Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins

Les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus la thérapie de choix pour de nombreuses maladies humaines à mesure qu’ils font partie de la médecine ^{traditionnelle1,2}. Nous avons déjà décrit des souris génétiquement modifiées qui produisent efficacement des anticorps hébergeant des régions variables entièrement humaines avec des constantes IgH ^{de souris3,4}. Plus récemment, nous avons décrit des souris génétiquement modifiées qui produisent des molécules semblables à des anticorps qui ont une liaison distincte à l’antigène5. Les anticorps sont sécrétés par les cellules B et forment la base de l’immunité humorale adaptative. Il existe deux types distincts de cellules B, B-1 et B-2. Chez les mammifères, les cellules B-1 proviennent du foie fœtal et sont enrichies dans les tissus muqueux et les cavités pleurales et péritonéales après la naissance, tandis que les cellules B-2 proviennent du foie fœtal avant la naissance et par la suite dans la moelle osseuse (BM). Les cellules B-2 sont enrichies dans les organes lymphoïdes secondaires, y compris la rate et le ^sang6,7,8. Dans le BM, les progéniteurs hématopoïétiques B-2 commencent à se différencier en cellules pro-B lors de l’initiation du réarrangement de la chaîne lourde Ig ^mu9,10. Le réarrangement réussi de la chaîne lourde Ig et son assemblage dans le récepteur des cellules pré-B (pré-BCR), ainsi que la signalisation et l’expansion proliférative, conduisent à la différenciation des cellules pré-B. Une fois que les cellules pré-B ont réarrangé leurs chaînes légères Ig kappa (Igκ) ou, si elles sont improductives, Ig lambda (Igλ), elles s’associent à μ chaîne lourde, ce qui entraîne une expression igM BCR de surface. Il est important de souligner que l’expression de surface des IgM est connue pour être réduite dans des conditions d’autoréactivité, contribuant ainsi à l’auto-tolérance dans les cellules B fonctionnellement insensibles ou ^{anergiques11,12}. Les lymphocytes B immatures entrent alors dans une phase de transition, où ils commencent à co-exprimer les IgD et à migrer du BM vers la rate. Dans la rate, l’expression des IgD augmente encore et les cellules mûrissent dans une deuxième étape de cellules B transitionnelles, suivie de l’achèvement de leur état de maturation et de leur développement en cellules de zone marginale (MZ) ou folliculaires (Fol)^13,14,15. Chez les souris adultes, dans un environnement non malade, le nombre de cellules B matures reste constant malgré 10 à 20 millions de cellules B immatures générées quotidiennement dans le BM. Parmi ceux-ci, seulement trois pour cent entrent dans le pool de cellules B matures. La taille du compartiment périphérique des lymphocytes B est limitée par la mort cellulaire, due en partie à plusieurs facteurs, notamment l’autoréactivité et la maturation incomplète16,17,18. L’analyse cytométrique en flux a été largement utilisée pour caractériser et dénombrer de nombreux sous-compartiments de cellules immunitaires chez l’homme et la souris. Bien qu’il existe certaines similitudes entre les compartiments des cellules B humaines et murines, ce protocole ne s’applique qu’à l’analyse des cellules B murines. Ce protocole a été développé dans le but de phénotyper des souris génétiquement modifiées, afin de déterminer si la manipulation génétique modifierait le développement des cellules B. La cytométrie en flux a également été extrêmement populaire dans de nombreuses autres applications, notamment dans la mesure de l’activation cellulaire, de la fonction, de la prolifération, de l’analyse du cycle, de l’analyse du contenu de l’ADN, de l’apoptose et du tri cellulaire ^19,20.

La cytométrie en flux est l’outil de choix pour caractériser divers compartiments lymphocytaires chez la souris et l’homme, y compris dans des organes complexes tels que la rate, le BM et le sang. En raison des réactifs d’anticorps spécifiques à la souris largement disponibles pour la cytométrie en flux, cette technique peut être utilisée pour étudier non seulement les protéines de surface cellulaire, mais aussi les phosphoprotéines intracellulaires et les cytokines, ainsi que les lectures ^{fonctionnelles21}. Nous démontrons ici comment les réactifs de cytométrie en flux peuvent être utilisés pour identifier les sous-ensembles de cellules B à mesure qu’ils mûrissent et se différencient dans les organes lymphoïdes secondaires. Après l’optimisation des conditions de coloration, la manipulation des échantillons, la configuration correcte de l’instrument et l’acquisition des données, et enfin l’analyse des données, un protocole d’analyse cytométrique en flux complète du compartiment des cellules B chez la souris peut être utilisé. Une telle analyse complète est basée sur une nomenclature vieille de plusieurs décennies conçue par Hardy et ses collègues, où le développement de cellules BM B-2 peut être divisé en différentes fractions (Fraction) en fonction de leur expression de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM et ^IgD22. Hardy et al., ont montré que les cellules B B CD220⁺ CD43 peuvent être subdivisées en quatre sous-ensembles (Fraction A-C’) sur la base de l’expression BP-1 et CD24 (30F1), tandis que les cellules B BM B 220⁺ (^{dim to neg)} peuvent être résolues en trois sous-ensembles (Fraction D-F) basés sur l’expression différentielle des IgD et des ^IgM23 de surface. La fraction A (cellules pré-pro-B) est définie comme BP-1-CD24 (30F1)^–, la fraction B (cellules pro-B précoces) est définie comme BP-1-CD24 (30F1)⁺, la fraction C (cellules pro-B tardives) est définie comme BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, et la fraction C'(cellules pré-B précoces) est définie comme BP-1⁺ et CD24high. En outre, la fraction D (cellules pré-B) est définie comme des cellules B220⁺ CD43-IgM-B, et la fraction E (cellules B nouvellement générées, combinaison de cellules immatures et transitionnelles) est définie comme des cellules B B B220⁺ CD43^– IgM⁺ et la fraction F (cellules B matures et recirculantes) est définie comme des cellules B B B220high CD43^– IgM⁺. En revanche, la majorité des lymphocytes B naïfs présents dans la rate peuvent être divisés en cellules B matures (B220⁺ CD93^–) et cellules transitionnelles (T1, T2, T3) en fonction de l’expression de CD93, CD23 et IgM. Les cellules B matures peuvent être résolues en sous-ensembles marginaux et folliculaires basés sur l’expression des IgM et des CD21/CD35, et les sous-ensembles folliculaires peuvent être divisés en sous-ensembles folliculaires matures de type I et folliculaires de type II B en fonction du niveau de leur expression de surface IgM et ^IgD24. Ces populations de lymphocytes B spléniques expriment principalement la chaîne légère Igκ. Enfin, les populations de cellules B-1 B, qui proviennent du foie fœtal et se trouvent principalement dans les cavités péritonéales et pleurales de souris adultes, ont été décrites dans la littérature. Ces lymphocytes B péritonéaux peuvent être distingués des lymphocytes B-2 décrits précédemment par leur manque d’expression de CD23. Ils sont ensuite subdivisés en populations B-1a ou B-1b, la première étant définie par la présence de CD5 et la seconde par son ^absence25. Les progéniteurs des cellules B-1 sont abondants dans le foie fœtal, mais ne se trouvent pas chez le BM adulte. Bien que les cellules B-1a et B-1b proviennent de différents progéniteurs, elles ensemencent toutes deux les cavités péritonéale et ^pleurale24. Contrairement aux cellules B-2, les cellules B-1 sont uniquement capables de s’auto-renouveler et sont responsables de la production d’anticorps IgM naturels.

Des défauts dans le développement des lymphocytes B peuvent survenir dans de nombreux cas, y compris des déficiences dans les composants du ^BCR26,27, des perturbations des molécules de signalisation qui ont un impact sur la force de signalisation BCR14,28,29, ou une perturbation des cytokines qui modulent la survie des lymphocytes ^B30,31 . L’analyse par cytométrie en flux des compartiments lymphoïdes a contribué à la caractérisation des blocs de développement des cellules B chez ces souris et bien d’autres. L’un des avantages de l’analyse cytométrique en flux des compartiments lymphoïdes est qu’elle offre la possibilité d’effectuer des mesures sur des cellules individuelles obtenues à partir de tissus dissociés vivants. La disponibilité de réactifs dans une gamme sans cesse croissante de fluorophores permet l’analyse simultanée de plusieurs paramètres et permet d’évaluer l’hétérogénéité des cellules B. En outre, le dénombrement des cellules B par analyse cytométrique en flux complète d’autres tests immunologiques tels que les méthodes d’immunohistochimie qui visualisent la localisation cellulaire dans les organes lymphoïdes, la détection des niveaux d’anticorps circulants comme mesure de l’immunité humorale, ainsi que la microscopie à deux photons pour mesurer les réponses des cellules B dans l’espace et le temps ^réels32.