JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

تمكين التعويض في الوقت الحقيقي في الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة من البروتينات لتحديد التغيرات في تضاريس البروتين

Published: September 01, 2020
doi:
10.3791/61580
,
1Department of Biomolecular Sciences,University of Mississippi, 2Department of Chemistry and Biochemistry,University of Mississippi, 3GenNext Technologies, Inc.

Summary

أكسدة سريعة للبروتينات الضوئية هي تقنية ناشئة للتوصيف الهيكلي للبروتينات. مختلف المذيبات المضافة و ligands تختلف خصائص الهيدروكسيل الراديكالية الكسح. لمقارنة بنية البروتين في ظروف مختلفة، مطلوب التعويض في الوقت الحقيقي من الجذور الهيدروكسيل ولدت في رد الفعل لتطبيع ظروف رد الفعل.

Abstract

التأكسد الكيميائي الضوئي السريع للبروتينات (FPOP) هو تقنية بيولوجيا هيكلية تعتمد على القياس الطيفي الكتلي الذي يسبر مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من البروتينات. تعتمد هذه التقنية على رد فعل سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية مع الجذور الهيدروكسيلية تنتشر بحرية في الحل. FPOP يولد هذه الجذور في الموقع عن طريق التحليل الضوئي بالليزر من بيروكسيد الهيدروجين، وخلق انفجار من الجذور الهيدروكسيل التي تستنفد على ترتيب ميكروثانية. عندما تتفاعل هذه الجذور الهيدروكسيل مع سلسلة جانبية من الأحماض الأمينية التي يمكن الوصول إليها من المذيبات ، فإن منتجات التفاعل تظهر تحولًا جماعيًا يمكن قياسه وتحديده كمًا بواسطة قياس الطيف الكتلي. وبما أن معدل رد فعل الأحماض الأمينية يعتمد جزئياً على متوسط سطح المذيبات التي يمكن الوصول إليها من تلك الأحماض الأمينية، فإن التغيرات المقاسة في كمية أكسدة منطقة معينة من البروتين يمكن أن ترتبط بشكل مباشر بالتغيرات في إمكانية الوصول إلى المذيبات في تلك المنطقة بين التشكلات المختلفة (على سبيل المثال، اللتيند المقيد مقابل الليغاند الحر، والمونمر مقابل التجميع، إلخ.) وقد طبقت FPOP في عدد من المشاكل في علم الأحياء، بما في ذلك التفاعلات البروتين البروتين، والتغيرات البروتين التشكلية، والبروتين liga.1. كما أن التركيز المتاح من الجذور الهيدروكسيل يختلف استناداً إلى العديد من الظروف التجريبية في تجربة FPOP، من المهم رصد الجرعة الجذرية الفعالة التي يتعرض لها تحليل البروتين. ويتحقق هذا الرصد بكفاءة من خلال دمج مقياس الجرعات مضمنة لقياس إشارة من تفاعل FPOP، مع فلونس الليزر تعديلها في الوقت الحقيقي لتحقيق المبلغ المطلوب من الأكسدة. مع هذا التعويض، يمكن تحديد التغيرات في تضاريس البروتين التي تعكس التغيرات التكونية، والأسطح ملزمة ليغاند، و/ أو التفاعل البروتين البروتيني واجهات التفاعل في عينات غير متجانسة باستخدام كميات عينة منخفضة نسبيا.

Introduction

الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) هي تقنية ناشئة لتحديد التغيرات الطوبوغرافية البروتينية عن طريق تعديل فائق السرعة في منطقة السطح المكشوفة للمذيبات من البروتينات متبوعاً بالكشف عن البروتينات LC-MS1. FPOP يولد تركيز عال من الجذور الهيدروكسيل في الموقع بواسطة الليزر الأشعة فوق البنفسجية فلاش ضوء بيروكسيد الهيدروجين. هذه الجذور الهيدروكسيل هي رد الفعل جدا وقصيرة الأجل، تستهلك على مقياس زمني تقريبا ميكرو ثانية في ظل ظروف FPOP2. هذه الجذور الهيدروكسيل تنتشر من خلال المياه وأكسدة مختلف المكونات العضوية في حل بمعدلات حركية تتراوح عموما من سريع (~6 6 M-1 S-1)لنشر التي تسيطر عليها3. عندما الهيدروكسيل الراديكالية لقاءات سطح البروتين، فإن الراديكالية تتأكسد سلاسل جانبية الأحماض الأمينية على سطح البروتين، مما أدى إلى تحول كتلة من أن الأحماض الأمينية (الأكثر شيوعاً الجمع الصافي لذرة أكسجين واحدة)4. يعتمد معدل تفاعل الأكسدة في أي حمض أميني على عاملين: التفاعل المتأصل في تلك الأحماض الأمينية (التي تعتمد على السلسلة الجانبية والسياق التسلسلي)4،5 وإمكانية الوصول إلى تلك السلسلة الجانبية إلى جذر الهيدروكسيل الناشر ، الذي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بمتوسط مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من المذيبات6،7. وقد لوحظ كل من الأحماض الأمينية القياسية باستثناء الجليسين كما وصفت هذه الجذور الهيدروكسيل عالية التفاعل في التجارب FPOP, وإن كان في غلة مختلفة على نطاق واسع; في الممارسة العملية، Ser، Thr، Asn، وعلاء ونادرا ما ينظر إليها على أنها المؤكدة في معظم العينات إلا تحت جرعات متطرفة عالية والتي حددتها دقيق وحساسة ETD التجزئةالمستهدفة 8،9. بعد الأكسدة، يتم إخماد العينات لإزالة بيروكسيد الهيدروجين والمواد تأكسدية ثانوية (أكسيد فائق، أكسجين مفرد، هيدروبيروكسيد البيبتيديل، الخ.) ثم يتم هضم العينات المطفأة بشكل بروتيوليالي لتوليد خليط من الببتيدات المؤكدة ، حيث يتم تجميد المعلومات الهيكلية كـ “لقطة” كيميائية في أنماط منتجات الأكسدة من مختلف الببتيدات(الشكل 1). يستخدم الكروماتوغرافيا السائلة مقرونة إلى القياس الطيفي الشامل (LC-MS) لقياس كمية أكسدة الأحماض الأمينية في الببتيد البروتيني معين استناداً إلى الكثافة النسبية للإصدارات المؤسدة وغير المؤكد من ذلك الببتيد. بمقارنة هذه البصمة التأسدية من نفس البروتين التي تم الحصول عليها في ظل ظروف مختلفة من التشكل (على سبيل المثال، ملزمة بالليغان مقابل ليجوند خالية)، يمكن أن ترتبط الاختلافات في كمية أكسدة منطقة معينة من البروتين بشكل مباشر مع الاختلافات في مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من قبل المذيبات في تلك المنطقة6،7. القدرة على توفير معلومات الطبوغرافية البروتين يجعل FPOP تكنولوجيا جذابة لتحديد هيكل أعلى من أجل البروتينات، بما في ذلك في اكتشاف البروتين العلاجي والتنمية10،11.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على FPOP. يتم تعديل سطح البروتين بشكل مُساهم بواسطة الجذور الهيدروكسيلية شديدة التفاعل. سوف تتفاعل الجذور الهيدروكسيل مع سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية من البروتين بمعدل يتأثر بقوة بإمكانية الوصول إلى المذيبات في السلسلة الجانبية. التغيرات الطبوغرافية (على سبيل المثال، بسبب ربط ليغاند كما هو مبين أعلاه) سوف تحمي الأحماض الأمينية في منطقة التفاعل من التفاعل مع الجذور الهيدروكسيل، مما يؤدي إلى انخفاض في كثافة الببتيد المعدلة في إشارة LC-MS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكونات مختلفة موجودة في حل FPOP (على سبيل المثال، اليغاندات، واسحات، والمخازن) لها نشاط الكسح مختلفة نحو الجذور الهيدروكسيل ولدت على التحليل الضوئي ليزر من بيروكسيد الهيدروجين3. وبالمثل، قد يغير تغير صغير في تركيز البيروكسيد، والفلونة بالليزر، وتكوين المخزن المؤقت الجرعة الجذرية الفعالة، مما يجعل استنساخ بيانات FPOP يشكل تحديا عبر العينات وبين مختبرات مختلفة. ولذلك، فمن المهم أن تكون قادرة على مقارنة جرعة الهيدروكسيل الراديكالية المتاحة للرد مع البروتين في كل عينة باستخدام واحدة من عدة الجرعات الهيدروكسيل الجذر المتاحة12،13،14،15،16. تعمل مقاييس الهيدروكسيل الراديكالية من خلال التنافس مع التحليل (ومع جميع الزبالين في الحل) لتجمع الجذور الهيدروكسيلية؛ يتم قياس الجرعة الفعالة من الجذور الهيدروكسيل عن طريق قياس كمية أكسدة الدوسيمتر. لاحظ أن “الجرعة الجذرية الهيدروكسيل الفعالة” هي وظيفة من كل من التركيز الأولي للهيدروكسيل الراديكالية المتولدة ونصف العمر من الراديكالية. هذه المعلمتين تعتمد جزئيا على بعضها البعض، مما يجعل النمذجة الحركية النظرية معقدة إلى حد ما (الشكل 2). يمكن أن يكون اثنين من العينات مختلفة بعنف جذرية الأولية نصف حياة مع الحفاظ على نفس الجرعة الراديكالية الفعالة عن طريق تغيير التركيز الأولي من الهيدروكسيل الراديكالية التي شكلت; أنها لا تزال تولد آثار أقدام متطابقة17. Adenine13 و Tris12 هي مريحة hydroxyl الجذر دوسيمترات لأن مستوى الأكسدة الخاصة بهم يمكن قياسها عن طريق مطياف الأشعة فوق البنفسجية في الوقت الحقيقي، مما يسمح للباحثين لتحديد بسرعة عندما يكون هناك مشكلة مع جرعة جذرية الهيدروكسيل فعالة واستكشاف مشكلتهم. لحل هذه المشكلة، من المهم وجود مقياس الجرعات المضمن الموجود في نظام التدفق مباشرة بعد موقع التشعيع الذي يمكنه مراقبة الإشارة من تغيرات امتصاص الأدينين في الوقت الفعلي. وهذا يساعد في تنفيذ التجارب FPOP في المخازن المؤقتة أو أي سذر الأخرى مع مستويات مختلفة على نطاق واسع من الهيدروكسيل قدرة الكسحالجذرية 17. ويمكن تنفيذ هذا التعويض الجرعة الجذرية في الوقت الحقيقي, تسفر عن نتائج لا يمكن تحديدها إحصائيا لنفس المطابقة عن طريق تعديل الجرعة الراديكالية الفعالة.

في هذا البروتوكول، لدينا إجراءات مفصلة لتنفيذ تجربة FPOP نموذجية مع تعويض الجرعة الراديكالية باستخدام أدينين كمقياس الجرعات الراديكالية البصرية الداخلية. هذه الطريقة تسمح للمحققين بمقارنة آثار الأقدام عبر ظروف FPOP التي لديها قدرة الكسح المختلفة من خلال أداء التعويض في الوقت الحقيقي.

Figure 2
الشكل 2: محاكاة حركية للتعويض القائم على قياس الجرعات. 1 mM أدينين دوسيميت يتم قياس الاستجابة في 5 μM lysozyme التحليل مع تركيز جذري هيدروكسيل 1 mM الأولي (▪أو تي1/2=53 ن س), وتعيين كاستجابة مقياس الجرعات المستهدفة (أسود). عند إضافة 1 mM من الهستيدين الكاسح الزبال، استجابة مقياس الجرعات (الأزرق) يقلل جنبا إلى جنب مع كمية أكسدة البروتين بطريقة متناسبة (السماوي). وينخفض أيضا نصف عمر جذر الهيدروكسيل (▪OH t1/2=39 ns). عندما يتم زيادة كمية من هيدروكسل جذري ولدت لإعطاء عائد مكافئ من الجرعات المؤسدة في العينة مع 1 mm الهستيدين الكاسح كما يتحقق مع 1 mM هيدروكسل الراديكالية في غياب زبال (الأحمر)، وكمية أكسدة البروتين التي تحدث على نحو مماثل يصبح متطابقة (أرجواني)، في حين أن نصف العمر الراديكالي الهيدروكسيل يقلل أكثر من ذلك (▪OH ر1/2=29 ن). تم تكييفها بإذن من Sharp J.S.، Am Pharmaceut Rev 22، 50-55، 2019. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. إعداد مقاعد البدلاء البصرية والشعيراتية لFPOP تنبيه: أشعة الليزر KrF excimer هي مخاطر قصوى للعين، والضوء المباشر أو المنعك يمكن أن يسبب تلفًا دائمًا للعين. ارتدي دائماً حماية مناسبة للعين، وتجنب وجود أي أجسام عاكسة بالقرب من مسار الحزمة عند الإمكان، واستخدم الضوابط الهندسية لمن?…

Representative Results

مقارنة من البصمة الببتيد سلسلة الثقيلة من adalimumab biosimilar في العازلة الفوسفات وعند تسخينها في 55 درجة مئوية لمدة 1 ح تظهر نتائج مثيرة للاهتمام. يستخدم اختبار t للطالب لتحديد الببتيدات التي تتغير بشكل كبير في هذين الشرطين (p ≤ 0.05). الببتيدات 20-38، 99-125، 215-222، 223-252، 260-278، 376-413، و 414-420 تظهر حماية كبيرة م?…

Discussion

تقنيات التحاليل الطيفية القائمة على الكتلة، بما في ذلك تبادل الهيدروجين الديوتيريوم، الربط الكيميائي، وضع العلامات التكافؤة، وقياس الطيف الكتلي للرذاذ الأصلي وحركة الأيونات قد تزايد بسرعة في شعبيتها بسبب مرونتها وحساسيتها وقدرتها على التعامل مع الخلائط المعقدة. FPOP تفتخر العديد من الم?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن نعترف بتمويل البحوث من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة منحة R43GM125420-010 لدعم التنمية التجارية لجهاز FPOP على مقاعد البدلاء وR01GM127267 لتطوير توحيد ومقاييس بروتوكولات لFPOP عالية الطاقة.

Materials

Adenine Acros Organics 147440250 Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture Edmund Optics 39-905 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder Edmund Optics 53-287 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse Sigma Aldrich C-40 Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser Coherent 1113836 COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT) Promega V3151 DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector GenNext Technologies, Inc. N/A Automated fraction collector
Fused silica capillay Molex 1068150023 Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine Acros Organics 119951000 L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens Edmund Optics 03-668 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile Fisher Scientific A955-1 Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid Fisher Scientific A117-50 Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water Fisher Scientific W6-4 Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer Sigma Aldrich M0164 MES hemisodium salt
Methionine amide Bachem 4000594.0005 H-met-NH2.HCl
Micro V clamp Thor Labs VK250 Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage Edmund Optics 68-638 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum Thermo Scientific 164534 Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench Edmund Optics 56-935 18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System GenNext Technologies, Inc. N/A Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder Edmund Optics 58-979 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic Fisher Scientific BP331-500 Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP330-500 Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe Hamilton 81065 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump KD Scientific 788101 Legato 101 syringe pump
Trap C18 column Thermo Scientific 160454 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris Sigma Aldrich 252859 Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin Promega V5111 Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens Edmund Optics 84-285 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
  2. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  3. Buxton, G. V., Greenstock, C. L., Helman, W. P., Ross, A. B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals (·OH/·O- in Aqueous Solution. Journal of Physical and Chemical Reference Data. 17 (2), 513 (1988).
  4. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification and reactivity of amino acid residues serving as structural probes for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (14), 4549-4555 (2005).
  5. Sharp, J. S., Tomer, K. B. Effects of anion proximity in peptide primary sequence on the rate and mechanism of leucine oxidation. Analytical Chemistry. 78 (14), 4885-4893 (2006).
  6. Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
  7. Xie, B., Sood, A., Woods, R. J., Sharp, J. S. Quantitative protein topography measurements by high resolution hydroxyl radical protein footprinting enable accurate molecular model selection. Scientific Reports. 7 (1), 4552 (2017).
  8. Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
  9. Li, X., et al. Structural analysis of the glycosylated intact HIV-1 gp120-b12 antibody complex using hydroxyl radical protein footprinting. Bioquímica. 56 (7), 957-970 (2017).
  10. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  11. Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-834 (2019).
  12. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic buffer hydroxyl radical dosimetry using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  13. Xie, B., Sharp, J. S. Hydroxyl radical dosimetry for high flux hydroxyl radical protein footprinting applications using a simple optical detection method. Analytical Chemistry. 87 (21), 10719-10723 (2015).
  14. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  15. Niu, B., et al. Incorporation of a reporter peptide in FPOP compensates for adventitious scavengers and permits time-dependent measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (2), 389-392 (2017).
  16. Garcia, N. K., Sreedhara, A., Deperalta, G., Wecksler, A. T. Optimizing hydroxyl radical footprinting analysis of biotherapeutics using internal standard dosimetry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1563-1571 (2020).
  17. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real time normalization of fast photochemical oxidation of proteins experiments by inline adenine radical dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  18. Zhang, B., Cheng, M., Rempel, D., Gross, M. L. Implementing fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) as a footprinting approach to solve diverse problems in structural biology. Methods. 144, 94-103 (2018).
  19. Konermann, L., Stocks, B. B., Czarny, T. Laminar flow effects during laser-induced oxidative labeling for protein structural studies by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (15), 6667-6674 (2010).
  20. Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of protein footprints faster than protein unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
  21. Li, K. S., et al. Hydrogen-Deuterium exchange and hydroxyl radical footprinting for mapping hydrophobic interactions of human bromodomain with a small molecule Inhibitor. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2795-2804 (2019).
  22. Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating biological interactions with in vivo protein footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
  23. Charvatova, O., et al. Quantifying protein interface footprinting by hydroxyl radical oxidation and molecular dynamics simulation: application to galectin-1. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (11), 1692-1705 (2008).
  24. Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Bioquímica. 50 (38), 8117-8126 (2011).
  25. Gau, B. C., Chen, J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing solvent-accessibility changes accompanying protein folding: Data processing and application to barstar. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1230-1238 (2013).
  26. Garrison, W. M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins. Chemical Reviews. 87 (2), 381-398 (1987).
  27. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of sulfur-containing amino acid residues in model peptides: fundamental studies for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (8), 2437-2449 (2005).
  28. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of acidic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 76 (5), 1213-1221 (2004).
  29. Xu, G., Takamoto, K., Chance, M. R. Radiolytic modification of basic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 75 (24), 6995-7007 (2003).
  30. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated hydroxyl radical protein footprinting measures buffer and excipient effects on conformation and aggregation in an adalimumab biosimilar. AAPS Journal. 21 (5), 87 (2019).
  31. Simmons, D. A., Konermann, L. Characterization of transient protein folding intermediates during myoglobin reconstitution by time-resolved electrospray mass spectrometry with on-line isotopic pulse labeling. Bioquímica. 41 (6), 1906-1914 (2002).
  32. Vahidi, S., Konermann, L. Probing the time scale of FPOP (fast photochemical oxidation of proteins): radical reactions extend over tens of milliseconds. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (7), 1156-1164 (2016).
  33. Chance, M. R. Unfolding of apomyoglobin examined by synchrotron footprinting. Biochemical and Biophysical Research Communications. 287 (3), 614-621 (2001).
  34. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  35. Zhang, Y., Rempel, D. L., Zhang, H., Gross, M. L. An improved fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) platform for protein therapeutics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (3), 526-529 (2015).
  36. Cornwell, O., Radford, S. E., Ashcroft, A. E., Ault, J. R. Comparing hydrogen deuterium exchange and fast photochemical oxidation of proteins: a structural characterisation of wild-type and ΔN6 β(2)-microglobulin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (2), 2413-2426 (2018).
  37. Xie, B., Sharp, J. S. Relative Quantification of sites of peptide and protein modification using size exclusion chromatography coupled with electron transfer dissociation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1322-1327 (2016).
  38. Srikanth, R., Wilson, J., Vachet, R. W. Correct identification of oxidized histidine residues using electron-transfer dissociation. Journal of Mass Spectrometry. 44 (5), 755-762 (2009).
  39. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Improved identification and relative quantification of sites of peptide and protein oxidation for hydroxyl radical footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1767-1776 (2013).
  40. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Supercharging by m-NBA Improves ETD-Based Quantification of Hydroxyl Radical Protein Footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (8), 1424-1427 (2015).
  41. Khaje, N. A., Sharp, J. S. Rapid quantification of peptide oxidation isomers from complex mixtures. Analytical Chemistry. 92 (5), 3834-3843 (2020).

Tags

Keywords: Real-time CompensationFast Photochemical OxidationsProtein Topography ChangesProtein ConfirmationProtein InteractionsBuffer CompositionSample PurityProtein ConcentrationDosimetry MethodDrug DevelopmentProtein StructureFPOP Optical BenchLaserInline DosimeterExcimer LaserMotorized StageHydrogen PeroxideFPOP Solution
check_url/pt/61580?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. J. Vis. Exp. (163), e61580, doi:10.3791/61580 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image