶液中的所有清除剂）竞争来表现;通过测量剂量计的氧化量来测量羟基基的有效剂量。请注意，”有效的羟基基剂量”是羟基基的初始浓度和基的半寿命的函数。这两个参数部分相互依赖，使得理论动力学建模有些复杂（图2）。两个样本可能具有完全不同的初始激进半生命，同时仍然保持相同的有效基剂量，通过改变形成羟基基的初始浓度;它们仍然会产生相同的足迹^17。腺素¹³和Tris¹²是方便的羟基基剂量计，因为它们的氧化水平可以通过紫外线光谱测量实时，使研究人员能够快速识别何时存在有效的羟基基剂量问题，并解决他们的问题。为了解决这个问题，一个直联剂量计位于流系统直接后，辐照站点，可以监测信号从腺素吸收变化实时是重要的。这有助于在缓冲液或任何其他辅料中进行FPOP实验，其羟基基清除能力^{水平差异很大17。}这种基量补偿可以实时进行，通过调整有效基剂量，为同一顺从者产生统计上无法区分的结果。

在该协议中，我们有详细的程序，以使用腺宁作为内部光学基剂量计进行典型的FPOP实验，采用激进剂量补偿。此方法允许调查人员通过实时执行补偿来比较具有不同清理容量的 FPOP 条件下的足迹。

图2：基于剂量的补偿的动力学模拟。1 mM 腺苷剂量计响应以 5 μM 解酶分析素测量，初始羟基基浓度为 1 mM（▪OH t_1/2=53 ns），并设定为目标剂量计响应（黑色）。在添加 1 mM 的清道夫辅料组蛋白时，剂量计响应（蓝色）会随着蛋白质氧化量的比例（青色）而降低。羟基基的半寿命也会降低（▪OH t_1/2=39 ns）。当产生的羟基基量增加，以在样品中给予与1 mM组蛋白清除剂相当的氧化剂量，在没有清道夫（红色）的情况下，用1 mM羟基基达到，发生类似的蛋白质氧化量（品红色），而羟基半寿命进一步降低（▪OH t_1/2=29 ns）。改编自夏普J.S.，Am Pharmaceut Rev 22， 50-55， 2019. 请单击此处查看此图的较大版本。