Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Monoklonale antilichamen zijn in toenemende mate de keuzetherapie geworden voor veel menselijke ziekten, omdat ze deel gaan uitmaken van de reguliere ^{geneeskunde1,2}. We hebben eerder genetisch gemanipuleerde muizen beschreven die efficiënt antilichamen produceren die volledig menselijke variabele gebieden herbergen met muis IgH-constanten3,4. Onlangs hebben we genetisch gemanipuleerde muizen beschreven die antilichaamachtige moleculen produceren die verschillende antigeenbinding5 hebben. Antilichamen worden uitgescheiden door B-cellen en vormen de basis van adaptieve humorale immuniteit. Er zijn twee verschillende soorten B-cellen, B-1 en B-2. Bij zoogdieren ontstaan B-1-cellen in de foetale lever en worden ze na de geboorte verrijkt in slijmvliesweefsels en de pleurale en peritoneale holtes, terwijl B-2-cellen vóór de geboorte ontstaan in de foetale lever en daarna in het beenmerg (BM). B-2 cellen worden verrijkt in secundaire lymfoïde organen, waaronder de milt en het ^bloed6,7,8. In de BM beginnen B-2 hematopoietische voorlopers te differentiëren naar pro-B-cellen bij de initiatie van Ig mu zware ketenherschikking9,10. Succesvolle herschikking van de zware keten van Ig en de assemblage ervan in de pre-B-celreceptor (pre-BCR), samen met signalering en proliferatieve expansie, leidt tot differentiatie naar pre-B-cellen. Nadat pre-B-cellen hun Ig kappa (Igκ), of indien onproductief, Ig lambda (Igλ) lichte ketens herschikken, paren ze met μ zware keten, wat resulteert in oppervlakte IgM BCR-expressie. Het is belangrijk erop te wijzen dat bekend is dat de expressie van het IgM-oppervlak verminderd is onder omstandigheden van autoreactiviteit, waardoor wordt bijgedragen aan zelftolerantie in functioneel niet-reagerende of anerge ^{B-cellen11,12}. Onrijpe B-cellen komen dan in een overgangsfase, waar ze IgD beginnen te co-expresseren en migreren van de BM naar de milt. In de milt neemt de IgD-expressie verder toe en rijpen de cellen tot een tweede fase van overgangs-B-cellen, gevolgd door voltooiing van hun rijpingsstatus en ontwikkeling tot marginale zone (MZ) of folliculaire (Fol) cellen13,14,15. Bij volwassen muizen, in een niet-zieke omgeving, blijft het aantal volwassen B-cellen constant, ondanks dat er dagelijks 10-20 miljoen onrijpe B-cellen in de BM worden gegenereerd. Hiervan komt slechts drie procent in de poel van volwassen B-cellen. De grootte van het perifere B-celcompartiment wordt beperkt door celdood, deels als gevolg van verschillende factoren, waaronder zelfreactiviteit en onvolledige rijping16,17,18. Flowcytometrische analyse is uitgebreid gebruikt om veel subcompartimenten van immuuncellen bij mensen en muizen te karakteriseren en op te sommen. Hoewel er enkele overeenkomsten zijn tussen menselijke en muriene B-celcompartimenten, is dit protocol alleen van toepassing op de analyse van muriene B-cellen. Dit protocol is ontwikkeld met het doel om genetisch gemanipuleerde muizen te fenotyperen, om te bepalen of genetische manipulatie de ontwikkeling van B-cellen zou veranderen. Flowcytometrie is ook enorm populair geweest in veel andere toepassingen, waaronder bij het meten van celactivering, functie, proliferatie, cyclusanalyse, DNA-inhoudsanalyse, apoptose en celsortering ^19,20.

Flowcytometrie is het instrument bij uitstek om verschillende lymfocytencompartimenten bij muizen en mensen te karakteriseren, inclusief in complexe organen zoals de milt, BM en bloed. Vanwege de algemeen beschikbare muisspecifieke antilichaamreagentia voor flowcytometrie kan deze techniek worden gebruikt om niet alleen celoppervlakeiwitten te onderzoeken, maar ook intracellulaire fosfoproteïnen en cytokines, evenals functionele ^{uitlezingen21}. Hierin laten we zien hoe flowcytometrie-reagentia kunnen worden gebruikt om B-cellensubsets te identificeren terwijl ze rijpen en differentiëren in secundaire lymfoïde organen. Na optimalisatie van kleuringsomstandigheden, monsterverwerking, correcte instrumentopstelling en gegevensverzameling, en ten slotte gegevensanalyse, kan een protocol voor uitgebreide flowcytometrische analyse van het B-celcompartiment bij muizen worden gebruikt. Een dergelijke uitgebreide analyse is gebaseerd op een decennia oude nomenclatuur bedacht door Hardy en collega’s, waarbij de ontwikkeling van BM B-2-cellen kan worden verdeeld in verschillende fracties (fraction), afhankelijk van hun expressie van B220, CD43, BP-1, CD24, IgM en ^IgD22. Hardy et al., toonden aan dat B220⁺ CD43 BM B-cellen kunnen worden onderverdeeld in vier subsets (Fractie A-C’) op basis van BP-1 en CD24 (30F1) expressie, terwijl B220⁺ CD43^{-(dim to neg) BM B-cellen} kunnen worden opgelost in drie deelverzamelingen (Fractie D-F) op basis van differentiële expressie van IgD en oppervlakte ^IgM23. Fractie A (pre-pro-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1^– CD24 (30F1)^–, Fractie B (vroege pro-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1^– CD24 (30F1)⁺, Fractie C (late pro-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, en Fractie C’ (vroege pre-B-cellen) worden gedefinieerd als BP-1⁺ en CD24high. Verder worden Fractie D (pre-B-cellen) gedefinieerd als B220⁺ CD43^– IgM^{– B-cellen}, en Fractie E (nieuw gegenereerde B-cellen, combinatie van onrijp en overgangscellen) worden gedefinieerd als B220⁺ CD43^– IgM⁺ B-cellen en Fractie F (volwassen, recirculterende B-cellen) worden gedefinieerd als B220high CD43^– IgM⁺ B-cellen. Daarentegen kan de meerderheid van de naïeve B-cellen in de milt worden onderverdeeld in volwassen (B220⁺ CD93^{-) B-cellen} en overgangscellen (T1, T2, T3), afhankelijk van de expressie van CD93, CD23 en IgM. Volwassen B-cellen kunnen worden opgelost in marginale zone- en folliculaire subsets op basis van expressie van IgM en CD21/CD35, en folliculaire subsets kunnen verder worden onderverdeeld in volwassen folliculaire type I en folliculaire type II B celsubsets, afhankelijk van het niveau van hun IgM- en IgD-oppervlakte-expressie24. Deze milt B-celpopulaties drukken voornamelijk Igκ lichte keten uit. Ten slotte zijn B-1 B-celpopulaties, die hun oorsprong vinden in de foetale lever en voornamelijk worden aangetroffen in de peritoneale en pleurale holtes van volwassen muizen, beschreven in de literatuur. Deze peritoneale B-cellen kunnen worden onderscheiden van de eerder beschreven B-2 B-cellen door hun gebrek aan CD23-expressie. Ze worden vervolgens verder onderverdeeld in B-1a- of B-1b-populaties, waarbij de eerste wordt gedefinieerd door de aanwezigheid van CD5 en de laatste door de afwezigheid ^ervan25. B-1 cel voorlopercellen zijn overvloedig aanwezig in de foetale lever, maar worden niet gevonden in volwassen BM. Hoewel B-1a- en B-1b-cellen afkomstig zijn van verschillende voorlopers, zaaien ze beide de peritoneale en pleurale ^holtes24. In tegenstelling tot B-2-cellen zijn B-1-cellen uniek in staat tot zelfvernieuwing en zijn ze verantwoordelijk voor de productie van natuurlijke IgM-antilichamen.

Defecten in de ontwikkeling van B-cellen kunnen zich in veel gevallen voordoen, waaronder tekortkomingen in de componenten van de ^BCR26,27, verstoringen van signaalmoleculen die de BCR-signaalsterkte beïnvloeden14,28,29, of verstoring van cytokines die de overleving van B-cellen ^{moduleren30,31} . Flowcytometrie-analyse van de lymfoïde compartimenten heeft bijgedragen aan de karakterisering van de B-celontwikkelingsblokken bij deze muizen en vele anderen. Een voordeel van flowcytometrische analyse van lymfoïde compartimenten is dat het de mogelijkheid biedt om metingen te doen op individuele cellen verkregen uit levend gedissocieerd weefsel. De beschikbaarheid van reagentia in een steeds groter wordend bereik van fluoroforen maakt de gelijktijdige analyse van meerdere parameters mogelijk en maakt de beoordeling van B-cel heterogeniteit mogelijk. Bovendien vormt de opsomming van B-cellen door flowcytometrische analyse een aanvulling op andere immunologische testen, zoals immunohistochemische methoden die cellokalisatie in lymfoïde organen visualiseren, detectie van circulerende antilichaamniveaus als een maat voor humorale immuniteit, evenals twee fotonmicroscopie om B-celresponsen in reële ruimte en tijd te ^meten32.