JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Acuut nierletselmodel geïnduceerd door Cisplatine bij volwassen zebravissen

Published: May 15, 2021
doi:
10.3791/61575
, , , , , ,
1Department of Immunology,University of São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division,Federal University of São Paulo

Summary

Dit protocol beschrijft de procedures om acute nierschade (AKI) te veroorzaken bij volwassen zebravissen met cisplatine als nefrotoxisch middel. We beschreven de stappen om de reproduceerbaarheid van de techniek te evalueren en twee technieken om respectievelijk ontsteking en celdood in het nierweefsel, flowcytometrie en TUNEL te analyseren.

Abstract

Cisplatine wordt vaak gebruikt als chemotherapie. Hoewel het positieve effecten heeft bij met kanker behandelde personen, kan cisplatine zich gemakkelijk ophopen in de nier vanwege het lage moleculaire gewicht. Een dergelijke accumulatie veroorzaakt de dood van buisvormige cellen en kan de ontwikkeling van acute nierschade (AKI) veroorzaken, die wordt gekenmerkt door een snelle afname van de nierfunctie, weefselschade en infiltratie van immuuncellen. Indien toegediend in specifieke doses kan cisplatine een nuttig hulpmiddel zijn als AKI-inductor in diermodellen. De zebravis is verschenen als een interessant model om de nierfunctie, nierregeneratie en letsel te bestuderen, omdat nierstructuren functionele overeenkomsten met zoogdieren behouden. Volwassen zebravissen geïnjecteerd met cisplatine tonen een verminderde overleving, nierceldood en verhoogde ontstekingsmarkers na 24 uur na injectie (hpi). In dit model kunnen immuuncellen infiltratie en celdood worden beoordeeld door flowcytometrie en TUNEL-test. Dit protocol beschrijft de procedures om AKI bij volwassen zebravissen te induceren door intraperitoneale cisplatine-injectie en demonstreert vervolgens hoe het nierweefsel kan worden verzameld voor flowcytometrieverwerking en celdood TUNEL-test. Deze technieken zullen nuttig zijn om de effecten van cisplatine als nefrotoxisch middel te begrijpen en zullen bijdragen aan de uitbreiding van AKI-modellen bij volwassen zebravissen. Dit model kan ook worden gebruikt om nierregeneratie te bestuderen, in de zoektocht naar verbindingen die nierschade behandelen of voorkomen en om ontstekingen bij AKI te bestuderen. Bovendien zullen de methoden die in dit protocol worden gebruikt de karakterisering van weefselschade en ontsteking verbeteren, die therapeutische doelen zijn in niergerelateerde comorbiditeiten.

Introduction

De nieren zijn verantwoordelijk voor verschillende belangrijke fysiologische functies die homeostase behouden, zoals bloedfiltratie, verwijdering van overtollige residuen en regulering van ionenconcentraties1. Beschadiging van nierweefsel kan leiden tot een heterogene aandoening genaamd Acute Nierinfiltratie (AKI), die klinisch wordt beschreven als een snelle afname van de nierfunctie veroorzaakt door vernietiging en dood van tubulaire epitheelcellen, endotheelcelletsel en leukocyteninfiltratie 2,3. AKI is een aandoening die naar verwachting zal optreden bij 8-16% van de ziekenhuisopnames4, met een hoog sterftecijfer dat varieert van 20 tot 50% op de intensive care (IC)5. Deze kwaal houdt verband met een verhoogd ziekenhuisverblijf en een aanzienlijk gebruik van financiële middelen5. Etiologische factoren omvatten uitdroging, shock, infecties, sepsis, hart- en vaatziekten en nefrotoxische geneesmiddelen6. Nefrotoxiciteit wordt gedefinieerd als een nierletsel veroorzaakt door geneesmiddelen, waardoor effecten als AKI, tubulopathieën en glomerulopathieën7. Nefrotoxiciteit treft tweederde van de IC-patiënten, aangezien ongeveer 20% van de geneesmiddelen die op de IC worden voorgeschreven, als nefrotoxisch8,9worden beschouwd, dit omvat niet-steroïdale ontstekingsremmende geneesmiddelen (NSAID’s), antibiotica zoals vancomycine en aminoglycosides, en chemotherapeutische middelen zoals methotrexaat en cisplatine7. Cisplatine is een van de meest krachtige en meest voorkomende chemotherapiemedicijnen, gebruikt bij de behandeling van solide tumoren, zoals hoofd en nek, testiculaire, eierstok en blaas10. In de nier wordt cisplatine geïnternaliseerd in de proximale convoluted tube (PCT) via de organische kationische transporter 2 (OCT-2) en bindt het in hoge concentraties aan het DNA dat celdoodroutes7,10,11,12triggert . De accumulatie van dit geneesmiddel in de nier draagt bij aan nefrotoxiciteit met de dood en ontsteking13. Deze schadelijke bijwerking beïnvloedt enorm het leven en de prognose van een derde van de kankerpatiënten die een cisplatinebehandeling ondergaan, dus is het noodzakelijk om nieuwe therapieën te onderzoeken die de nefrotoxiciteit kunnen verlagen zonder het dodende effect op kankercellen te verliezen10.

Vanwege dit nefrotoxische effect wordt cisplatine vaak gebruikt als inductor van AKI in experimentele diermodellen, zoals voorwaarts beschreven. Bij knaagdieren werd het eerste AKI-model geïnduceerd door cisplatine gerapporteerd in 197114, maar op dit moment zijn er veel verschillende protocollen ontstaan met behulp van de dosisafhankelijke en cumulatieve effecten van cisplatine15. Daardoor, afhankelijk van de dosering en het aantal toepassingen, kunnen verschillende gradaties van ernst van nierletsel worden geïnduceerd16,17,18,19,20,21. De meest voorkomende methode bestaat uit een intraperitoneale (i.p.) injectie van één dosis cisplatine gevolgd door euthanasie in de volgende dagen. In dit klassieke protocol veroorzaakt een enkele hoge nefrotoxische dosis cisplatine (10-13 mg/kg bij muizen en/of 3-8 mg/kg bij ratten) ernstige histologische veranderingen, zoals verlies van borstelrand en celresten in het buisvormige lumen, een paar dagen na cisplatine-injectie. De ernst van histologische veranderingen is dosisafhankelijk en tekenen van regeneratie worden waargenomen 7 dagen na cisplatine-injectie16,17.

Hoewel knaagdiermodellen goed ingeburgerd zijn, hebben we besloten om te profiteren van de kenmerken van een ander gewerveld lichaam, waarbij we onze studies richten op de zebravis(Danio rerio). Deze vis is uitgebreid gebruikt voor het modelleren van menselijke ziekten, vanwege zijn kleine omvang, externe bevruchting, hoge voortplantingssnelheden, snelle ontwikkeling, transparantie van de embryo’s en larven, lage onderhoudskosten, vergelijkbare anatomie als zoogdieren (met enkele uitzonderingen), hoge weefselregeneratiecapaciteit, sociaal gedrag, 70% van genetische gelijkenis met mensen en 84% met met menselijke ziekten geassocieerde genen22. Streisinger et al.23,24,25 begonnen de studies met zebravissen die de uitvoerbaarheid bevestigden van het gebruik van dit modelorganisme voor de genetische analyse van gewervelde ontwikkeling. In nieronderzoek is de zebravis niet alleen naar voren gekomen in ontwikkelingsstudies, maar ook als een genetisch hulpmiddel bij de zoektocht naar nieuwe genen die verband houden met nieraandoeningen26. Bovendien maken het vermogen van regeneratie zonder littekenvorming en het vermogen om nefronen door hun leven te genereren, neonephrogenese genoemd, de zebravis een belangrijk diermodel voor regeneratieonderzoek27,28. Bovendien toont de beschikbaarheid van experimentele modellen voor verschillende nierziekten, waaronder acute en chronische nierschade, de veelzijdigheid van dit experimentele organisme aan26,29. Net als bij zoogdieren zijn de niergenitors van de zebravis afgeleid van het tussenliggende mesoderm. Dergelijke renale voorlopers genereren de pronephros die zich later zullen ontwikkelen tot de mesonephros, die tot volwassenheid29,30als volwassen orgaan zal worden gehandhaafd .

De volwassen zebravisnier bevindt zich op de dorsale wand van het lichaam, tussen de zwemblaas en de ruggengraat29. Vanuit ventrale weergave kan de zebravis worden gesegmenteerd in drie gebieden (figuur 1A): kop (H), stam (Tr) en staart (Ta)29. Net als zoogdieren heeft de zebravis de nefronen als functionele eenheden van de nier, die zijn onderverdeeld in tubulussegmenten(figuur 1A):renal corpuscle (RC), proximale convoluted tubulus (PCT), proximale rechte tubulus (PST), distaal vroeg (DE), laat distaal (DL) en verzamelkanaal (CD)29. Zebravissen delen genetische conservering en structurele overeenkomsten met menselijke nefronen (figuur 1B) maar missen enkele conformaties zoals de tussentubuli, ook bekend als de lus van Henle (LH)29,31. Zoetwatervissen zoals zebravissen worden normaal gesproken omringd door een medium met een zeer lage osmolariteit, daarom zijn ze meestal hyperosmotisch en zijn ze afhankelijk van de kieuwen, de huid in een vroeg stadium en de nier om de osmolariteit en wateruitscheiding te reguleren32. De filtratie van bloed uit de dorsale aorta door de pronephros begint rond 48 uur na de bevruchting (hpf)33,34. De nier van de zebravis is niet alleen een metabolisch afvaluitscheidingsorgaan, maar werkt ook als een hematopoëtisch orgaan van 4 dagen na de bevruchting (dpf) tot volwassenheid en het is gelijkwaardig aan het beenmerg bij zoogdieren35. Tijdens de ontwikkeling zullen hematopoëtische stamcellen (HSC’s) de nier zaaien, zichzelf renoveren en myeloïde, erythroid- en lymfoïde cellijnen genereren, transcriptiefactoren behouden, moleculen signaleren en sterk geconserveerde genetische programma’s met zoogdieren36,37. Studies hebben aangetoond dat de meeste erythroid, trombocytische, myeloïde en lymfoïde cellen van het menselijk immuunsysteem aanwezig zijn in zebravissen37,38. De unieke kenmerken van dit dier en de behouden kenmerken met de menselijke nier maakten dit modelorganisme voordelig in het onderzoek naar nierfunctie, letsel en regeneratie.

Hoewel de nier van de zebravis goed is bestudeerd en sommige modellen van AKI al beschikbaar zijn in larve en volwassen zebravis28, was er ten tijde van de vaststelling van dit protocol geen bewijs van een chemisch geïnduceerd niet-antibioticum AKI-model bij volwassen zebravissen. Daarnaast richt ons laboratorium zich op het testen van probiotische bacteriën en microbiota-afgeleide verbindingen om regeneratie en nierschade te bestuderen, dus hebben we onze inspanningen geconcentreerd in het creëren van een nieuw cisplatine-geïnduceerd AKI-model bij volwassen vissen. Het videoartikel in dit manuscript toont de procedures voor een nieuw model van AKI-inductie met een i.p. injectie van 120 ug cisplatine per g dier (120 μg/g) (figuur 2A). Deze dosis was aanvankelijk gebaseerd op studies van AKI geïnduceerd door cisplatine in muriene modellen die rond 10 mg/kg (equivalent aan 10 μg/g)14,15,16,17gingen, maar deze dosis was niet voldoende om nierschade in verband met nefrotoxiciteit te veroorzaken (gegevens niet aangetoond). Zo verhoogden we de dosis tot de dosis die in deze studie werd gebruikt (figuur 2B). Ons werk onthulde een dosisafhankelijk effect van cisplatine in overlevingskans na injectie met inductie van nierweefselschade 24 hpi, zoals blijkt uit verlies van buisstructuur, verhoogd inflammatoir infiltreren en een hoog percentage celdood. Hier beschrijven we twee technieken voor het analyseren van de ontwikkeling van cisplatine-geïnduceerde AKI: flowcytometrie, om celinfiltratie te analyseren, en TUNEL, om celdood te meten. Flowcytometrie is een technologie die de fysische (grootte en granulariteit) en chemische (fluorescerende verbindingen) kenmerken van de cellen meet. In de cytometer loopt de celsuspensie door een schedevloeistof die de cellen in één lijn organiseert, waardoor ze één cel tegelijk door een laserstraal kunnen gaan (figuur 3A). Een detector voor de lichtbundel meet de Forward Scatter (FSC), die correleert met de celgrootte, en detectoren aan de zijkant meten de Side Scatter (SSC) die correleert met de granulariteit van de cellen. Andere detectoren meten de fluorescentie van deeltjes, fluorescerende eiwitten of cellen met antilichaamlabel39,40. Aangezien commerciële antilichamen voor zebravissen tegenwoordig schaars zijn, maakt het gebruik van dierenreporters en fluorescerende biomarkers het mogelijk deze analyse te verbeteren en diverse celpopulaties te identificeren41,42,43. Een ander hulpmiddel dat in dit protocol werd gebruikt, was de Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) test. De TUNEL-test is een late apoptosedetectiemethode die gebaseerd is op het vermogen van de TdT om gefragmenteerd DNA te identificeren en te labelen met deoxynucleotiden gelabeld met een fluorescerende marker die later kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd door microscopie44 (Figuur 3B). Gezien het feit dat een van de meest opvallende kenmerken van AKI de inductie van apoptose in buisvormige niercellen3is, is deze techniek uiterst voordelig omdat het kan worden geanalyseerd door flowcytometrie en / of microscopie.

De benaderingen die in dit artikel worden gepresenteerd, maken het mogelijk om de AKI-status te observeren en bieden een nieuw acuut model om AKI-stoornissen te bestuderen die nuttig kunnen zijn voor het onderzoek naar nieuwe therapeutische doelen in cisplatine-gerelateerde AKI.

Protocol

De procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn eerder goedgekeurd om te worden gebruikt in het zebravismodel door de Ethische Commissie voor diergebruik van het Instituut voor Biomedische Wetenschappen van de Universiteit van São Paulo. 1. AKI Inductie door Cisplatine Intraperitoneale Injectie Bereid cisplatine werkoplossing door de stamoplossing te verdunnen tot 850 μg/ml in 0,9% NaCl. Bewaren bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.LET OP: De fabricant raadt aan cisplatine te manipuleren met persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM’ s), waaronder een bril, handschoenen en laboratoriumjas. Bewaar de voorraadoplossing op kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Bereid 150 mg/L MS-222 (Tricaine) verdovingsmiddel voor in systeemwater45. Verdoof volwassen zebravissen (5-9 maanden) door onderdompeling gedurende ongeveer 1-2 minuten.OPMERKING: Effectief verdoofde vissen moeten niet reageren om aan te raken. Om effectieve anesthesie te testen, drukt u voorzichtig op de staartvin om de reactie te observeren.LET OP: Tricaine is irriterend voor de huid en ogen, gebruik PBM om te manipuleren. Breng de vis met een plastic lepel over op een absorberend oppervlak, zoals papieren handdoeken, om overtollig water rond het lichaam te verwijderen. Breng vervolgens met de plastic lepel de vis over een weegschaal over in een petrischaal en weeg de vis. Let op het gewicht van de vis, omdat dit nodig is voor dosisberekeningen.OPMERKING: Het absorberen van overtollig water van vissen voorkomt overschatting van het gewicht van het dier, droog niet te drogen omdat dit schadelijk is voor de vis. Om de uiteindelijke dosis van 120 μg/g gewicht te bereiken, deelt u de μg van de uiteindelijke dosis (120 μg) per μg van de cisplatine-werkoplossing (850 μg) en zet u dit aantal om in microliters (μL) door zich te vermenigvuldigen voor 1000, om het volume van 120 μg cisplatine (141,2 μL) te krijgen. Vermenigvuldig vervolgens dit getal (141,2 μL) voor het gewicht van de vis (g) om het uiteindelijke volume te laten injecteren. Breng de vis met een plastic lepel over op een natte spons met een kleine snede om hem vast te houden, met de ventrale kant naar boven. De spons moet nat zijn met verdoving in systeemwater. Vul een insulinespuit van 31 G 1,0 ml met het berekende volume cisplatine-werkoplossing. Steek de naald in het intraperitoneale gedeelte van het dier in de buurt van de bekkenvin, onder een ondiepe hoek om te voorkomen dat de ingewanden doorboren (figuur 2A). Injecteer vervolgens langzaam de oplossing. Plaats de vis na injectie in een tank om te herstellen van anesthesie. Let op de vissen op tekenen van normaal herstel(bijv. zwembewegingen, operculaire bewegingen).OPMERKING: Het dier moet zich in de volgende 3-5 minuten herstellen. Stimuleer de vis indien nodig door hem te verplaatsen met een plastic lepel, een pasteur plastic pipet of hem dicht bij een slang met bubbels te plaatsen. Voer voor controlevissen dezelfde procedure uit door een oplossing van 0,9% NaCl te injecteren. Gebruik dezelfde berekening volgens het aandeel van het lichaamsgewicht: het te injecteren volume zal 141 μL zijn vermenigvuldigd met het gewicht van de vis (g). Controleer de overleving van vissen ten minste tweemaal daags in de volgende dagen (figuur 2B). 2. Nierisolatie en weefselverwerking voor flowcytometrie van immuuncellen Gebruik voor deze procedure immuuncel-fluorescerende gemarkeerde transgene dieren (bijv., Tg (mpo:GFP)). Na 24 hpi van 120 μg/g cisplatine euthanaseren dieren door onderkoelingsschok (snel koelen).OPMERKING: Het is aangetoond dat onderkoelingsschok effectiever is als euthanasiemethode dan ms-222 overdosering. Onderkoelingsschok is minder stressvol, snel, consistent en veiliger voor personeel dan het gebruik van MS-222, heeft eerder beschreven46,47. Bereid in een buitenste oversteektank ijswater voor in een verhouding van 5:1 ijs tot systeemwater, plaats de binnentank met een scherm over het ijs, wacht tot het water 2-4 °C bereikt.OPMERKING: Vissen mogen niet in direct contact staan met het ijs, omdat dit thermische brandwonden en pijn kan veroorzaken. Breng het dier over in ijswater, wacht minstens 10 minuten tot er verlies van oriëntatie en geen operculaire beweging is. Plaats de vis met een plastic lepel op papieren handdoeken om het overtollige water af te drogen. Breng de vis over op een ontledingsplaat van 3% en neem deze onder een stereoscope met bovenlicht. Onthoofd met een schaar vissen die net achter de ogen een snelle snede maken en verwijder het hoofd. Maak met een fijne schaar een snede van de open kant naar de cloaca en verwijder de inwendige organen met fijne tang. Gebruik insectenpennen om de zijkanten van de lichaamswanden te knijpen om het karkas te openen en de nier aan de ruggengraat bloot te stellen. Maak de nier los met een fijne tang en plaats het orgaan in een 6 putplaat met een koude oplossing van 1x PBS/2% FBS. Blijf op ijs. Pak het weefsel op met een Pasteur plastic pipet en passeer het weefsel door een 40 μm celzeef over een buis van 50 ml, waarbij het voorzichtig wordt gemacereerd met een spuitduiker. Was tweemaal met 1 ml 1x PBS/2% FBS en verzamel de cellen in een buis van 50 ml. Centrifugeer cellen bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Pak voorzichtig alle supernatant op met een micropipet van 1 ml en gooi het weg. Voeg 500 μL koude 1x PBS toe om de cellen te resuspenden en plaats ze in cytometriebuizen met een stroom van 5 ml. Blijf op ijs. Tel cellen in de Neubauer-kamer die een verdunning van 1:10 maken in Trypan Blue(neem bijvoorbeeld10 μL van het monster en meng met 90 μL Trypan Blue). Voeg 10 μL van het mengsel toe aan een Neubauer-kamer en tel cellen onder de microscoop.OPMERKING: Optimale resultaten worden verwacht met 1-5 x 106 cellen/ml en >80% levensvatbaarheid.LET OP: Trypan blauw is een kankerverwekkend middel, gebruik PBM om te hanteren. Neem de cellen af te lezen door een cytometer. Analyseer vervolgens de resultaten die de populatie van belang selecteren. 3. Verwerking van volwassen zebravis nierweefsel voor TUNEL Assay Gebruik voor deze procedure wilde dieren(bijv.AB, Tübingen, enz.) of een transgeen dier met een andere fluorescerende kleur dan de TUNEL-kit, omdat vergelijkbare fluorescentie de analyse van TUNEL kan verstoren. Na 24 hpi van 120 μg/g cisplatine euthanaseren dieren door onderkoelingsschok (snel koelen). Zie 2.3-2.4. Ontleed de vis zoals beschreven in 2.5-2.6; de nier moet tijdens de fixatieprocedure aan de ruggengraat blijven zitten (hieronder uitgelegd). Knijp met behulp van insectenpennen aan de zijkanten van de lichaamswanden om het karkas te openen en speld het op een kurkoppervlak om de nier bloot te houden.OPMERKING: Deze procedure zorgt ervoor dat de nier in de juiste positie blijft voor latere analyse. Plaats vervolgens het kurkoppervlak met de nier naar beneden in een 6-putplaat over een vers gemaakte oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA). Bewaar het ‘s nachts bij 4 °C.LET OP: PFA is kankerverwekkend en irriterend voor de huid en slijmoppervlakken. Bereid PFA-oplossingen onder een chemische kap met PBM inclusief oogbeschermingsapparatuur. Ontleed de volgende dag de nieren zoals in 2.8. Plaats de nieren in een petrischaal van 60 mm met 1x PBS en spoel tweemaal in 1x PBS. Bereid 2% agarose voor om een ondersteuningsmatrix voor het weefsel te genereren. Gooi alle resterende 1x PBS uit de Petrischaal en giet 2% agarose langzaam om het hele orgaan te bedekken. Plaats vervolgens de nier met behulp van een fijne tang onder een stereomicroscoop om te voorkomen dat de nier vouwt. Laat agarose stollen bij kamertemperatuur.OPMERKING: Deze procedure houdt de oriëntatie en vorm van het orgaan door histologische verwerking, omdat de bladachtige vorm van het orgaan de neiging veroorzaakt om te vouwen als het zich niet in een ondersteunende matrix bevindt. Gebruik na agarose-stolling een scalpel om de agarose rond het weefsel te snijden, kleine blokjes te vormen en het teveel aan agarose rond het weefsel te verwijderen. Plaats de agaroseblokjes in een cassette die geschikt is voor histologische verwerking.OPMERKING: De volgende stappen kunnen handmatig of in een automatische weefselprocessor worden uitgevoerd. Verwerk eerst het weefsel in de cassette volgens de volgende stappen gedurende elk 45 minuten bij kamertemperatuur: één bad van 50% ethanol, één bad van 70% ethanol, twee opeenvolgende baden van 95% ethanol en drie opeenvolgende baden van 100% ethanol. Verwerk daarna het weefsel in twee opeenvolgende baden van Xyleen en drie opeenvolgende baden paraffine; de laatste duurt elk 1 uur bij 60 °C.LET OP: Breng veranderingen aan onder een chemische kap, dampen van ethanol en xyleen zijn irriterend en giftig. Smelt paraffine linzen tot 60 °C om paraffineblokken te bereiden. Open de plastic cassette met het weefsel erin en bewaar deze op een warme plaat. Warm metalen mallen op voor de paraffine. Plaats met een pincet het weefsel over een metalen mal zodat de nierlengte evenwijdig is aan de malbasis. Voeg de paraffine toe, herschik het weefsel indien nodig. Bedek de mal met de basis van de cassette en voeg paraffine toe totdat het rooster bedekt is. Laat stollen bij kamertemperatuur en plaats vervolgens op -20 °C voor een sneller stollingsproces. Laat het paraffineblok ongeveer 20-30 minuten later los uit de metalen mal. Doorsnede met een microtome het weefsel ingebed in paraffine tot 5 μm dikte. Gebruik verzilte of positief geladen glazen dia’s om het weefsel te verzamelen. 4. TUNEL-test OPMERKING: Het volgende protocol maakt gebruik van een In Situ Cell Death Detection Kit (Table of Materials). Dewax weefselglijbanen plaatsen ze gedurende 5 minuten in twee opeenvolgende baden van xyleen. Rehydrateer vervolgens het weefsel door een gesorteerde reeks ethanol: 100%-95%-70%-50%, elk gedurende 5 minuten. Plaats de glijg in stromend koud leidingwater om de ethanol af te spoelen. Bewaar de dia’s in gedestilleerd water. Bereid een donkere incubatorkamer voor. Voeg natte papieren handdoeken toe aan de onderkant om het vocht tijdens de incubatiestappen te behouden.OPMERKING: Bij gebrek aan een couveusekamer is het mogelijk om een Petrischaal met vochtig papier in de bodem en twee tandenstokers te gebruiken om de dia te plaatsen. Bereid verse Proteinase K werkoplossing: 10 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7,4-8.OPMERKING: Proteïnase K wordt gebruikt als permeabilisatiemiddel, zoals aanbevolen door de fabricant. Plaats de dia’s in de donkere incubatorkamer en voeg Proteinase K-werkoplossing toe tot de monsters bedekt zijn. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Terwijl de monsters incuberen, bereidt u het TUNEL-reactiemengselvoor: Voeg 50 μL enzymoplossing toe aan 450 μL labeloplossing. Beschermen tegen licht.OPMERKING: Het te bereiden volume kan in dezelfde verhouding van 1:10 worden ingesteld. Het volume wordt berekend op 50 μL van het mengsel voor elke sectie; dit kan veranderen afhankelijk van de grootte van de monsters. Pak de donkere kamer op en was de dia’s twee keer met 1x PBS. Droog vervolgens het gebied rond het monster met absorberend papier en voeg 50 μL TUNEL-reactiemengsel toe over elke weefselschuif, verspreid de oplossing zodat het hele monster bedekt is. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Beschermen tegen licht. Spoel na incubatie de glijbaan drie keer af met 1x PBS en droog het gebied rond het monster met keukenpapier. Voeg 50 μL DAPI 1:1000 toe aan de monsters, voor nucleaire counterstaining, en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Beschermen tegen licht. Spoel opnieuw drie keer met 1x PBS en droog het gebied rond het monster. Monteer de glijbaan met een anti-fade hydrofiele medium, plaats een coverslip en sluit af met nagellak. Schuifjes horizontaal bewaren, beschermd tegen licht bij 4 °C.OPMERKING: De antifa fade-eigenschappen van het montagemedium zijn om de fluorescentie van de monsters te behouden, maar het is mogelijk om elk beschikbaar hydrofiele medium te gebruiken. De laatste afdichtingsstap met nagellak is cruciaal om uitdroging te voorkomen. Visualiseer de monsters onder een fluorescentiemicroscoop. Gebruik voor dit type fluorescerend pigment een excitatiegolflengte in het bereik van 520-560 nm (groen) en detectie in het bereik van 570-620 nm (rood).

Representative Results

De nier van de zebravis is een plat gepigmenteerd orgaan op de dorsale wand en de basis functionele eenheid, de nefron, wordt geconserveerd met zoogdieren (Figuur 1). De bijzonderheid van het hebben van slechts één nier met een hoge regeneratiecapaciteit maakt dit modelorganisme een uitstekende keuze voor modelnierletsel. De in dit werk gepresenteerde protocollen zijn ontworpen om AKI te induceren door de intraperitoneale (i.p.) injectie van cisplatine bij volwassen zebravissen (figuur 2) en later te worden geanalyseerd met twee technieken die eerder zijn beschreven: flowcytometrie (figuur 3A) en TUNEL (figuur 3B). Een stroomdiagram van het hele proces is weergegeven in figuur 4. De doses cisplatine werden aanvankelijk toegepast op basis van de doses beschreven in muismodellen15,16,17, waarbij de gebruikte norm 10-13 mg cisplatine per kg dier (mg/kg) is. De zebravis bleek echter resistenter tegen cisplatine dan de muis (gegevens niet getoond) en de uiteindelijke dosis werd verhoogd. Toen we de overlevingskans van de dieren evalueerden, toonden de experimenten een dosisafhankelijk effect van cisplatine (figuur 5A). Daarom raden we aan om de instructies precies te volgen zoals uitgelegd in dit protocol en de overlevingskans van de dieren constant te controleren als een maatstaf voor reproduceerbaarheid, voordat we materiaal verzamelen. Na de i.p. injectie van 120 μg/g cisplatine (figuur 5A, rode lijn) werd in de eerste 24 uur een afname van de overleving van ongeveer 30% van de dieren waargenomen en nam de overleving geleidelijk af tot ongeveer 20% van de levende dieren op dag 5 na injectie werd bereikt en vervolgens gestabiliseerd ( figuur5A). Cisplatinetoxiciteit werd niet beïnvloed door het geslacht van de dieren, omdat mannetjes en vrouwtjes vergelijkbare overlevingscurven hebben (Figuur 5B). Analyse van de kinetiek van cisplatine-geïnduceerde AKI toonde verhoogde ontsteking en celdood in de nier 24 hpi. Een van de snelste en kwantitatieve manieren om ontstekingen te evalueren is flowcytometrie, maar gezien het gebrek aan antilichamen tegen zebravisantigenen die commercieel beschikbaar zijn voor deze techniek, is het noodzakelijk om een transgene lijn met een immuunmarker te gebruiken. Tegenwoordig zijn veel zebravislijnen met immuuncellen toegankelijk (Tabel 1). Deze regels kunnen alleen of in combinatie worden gebruikt, met voldoende repertoire voor analyse48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. Dit vereenvoudigt de techniek enorm omdat er geen antilichaam incubatiestap nodig is, integendeel, na de isolatie van de cellen door mechanische scheiding is de directe aflezing op de cytometer mogelijk. Zoals eerder vermeld, is de nier van de zebravis niet alleen een bloedfiltratieorgaan met homeostatische functies, maar ook de anatomische plaats van hematopoiese bij volwassenen, gelijk aan het beenmerg bij zoogdieren33,34,35. Op deze manier is het mogelijk om celpopulaties vergelijkbaar met het menselijk bloed61 , 62(figuur 6A) te differentiëren wanneer we het analyseren op flowcytometrie, dit stelt ons in staat om de celpopulaties in eerste instantie te identificeren op grootte en granulariteit en puin uit te sluiten. In dit geval gebruikten we een transgene lijn genaamd Tg(mpo:GFP)52 die een groen fluorescerend eiwit (GFP) uitdrukt samen met het enzym myeloperoxidase, dat aanwezig is bij neutrofielen. Dit wetende, was onze poortstrategie gebaseerd op de initiële scheiding van de populatie van de granulocyt (Figuur 6B). Hierna werden doubletcellen uitgesloten, omdat ze de analyse aanzienlijk kunnen veranderen en tot onnauwkeurige conclusies kunnen leiden. Een doublet is een enkele gebeurtenis die bestaat uit 2 onafhankelijke deeltjes en kan worden uitgesloten door een voorwaartse spreidingshoogte (FSC-H) versus een voorwaartse spreidingszone (FSC-A) dichtheidsplot te selecteren (Figuur 6C). Na deze stap werden de cellen geïdentificeerd en geselecteerd die de fluorescerende marker uitdrukten (figuur 6D). Ten slotte werden de populatiestatistieken uit de analyse gehaald en uitgezet als percentage cellen (figuur 6E). Een van de meest prominente kenmerken van cisplatine nefrotoxiciteit is tubulaire celdood10, en om dit gemakkelijk te visualiseren, gebruikten we de TUNEL-assay voor apoptosedetectie. Deze methode raadt aan om wilde cellen en weefsels te gebruiken die geen fluorescerende markers hebben, omdat parallelle fluorescentie de analyse zou verstoren, in het geval van de zebravis wordt aanbevolen om wild-type lijnen te gebruiken, zoals AB, Tübingen, TAB, of een transgene lijn met een fluorescerend eiwit dat de TUNEL-fluorescentiekleur niet verstoort. De TUNEL-techniek maakt de analyse via flowcytometrie of microscopie mogelijk. Microscopie heeft het voordeel dat de weefselstructuur behouden blijft, waardoor kan worden gezien welke cellen afsterven. Onder de fluorescerende microscoop kunnen de heldere kernen van apoptotische cellen gemakkelijk worden onderscheiden van de achtergrond. Dieren geïnjecteerd met cisplatine (figuur 7B) hebben meer dode cellen dan de controle (figuur 7A) bij 24 hpi. De uiteindelijke kwantificering werd gedaan met de celtelleroptie van FIJI Software en toonde statistisch meer dode cellen in met cisplatine behandelde nieren dan in de controles (Figuur 7C) Het protocol beschreven in dit manuscript toonde aan hoe cisplatine te gebruiken als een inductor van AKI bij volwassen zebravissen, die dosis-respondent, snel en betrouwbaar is. Op basis van de gegevens verkregen uit overlevingspercentages en de meting van tekenen van nefrotoxiciteit van cisplatine, waaronder ontsteking (gedetecteerd door flowcytometrie) en celdood (gedetecteerd door TUNEL-assay), stellen we dit model voor voor de studie van cisplatine nefrotoxiciteit en voor toekomstige behandelingen bij AKI-gerelateerde ziekten. Figuur 1: Structuur en vergelijking van zebravissen en menselijke nieren. A. (1) Zijdelings zicht op een volwassen zebravis met de nier vertegenwoordigd in donkerbruin gelegen in de rugwand van de vis, tussen de zwemblaas (sb) en de ruggengraat. (2) Ventrale weergave van de nier met nefronen (geel) verbonden met het opvangkanaal (blauw). De verschillende regio’s van de nier zijn gemarkeerd: kop (H), romp (Tr) en staart (Ta). (3) Schematisch dat zebravis nefronen en hun segmenten vertegenwoordigt die zijn gelabeld en gekleurd om genetisch geconserveerde gebieden te matchen met menselijke nefron. B. (1) Sagittale weergave van een menselijke nier. (2) Schematisch met een menselijke nefron met segmenten gelabeld en gekleurd. RC: nierlichaampje; PCT: proximale convoluted tubulus; PST: proximale rechte tubulus; TL: dunne ledemaat; LH: Lus van Henle; TAL: dikke oplopende ledemaat; DE: distaal vroeg; DL: distaal laat; DCT: distale convoluted tubulus; CD: opvangkanaal. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2: Experimenteel ontwerp voor cisplatine-geïnduceerde AKI. A. Zijdelingse en ventrale weergave van volwassen zebravissen die de positie van de naald tijdens de injectieprocedure richten. De naald dringt onder een hoek van 20-30° vanuit de buik door en wordt langzaam parallel aan de ventrale wand ingebracht, waardoor het vizier niet wordt doorboord. B. Experimenteel ontwerp van cisplatine-geïnduceerde AKI: (1) Injectie van cisplatine 120 μg/g per dier op dag nul. (2) Voordat u stap 3 probeert, wordt overlevingsbewaking van vissen na injectie aanbevolen vanaf de eerste dag tot dag tien. (3) Nierdissecties één dag na cisplatineinjectie voor verdere verwerkingstechnieken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3: Mechanismen van flowcytometrie en TUNEL technieken. A. Overzicht van de flowcytometer: een suspensie van cellen is hydrodynamisch gericht op een enkele lijn door een schedevloeistof, waardoor cellen één voor één voor een laserstraal passeren. Detectoren voor en aan de zijkant meten de voorwaartse verstrooiing (FSC), zijstrooiing (SSC) en fluorescentie van de cellen. B. Principe van TUNEL-test. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) bemiddelt de toevoeging van een fluorescerend gemarkeerde dUTP aan 3′-OH uiteinden van een gefragmenteerd DNA. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Stroomschema van weergegeven technieken. A. Een stroomdiagram met de stappen die moeten worden gevolgd bij het analyseren van het nierweefsel door middel van flowcytometrie (oranje) of TUNEL (blauw), bij het induceren van AKI door cisplatine-injectie (grijs). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5: Overlevingsmonitoring van cisplatine geïnjecteerde vis. A. Overlevingskans van verschillende doseringen cisplatine-injecties (25 – 50 – 112,5 – 120 μg/g). Log-rank (Mantel-Cox) test, ** p < 0.01. B. Overlevingskans van mannen versus vrouwen geïnjecteerd met 120 μg/g cisplatine. Log-rank (Mantel-Cox) test, *** p < 0.001. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6: Poortstrategie voor transgene zebravislijn. A. Dichtheidsplot van volwassen niercellen van zebravissen, populaties worden gescheiden door grootte (FSC-A) en granulariteit (SSC-A). Verschillende populaties worden geselecteerd door gekleurde ovalen/cirkels. Roze: Erythroid; Zwart: Lymfoïde; Geel: Voorlopers; Rood: Granulocyten. B. Dichtheidsplot van zijstrooigebied (SSC-A) en voorwaarts strooigebied (FSC-A) voor selectie van Granulocytenpopulatie in de nier. C. Dichtheid perceel van voorwaartse scatter hoog (FSC-H) en forward scatter gebied (FSC-A) voor selectie van singlets populatie binnen de granulocyt poort. D. Dichtheidsplot van voorwaarts strooigebied (FSC-A) en FITC-A:MPO voor selectie van mpo:GFP-positieve cellen (neutrofielen) in de nier. Een positieve populatie wordt beschouwd als ongeveer 103 op, van fluorescentie intensiteit. E. Grafiek van het percentage mpo:GFP positieve cellen (neutrofielen) in Controle versus Cisplatine dieren, 24 hpi . Ongepaarde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 7: TUNEL-test van cisplatine geïnjecteerde vis. A. Microfoto’s van vaste volwassen nieren 24 uur na 120 μg/g cisplatine injectie. Controles worden geïnjecteerd met 0,9% NaCl. TUNEL positieve cellen (apoptotische cellen) zijn rood gekleurd (witte pijlen). DAPI (blauw) wordt gebruikt als nucleaire tegenaanval. Schaalbalk: 50 μm. 20x vergroting. B. Grafiek die kwantificering van het aantal dode cellen in de nier door 20x gebied toont. Ongepaarde t-test,* p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Transgene lijn Celtype gelabeld Verwijzingen Tg(spi1: EGFP) pA301 Myeloïde cellen Ward et al. 2003 Tg (zpu1: GFP) Myeloïde cellen Hsu et al. 2004 Tg(mhc2dab: GFP) sd6 Monocyten Wittamer et al. 201150 Tg (lysC: DsRED2) Neutrofielen Hall et al. 2007 Tg(mpo:GFP) Neutrofielen Mathias et al. 200652 Tg (mpeg1:mCherry) Macrofagen Ellett et al. 201153 Tg (mpeg1: Dendra2) Macrofagen Harvie et al. 201354 Tg(lck:GFP) T-cellen Langenau e.a. 200455 TgBAC (ikaros:EGFP) T-cellen Bajoghli e.a. 200956 Tg (vod1:GFP) T-cellen Jessen e.a. 199957 Tg (vod2:GFP) T-cellen Jessen e.a. 200158 Tg (CD79:GFP) B-cellen Liu et al. 201759 Tg (CD45: DsRed) Leukocytes Bertrand et al. 200860 Tabel 1: Zebravis transgene lijnen voor immuuncellen. Tabel met de namen van zebravisverslaggeverlijnen met het respectieve type immuuncel gelabeld en de referentieartikelen waar ze zijn geconstrueerd. Een combinatie van deze zebravislijnen kan nieuwe mogelijkheden bieden voor celselectie per flowcytometrie.

Discussion

De prevalentie van nierziekten is wereldwijd blijven toenemen en is uitgegroeid tot een wereldwijd volksgezondheidsprobleem dat miljoenen mensen63 treft. Het vinden van een manier om niergewonde personen te behandelen is van het grootste belang en begrijpt meer over hun etiologie en progressie. Verschillende studies hebben diermodellen gebruikt om nierschade te begrijpen. De zebravisnier (figuur 1) wordt al jaren bestudeerd in ontwikkelingsbiologie en letselonderzoek vanwege zijn zelfregeneratieve capaciteiten en genetische gelijkenis29,64. Hier presenteren we een nieuw AKI-model bij volwassen zebravissen met behulp van de eigenschappen van cisplatine als nefrotoxisch middel, waarin de stappen worden beschreven voor het bereiken van een snelle en acute reactie met schade zichtbaar zodra 24 hpi (Figuur 2). Bovendien leggen we hier twee technieken uit die zullen helpen bij de evaluatie van de weefselschade na de cisplatine-injectie, flowcytometrie en TUNEL (figuur 3).

Huidige AKI-modellen bij volwassen zebravissen omvatten de i.p. injectie van gentamicine die uitgebreide schade veroorzaakt in de nefron- en tubulusvernietiging, neonephrogenesegebeurtenissen beginnen vanaf dag 5 en regeneratie wordt voltooid na 21 dagen na injectie65. Aan de andere kant werd een model van sepsis-geassocieerde acute nierbeschadiging (S-AKI) vastgesteld door de infectie met Edwardsiella tarda, omdat de expressie van AKI-markers, zoals insuline-achtige groeifactorbindend eiwit-7 (IGFBP7), weefselremmer van metalloproteinases 2 (TIMP-2), en nierletselmolecuul-1 (KIM-1), bij larven en volwassen zebravissen66, aanzienlijk werd verhoogd. De zebravis staat bekend als een dier met een hoge doorvoer voor het zoeken naar therapeutische middelen en dit omvat het gebruik van probiotica en microbiota-afgeleide metabolieten om de nierfunctie en regeneratie te bestuderen67. De beschikbare modellen kunnen echter rechtstreeks van invloed zijn op het resultaat van deze behandelingen. Zo hebben we een andere methode vastgesteld om AKI te induceren bij volwassen zebravissen (figuur 4), met cisplatine als een bekend nefrotoxisch middel dat geen directe bekende effecten op de vismicrobiota zou hebben, net als het gentamicinemodel voor het zijn van een antibioticum, of de infectie met E. tarda, omdat het een sepsismodel is. Op hetzelfde moment dat we ons cisplatineprotocol ontwikkelden, onderzocht een andere groep echter ook de nefrotoxische effecten van cisplatine bij volwassen zebravissen, waardoor de dosis werd vereenvoudigd tot 10-20-30 μg per dier68. Hoewel ze ook een cisplatine dosisafhankelijk effect op de overleving vertoonden, raden we voorzichtigheid aan bij het gebruik van één enkele hoeveelheid cisplatine voor alle vissen, aangezien zebravissen van dezelfde leeftijd zeer verschillende maten en gewichten kunnen hebben en dit variaties in de resultaten69,70kan veroorzaken . We vinden het belangrijk om de dosis aan te passen aan het overeenkomstige gewicht van het dier, zoals wordt gedaan bij muizen en deze studie.

In onze experimenten met volwassen zebravissen vertoonde cisplatine een dosis-responseffect. Dit werd gevisualiseerd door de overlevingskans van de dieren na cisplatine-injectie te monitoren (figuur 5). We gebruikten overleving als een manier om de intensiteit van de dosis cisplatine te schatten en niet als een maat voor nefrotoxiciteit, omdat er geen ander fysiek teken zichtbaar is tijdens de monitoringtijd. Dit kan vergelijkbaar zijn met knaagdieren, waarbij de ernst van de nierbeschadiging kan worden gemoduleerd door de dosering en frequentie van cisplatine-injectie15, het bereiken van dodelijke doses met hogere concentraties cisplatine71. Dood wordt ook gezien in de volgende dagen in het larvale model van cisplatine72. Omdat ons doel was om binnen enkele dagen een acuut letsel op te wekken, hebben we de dosis cisplatine van 120 μg/g geselecteerd om nierschade 24 uur na de injectie waar te nemen, maar dit kan worden aangepast afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek.

Bij mensen wordt AKI klinisch gediagnosticeerd door verminderde glomerulaire filtratiesnelheid (GFR), verhoogde serumcreatinine en bloed ureumstikstof3. Bij zebravissen omvat het repertoire van AKI-modellen enkele genetisch-voorwaardelijke modellen73,74 en sommige geneesmiddelgerelateerde modellen65,72, maar omdat sommige van de AKI-functionele parameters niet op zebravissen kunnen worden gemeten vanwege technische problemen(bijv. bloedafname), gebruikt het meeste onderzoek morfologische en visuele technieken om de kenmerken van AKI 1,75 zoals onze studie te observeren.

Bij knaagdieren komt cisplatine de epitheelcellen binnen in de proximale en distale tubuli, in de cel ondergaat metabolische activering en wordt zeer reactief en werkt op celorganellen en induceert veranderingen in de celstructuur. Deze veranderingen kunnen apoptose en autofagie en zelfs necrose veroorzaken, bij zeer hoge doses. Als reactie op deze schade komen veel cytokinen vrij en worden leukocyten gerekruteerd die leiden tot ontsteking en de functionaliteit van het orgaan beïnvloeden15. Dit benadrukt het belang van het beoordelen van welk type cellen kan worden gevonden in de gewonde nier, als bewoners of geïnfiltreerde immuuncellen. Hier lieten we zien hoe we dit kunnen beoordelen aan de hand van flowcytometrie, met behulp van de transgene immuunreporterlijnen die tegenwoordig beschikbaar zijn (Tabel 1). Cisplatine verhoogde het percentage neutrofielen (mpo:GFP positieve cellen) in de nier 24 uur na de injectie (Figuur 6). In het geval van de zebravis is de nier de niche van HSC’s die aanleiding geven tot verschillende bloedceltypen. Niettemin circuleren er normaal gesproken veel granulocyten en macrofagen in het bloed. In ons voorbeeld gebruikten we de mpo:GFP-transgene lijn die GFP uitdrukt onder de promotor van myeloperoxidase van neutrofielen52. Originele studies van de mpo:GFP transgene lijn toonden expressie van myeloperoxidase in verschillende staten van neutrofiele rijping76, maar onze poortstrategie richtte zich op de granulocytfractie die volwassen cellen uit het bloed omvat52, op deze manier omvat onze analyse geïnfiltreerde cellen en niet ingezeten cellen. Dit is belangrijk om te overwegen bij het isoleren van de gewenste celpopulatie.

Zoals hierboven uitgelegd, is apoptose de meest klassieke marker van cisplatine-gerelateerde AKI. Hier demonstreerden we een eenvoudig protocol voor de lokalisatie van dode cellen door de TUNEL-test. Cisplatine-injectie verhoogde het aantal apoptotische cellen 24 hpi (figuur 7). Dit kan eenvoudig worden gekwantificeerd door direct de dode cellen uit het weefsel te tellen. Niettemin kan voor de identificatie van celspecifieke sterfte het gebruik van antilichamen tegen de gewenste cel(bijv. buisvormige cellen) of het gebruik van een transgene reporterlijn samen met deze techniek worden gebruikt. In vergelijking met het gentamicine-geïnduceerde model van AKI lijkt cisplatine een ernstiger model te zijn, omdat gentamicine-apoptose hoger was op de derde dag na injectie65.

Ondanks het hebben van een verscheidenheid aan bijwerkingen, cisplatine wordt nog steeds veel gebruikt in kankertherapie, vanwege de effectiviteit tegen verschillende soorten kankers, waaronder carcinomen, kiemceltumoren, lymfomen en sarcomen77. Nefrotoxiciteit komt voor bij een derde van de patiënten in behandeling met cisplatine10, dus het zoeken naar strategieën die dit effect kunnen verminderen en renoprotectie kunnen verhogen, is noodzakelijk. Wij zijn van mening dat de methoden en technieken die in dit manuscript worden gepresenteerd, zullen helpen om mechanismen van nierletsel op te helderen en therapeutische doelen te vinden die essentieel kunnen zijn om de kwaliteit van leven te verbeteren van personen die lijden aan niercomplicaties, voornamelijk die welke verband houden met het gebruik van cisplatine.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), financiële code 0 We danken onze medewerkers in het Laboratorium van Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno’s en de Zebrafish Facility van de afdeling Genetica en Evolutionaire Biologie, in het Bioscience Institute van de Universiteit van São Paulo. Wij danken Cristiane Naffah de Souza Breda en Theresa Raquel de Oliveira Ramalho voor de opmerkingen en suggesties over het manuscript. We waarderen en bedanken Marcio Villar Martins, van het multimediateam van het Institute of Biomedical Sciences, enorm voor de opname, editie en productie van deze video.

Materials

1x PBS Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water
31 G 1.0 cc insulin syringe BD Plastipak 990256 Needle: BD Precision Glide 300110
3.5 L Fish tank Tecniplast Part of the aquactic system
6 well plate Corning 351146
10 mM Tris/HCl Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)
50 ml Falcon tube Corning 352070
2-3% Agarose Invitrogen 16500-500 Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.
2% FBS Gibco 12657-09 Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS
4% Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C
50% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
70% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
90% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
100% Ethanol Synth 00A1115.01.BJ
100% Xylene Synth 00X1001.11.BJ
Cell strainer 40 µm Corning 431750
Cisplatin Blau Farmacêutica 16020227 C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.
Cork board sheet Obtained from local stationary store
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Stock solution 20 mg/ml dissolved in water
Fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Flow cytometry tubes Corning 352052
Glass slide Thermo-Fisher 4445
Histology cassette Ciencor 2921
Immuno stain chamber Ciencor EP-51-05022
Incubator NAPCO 5400 Set to 37 °C
Insect pins Papillon Model micro15x20
In Situ Cell Death Detection Kit Roche Diagnostics 12156792910
Metal mold Leica Biosystems 3803081
Micropipette 200-1000 µL Eppendorf Use 1 mL tips
MS-222 (Tricaine) Fluka Analytical A5040-25G
NaCl 0.9% Synth C1060.01.AG Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water
Nail polish Prefer transparent
Neubauer chamber Precicolor HGB
Pasteur plastic pipet United Scientific Supplies P31201
Paraplast Sigma-Aldrich P3558
Petri dish J.ProLab 0307-1/6 60 and 100 mm
Plastic spoon Obtained from local store
Proteinase K New England BioLabs P8102 Diluite from stock 20 mg/ml
Scissors Fine Science Tools 14060-09
Scalpel blade Solidor
Sponge Obtained from local store
Trypan Blue Cromoline 10621/07
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10
Centrifuge Eppendorf 5810R
Cytometer BD Biosciences FACSCanto II
Fluorescence Stereoscope Zeiss Axio Zoom.V16
Fluorescence Microscope Zeiss AxioVert.A1
Microtome Leica Jung Supercut
Scale Ohaus Corporation AR2140
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish Renal Pathology: Emerging Models of Acute Kidney Injury. Current Pathobiology Reports. 3 (2), 171-181 (2015).
  2. Guo, C., Dong, G., Liang, X., Dong, Z. Epigenetic regulation in AKI and kidney repair: mechanisms and therapeutic implications. Nature Reviews Nephrology. 15 (4), 220-239 (2019).
  3. Makris, K., Spanou, L. Acute Kidney Injury: Definition, Pathophysiology and Clinical Phenotypes. Clinical Biochemist Reviews. 37 (2), 85-98 (2016).
  4. Sawhney, S., et al. Intermediate and Long-term Outcomes of Survivors of Acute Kidney Injury Episodes: A Large Population-Based Cohort Study. American Journal of Kidney Diseases. 69 (1), 18-28 (2017).
  5. Saxena, A., Meshram, S. V. Predictors of Mortality in Acute Kidney Injury Patients Admitted to Medicine Intensive Care Unit in a Rural Tertiary Care Hospital. Indian Journal of Critical Care Medicine. 22 (4), 231-237 (2018).
  6. Sawhney, S., Fraser, S. D. Epidemiology of AKI: Utilizing Large Databases to Determine the Burden of AKI. Advances in Chronic Kidney Disease. 24 (4), 194-204 (2017).
  7. Sales, G. T. M., Foresto, R. D. Drug-induced nephrotoxicity. Revista da Associação Médica Brasileira. 66, 82-90 (2020).
  8. Perazella, M. A. Drug use and nephrotoxicity in the intensive care unit. Kidney International. 81 (12), 1172-1178 (2012).
  9. Taber, S. S., Mueller, B. A. Drug-associated renal dysfunction. Critical Care Clinics. 22 (2), 357-374 (2006).
  10. Pabla, N., Dong, Z. Cisplatin nephrotoxicity: mechanisms and renoprotective strategies. Kidney International. 73 (9), 994-1007 (2008).
  11. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 307-320 (2005).
  12. Shirmanova, M. V., et al. Chemotherapy with cisplatin: insights into intracellular pH and metabolic landscape of cancer cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 8911 (2017).
  13. Xu, Y., et al. A Role for Tubular Necroptosis in Cisplatin-Induced AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (11), 2647-2658 (2015).
  14. Kociba, R. J., Sleight, S. D. Acute toxicologic and pathologic effects of cis-diamminedichloroplatinum (NSC-119875) in the male rat. Cancer Chemotherapy Reports. 55 (1), 1-8 (1971).
  15. Perše, M., Večerić-Haler, &. #. 3. 8. 1. ;. Cisplatin-Induced Rodent Model of Kidney Injury: Characteristics and Challenges. BioMed Research International. 2018, 1462802 (2018).
  16. Dobyan, D. C., Levi, J., Jacobs, C., Kosek, J., Weiner, M. W. Mechanism of cis-platinum nephrotoxicity: II. Morphologic observations. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 213 (3), 551-556 (1980).
  17. Singh, G. A possible cellular mechanism of cisplatin-induced nephrotoxicity. Toxicology. 58 (1), 71-80 (1989).
  18. Jodrell, D. I., et al. The renal effects of N10-propargyl-5,8-dideazafolic acid (CB3717) and a non-nephrotoxic analogue ICI D1694, in mice. British Journal of Cancer. 64 (5), 833-838 (1991).
  19. McKeage, M. J., et al. Lack of nephrotoxicity of oral ammine/amine platinum (IV) dicarboxylate complexes in rodents. British Journal of Cancer. 67 (5), 996-1000 (1993).
  20. Gautier, J. C., et al. Evaluation of novel biomarkers of nephrotoxicity in two strains of rat treated with Cisplatin. Toxicologic Pathology. 38 (6), 943-956 (2010).
  21. Vinken, P., et al. Tissue Kim-1 and urinary clusterin as early indicators of cisplatin-induced acute kidney injury in rats. Toxicologic Pathology. 40 (7), 1049-1062 (2012).
  22. Zorzetto, R., Guimarães, M. Um peixe modelo. Pesquisa FAPESP. 209, 16-21 (2013).
  23. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  24. Chakrabarti, S., Streisinger, G., Singer, F., Walker, C. Frequency of gamma-Ray Induced Specific Locus and Recessive Lethal Mutations in Mature Germ Cells of the Zebrafish, BRACHYDANIO RERIO. Genética. 103 (1), 109-123 (1983).
  25. Walker, C., Streisinger, G. Induction of Mutations by gamma-Rays in Pregonial Germ Cells of Zebrafish Embryos. Genética. 103 (1), 125-136 (1983).
  26. Morales, E. E., Wingert, R. A. Zebrafish as a Model of Kidney Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 60, 55-75 (2017).
  27. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney International. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  28. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Translational Research. 163 (2), 109-122 (2014).
  29. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods in Cell Biology. 100, 233-260 (2010).
  30. Saxén, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1 (3), 385-392 (1987).
  31. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
  32. Hill, A. J., Bello, S. M., Prasch, A. L., Peterson, R. E., Heideman, W. Water permeability and TCDD-induced edema in zebrafish early-life stages. Toxicological Sciences. 78 (1), 78-87 (2004).
  33. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
  34. Majumdar, A., Drummond, I. A. Podocyte differentiation in the absence of endothelial cells as revealed in the zebrafish avascular mutant, cloche. Developmental Genetics. 24 (3-4), 220-229 (1999).
  35. Song, H. D., et al. Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidney marrow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (46), 16240-16245 (2004).
  36. Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
  37. Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. The International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
  38. Palis, J., Yoder, M. C. Yolk-sac hematopoiesis: the first blood cells of mouse and man. Experimental Hematology. 29 (8), 927-936 (2001).
  39. O’Donnell, E. A., Ernst, D. N., Hingorani, R. Multiparameter flow cytometry: advances in high resolution analysis. Immune Network. 13 (2), 43-54 (2013).
  40. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  41. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118 (2), 289-297 (2011).
  42. Kulkeaw, K., et al. Purification of zebrafish erythrocytes as a means of identifying a novel regulator of haematopoiesis. British Journal of Haematology. 180 (3), 420-431 (2018).
  43. Ratnayake, D., Currie, P. D. Fluorescence-Activated Cell Sorting of Larval Zebrafish Muscle Stem/Progenitor Cells Following Skeletal Muscle Injury. Methods in Molecular Biology. 1889, 245-254 (2019).
  44. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  45. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  46. Wilson, J. M., Bunte, R. M., Carty, A. J. Evaluation of rapid cooling and tricaine methanesulfonate (MS222) as methods of euthanasia in zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (6), 785-789 (2009).
  47. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  48. Ward, A. C., et al. The zebrafish spi1 promoter drives myeloid-specific expression in stable transgenic fish. Blood. 102 (9), 3238-3240 (2003).
  49. Hsu, K., et al. The pu.1 promoter drives myeloid gene expression in zebrafish. Blood. 104 (5), 1291-1297 (2004).
  50. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  51. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  52. Mathias, J. R., et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1281-1288 (2006).
  53. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  54. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate immune response to Streptococcus iniae infection in zebrafish larvae. Infection and Immunity. 81 (1), 110-121 (2013).
  55. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  56. Bajoghli, B., et al. Evolution of genetic networks underlying the emergence of thymopoiesis in vertebrates. Cell. 138 (1), 186-197 (2009).
  57. Jessen, J. R., Willett, C. E., Lin, S. Artificial chromosome transgenesis reveals long-distance negative regulation of rag1 in zebrafish. Nature Genetics. 23 (1), 15-16 (1999).
  58. Jessen, J. R., Jessen, T. N., Vogel, S. S., Lin, S. Concurrent expression of recombination activating genes 1 and 2 in zebrafish olfactory sensory neurons. Genesis. 29 (4), 156-162 (2001).
  59. Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
  60. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135 (10), 1853-1862 (2008).
  61. de Jong, J. L., Zon, L. I. Histocompatibility and hematopoietic transplantation in the zebrafish. Advances in Hematology. 2012, 282318 (2012).
  62. Ossowski, P., et al. Differentiation of morphotic elements in human blood using optical coherence tomography and a microfluidic setup. Optics Express. 23 (21), 27724-27738 (2015).
  63. McCullough, K., et al. Measuring the population burden of chronic kidney disease: a systematic literature review of the estimated prevalence of impaired kidney function. Nephrology Dialysis Transplantation. 27 (5), 1812-1821 (2012).
  64. Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  65. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of Cellular Dynamics during Zebrafish Adult Kidney Regeneration. Stem Cells International. 2015, 547636 (2015).
  66. Wen, X., et al. A zebrafish model of infection-associated acute kidney injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (2), 291-299 (2018).
  67. Gong, J., Noel, S., Pluznick, J. L., Hamad, A. R. A., Rabb, H. Gut Microbiota-Kidney Cross-Talk in Acute Kidney Injury. Seminars in Nephrology. 39 (1), 107-116 (2019).
  68. Kim, M. J., Moon, D., Jung, S., Lee, J., Kim, J. Cisplatin nephrotoxicity is induced via poly(ADP-ribose) polymerase activation in adult zebrafish and mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 318 (5), 843-854 (2020).
  69. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental Dynamics. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  70. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: a staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  71. Wagner, T., Kreft, B., Bohlmann, G., Schwieder, G. Effects of fosfomycin, mesna, and sodium thiosulfate on the toxicity and antitumor activity of cisplatin. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 114 (5), 497-501 (1988).
  72. Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (5), 923-929 (2005).
  73. Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (6), 1039-1047 (2012).
  74. Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney International. 83 (6), 1193-1200 (2013).
  75. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. Journal of Visualized Experiments. (96), e52540 (2015).
  76. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult zebrafish. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
  77. Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European Journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).

Tags

Acute Kidney InjuryCisplatinZebrafishNephrotoxicityInflammationCell DeathFlow CytometryTUNEL AssayChemotherapyRenal ProtectionRegeneration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Morales Fénero, C., Padovani, B. N., do Amaral, M. A., de Barros, G. J. B., de Oliveira, I. K. X., Hiyane, M. I., Camâra, N. O. S. Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e61575, doi:10.3791/61575 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image