三次元運動神経オルガノイド発生

1. 写真リソグラフィによるSU-8金型加工 注:この手順には、有害な化学物質が含まれます。ヒュームフードとPPEを全体に使用してください。 シリコンウェーハ(直径4インチ、厚さ1mm、研磨)をアセトンで洗浄し、窒素ガスで吹きます。その後、180°Cで3分間乾燥させて焼きます。 洗浄されたウエハーにSU-8 2100の3 mLを分配する。 10sのスピンコート機を使用してSU-8をウエハーに均一にコーティングし、300rpm/sの加速度で30sの1500rpmで順次回転し、150μmの厚層のSU-8を得ます。注:シリコンウエハがスピンコーターの中心に配置され、真空によって正しく固定されていることを確認してください。 ホットプレートのウエハーを50°Cで10分間、65°Cで7分間、95°Cで45分間柔らかく焼きます。 マスクアライアにフォトマスク(図1)をセットし、60 sのUV光(365 nm)を露出します。注: 露出時間は、UV ライトの適切な線量で最適化する必要があります。 露光後、ウエハースを65°Cで6分間焼き、ホットプレートで95°Cで13分間焼きます。 軌道シェーカーを使用して撹拌を行い、プロセス中に開発ソリューションを一度変更して、SU-8開発者の10〜20分間のウエハーを開発します。メモ:SU-8の破片が残っている場合、開発時間を延長します。 ウエハをイソプロパノールですすい、窒素ガスでウエハを軽く乾燥させます。 測定顕微鏡で堆積したSU-8の高さを測定し、厚さ約150μmであることを確認します。室温で無期限に保存できます。 2. PDMSマイクロ流体組織培養チップ製造 SU-8堆積ウエハを容器(例えば、15cmプラスチックペトリ皿)に両面テープで固定します。 窒素ガスを使用してウエハからほこりを吹き飛ばします。 シラナ化するには、SU-8堆積ウエハを小さな容器(例えば、35mm皿)と一緒に真空チャンバーに入れます。小さな容器に10 μL(トリデカフルオロ-1,1,2-テトラヒドロコクチル)-1-トリクロロシランを滴下します。SU-8ウエハに直接(トリデカフルオロ-1,1,2-テトラヒドロコクチル)-1-トリクロロシランを適用しないでください。 真空チャンバをしっかりと閉じ、真空ポンプを2時間以上オンにします。 プラスチックカップを取り、シリコーンエラストマー(例えば、シルポット184または同等のシルガード184)と硬化剤を10:1重量比で注ぎます。その後、泡が完全に取り除かれるまで、真空チャンバーでヘラと脱気を使用してよく混ぜます。 所望の厚さ(3-4 mm)にSU-8ウエハと容器にPDMS混合物を注ぎ、泡を除去するために再び脱気します。 PDMSを完全に硬化させるために、60°Cのオーブンで少なくとも3時間焼きます。 冷却後、メスまたはカミソリの刃を使用して、ウエハから硬化したPDMSを遮断する。 組織培養チップの2つのチャンバーを作成するには、直径1.5mmの生検パンチを使用して、2つのコンパートメントが位置する2つの穴を開けます。 培地貯留層を作成するには、別のPDMS混合物(シリコーンエラストマーと硬化剤を10:1重量比で)準備し、新しい10cmペトリ皿に注ぎます。PDMSの厚さの5ミリメートルに注ぐ量を調整します。 PDMSを完全に硬化させるために、60°Cのオーブンで少なくとも3時間焼きます。 PDMSを冷却した後、メスで硬化したPDMSを切り落とし、長方形のリングを得る。 一番下の層を媒体貯留層と接着するには、未硬化PDMSを適用し、組み立てられたPDMS層を焼成します。この結合構造はPDMS組織培養チップをもたらす。 表面からほこりや小さな粒子を除去するために、スコッチテープでPDMS組織培養チップをきれいにします。PDMS組織培養チップは、塵や紫外線から保護されれば室温で保存することができる。 3. 文化の準備 培地注: 特に明記されていない限り、以下に記載されているすべてのメディアを除き、滅菌のためにフィルタリングする必要があります。調製した培地は4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用することができます。 mTeSR Plus培地を準備するには:100 mL mTeSR Plus 5xサプリメントのボトル1本と400mLのmTeSRプラスバサルミディアムのボトル1本を組み合わせます。 KSR培地の100 mLを調製するには:DMEM/F12の85 mLに、ノックアウト血清置換術の15 mL(KSR、15%)、1mLの市販グルタミンサプリメント(1%)を加える1 mL の非必須アミノ酸 (NEAA, 1%) N2培地の100 mLを調製するには:神経基底培地の100 mLに、N2(100x)の1 mL、1 mLの市販グルタミンサプリメント、およびNEAAの1 mLを加える。 250 mLの成熟培地を調製するには:250 mLの神経基底培地に、B27の5 mL(2%)、市販グルタミンサプリメント2.5 mL(1%)、ペニシリン/ストレプトマイシン2.5 mL(1%)を加える。 化合物(レチノイン酸(RA)、SB431542、LDN-193189、SU5402、DAPT、SAG、Y-27632)中の化合物を所望の濃度まで再懸濁する。アリコートを準備し、6ヶ月まで-20°Cで保管してください。以下のストックソリューションが使用されます: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632. コーティング注:熱による基体膜マトリックスの重合を防ぐために、繰り返し凍結融解サイクルを避けてください。可能であれば、あらかじめ冷却されたピペットチップとチューブですべてのコーティング手順を処理します。基底膜マトリックスは、4 °Cで一晩解凍し、前チルドピペットチップとチューブを使用してアリクォートする必要があります。アリコートは-20°Cまたは-80°Cで凍結することができる。 氷上で4°Cで凍結したアリコートを解凍します。アリコートは、コーティング手順中に冷たく保たれるべきである。あらかじめ冷却されたピペットチップを使用して、氷冷DMEM/F12で基膜マトリックスを1:40の比率で希釈します。未使用の希釈基質基質マトリックスは、重合が起こらなかったことを考えると、4°Cで2〜3日間保存することができます。 6ウェルプレートの1ウェルをコーティングするために、基部膜マトリックス/DMEM-F12溶液の1 mLを追加します。 プレートを室温で少なくとも1時間、または一晩4°Cインキュベートします。被覆プレートは4°Cで最大1週間保存できます。 4. iPS細胞のメンテナンス 注:未分化iPS細胞は、mTeSR Plus培地で維持され、このプロトコルの6ウェルプレートに≥90%の合流が観察されるとサブ培養されます。他の培地で培養したiPS細胞に対しては、若干の調整が必要な場合があります。 ステップ 3.2 で前述したように、基質膜マトリックスコーティングされた皿を準備します。 mTeSRプラス培地を完全に吸引する。PBSで一度井戸を洗い、0.5mLのパッジング試薬を加えます( 材料表を参照)。数秒待って、解決策を吸引します。 インキュベーターでプレートを37°Cで5分間、または細胞が丸くなるまでインキュベートします。注: インキュベーション時間は、iPS細胞株と合流性によって異なる場合があります。顕微鏡で定期的に確認し、インキュベーション中の解離時間を確認してください。 mTeSR Plus培地を1 mL追加し、プレートを30~60sタップしてコロニーを取り外します。 新鮮なmTeSRと培地の7 mLでセル懸濁液の1 mLを穏やかに混合します。5回以上ピペットしないでください。 1:8の比率でプレート。通常、ステップ4.5から懸濁液を1 mL加え、MTeSRの1 mLとY-27632(ROCK阻害剤)の5-10 μMを添加した培地を加えます。通過希釈率はiPSCラインに依存します。 5%CO2/37°Cインキュベーターに細胞を入れる。翌日、新鮮なmTeSR Plus培地を追加してY-27632を取り外します。その後、最初は1日おきにメディアを交換し、細胞がより高い合流に達するにつれて毎日変化する。 5. iPS細胞の運動ニューロンへの分化 注: 以下のすべてのオプション (5.2、5.3、および 5.4) は、> 90% 効率で MMO を生成します。 運動ニューロン分化のためのiPSCの通過注: 3D (5.2) または 2D (5.3) のプロトコルで区別を正常に行うことができます。 6ウェルプレートでmTeSR Plus培地で約80%の合流度に達するまで、未分化iPS細胞が増殖することを可能にします。 培地を完全に吸引する。すぐに滅菌PBSで一度井戸を洗浄し、細胞に細胞解離液の0.5 mLを追加します。 インキュベーターでプレートを約2〜3分間インキュベーターでインキュベートするか、細胞が分離して丸くなるまで、ウェルに付着したままにします。 培地1 mLを加え、5 mL血清ピペットを使用して数回上下にピペットを軽く加えます。細胞懸濁液を培地4mLからなる15mLチューブに移します。 200 x g で 3 分間の遠心分離機。 上清を慎重に吸引し、ペレットを乱さずに、Y-27632の10μMを添加した培地の1mLで細胞を再懸濁する。 ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、5.2(3D分化)または5.3(2D分化)に進みます。 3D分化における運動ニューロンスフェロイド(MNS)の形成(「3Dプロトコル」)注: 完全なメディア変更は、日 0 から 12 日の分化 (図 2) から毎日行われます。 ステップ 5.1.7 から 96 ウェル U 底板の iPS 細胞を 40,000 セル/ウェルの 100 μL の mTeSR Plus に 10 μM の Y-27632 を加えてシードします。 翌日、各ウェルを100μLの新鮮な培地に交換します。 0日と1日:培地を吸引し、10 μM SB431542および100 nM LDN-193189を添加したKSR培地(3.1.2)の100 μLに交換します。 2日目と3日目:培地を吸引し、10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RAおよび1 μM SAGを補充したKSR培地100μLに交換します。 4日目と5日目:75%のKSR培地と25%のN2培地(3.1.3)からなる混合培地を準備します。次いで、培地を吸引し、10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、および1 μM SAGを添加した混合培地の100 μLに交換します。 6日目および7日目:50%KSR培地と50%N2培地からなる混合培地を調製する。次に、培地を吸引し、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM レチノイン酸、1 μM SAGを添加した混合培地100μLに交換します。 8日目および9日目:25%KSR培地と75%N2培地からなる混合培地を調製する。次に、吸引培養培地を5μM DAPT、5μM SU5402、1μM RAおよび1 μM SAGで補充した混合培地100μLに交換します。 10日と11日:培地を5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、1 μM SAGで補ったN2培地100μlに交換してください。 12日目:MNsを組織培養チップに移す(ステップ6)、または20ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)を添加した成熟培地(3.1.4)の100 μLで培地を交換します。注:MNSは12日目から19日目まで組織培養チップに移すことができます。転写されていないスフェロイドは、20 ng/mL BDNFを補充した成熟培地において96ウェルU底板で培養して20ng/mL BDNFを移送するまで培養しておくべきである。 (代替オプション)2D差別化と3D MNSへの移行(「2Dプロトコル」) あらかじめコーティングした12ウェルプレートからコーティング溶液を吸引する。 ステップ 5.1.7 の iPS 細胞に、Y-27632 の 10 μM を持つ mTeSR Plus 培地のウェルあたり 100,000 ~ 200,000 個のセルの密度でシードします。注:未分化iPS細胞をY-27632なしでmTeSR Plus培地で培養し続け、細胞が次のステップ(5.3.3)に対して疎すぎる場合は、細胞が80%の合流度に達するまで続けてください。 0日および1日:吸引培養培地を1mLのKSR培地(3.1.2)に10μM SB431542および100 nM LDN-193189を添加して交換する。 2日目と3日目:吸引培養培地を10μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RAおよび1 μM SAGで補充したKSR培地1mLに交換してください。 4日目と5日目:75%のKSR培地と25%のN2培地(3.1.3)からなる混合培地を準備します。吸引培養培地と10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、および1 μM SAGを添加した混合培地1 mLに交換します。 6日目および7日目:50%KSR培地と50%N2培地からなる混合培地を調製する。培地を吸引し、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μMレチノイン酸、1 μM SAGを添加した混合培地1 mLに交換してください。 8日目および9日目:25%KSR培地と75%N2培地からなる混合培地を調製する。培地を吸引し、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、1 μM SAGを添加した混合培地の1 mLに交換します。 10日と11日:培地を5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、1 μM SAGで補ったN2培地1 mLに交換してください。 12日目:分化培地を吸引し、PBSで一度素早く洗浄し、細胞剥離培地を0.5mL加える。プレートを37°Cインキュベーターに1~3分間(例えば、トリプルエクスプレスを使用する場合)または20〜30分(例えば、アキュターゼを使用する場合)に入れる。 P1000ピペットを使用して、細胞を穏やかに収集し、新鮮な成熟培地と遠心分離機を200 x g で3分間、15 mLの円錐形チューブに移します。細胞が塊状の場合は、数回上下にピペットを軽くします。これは、細胞に損傷を引き起こす可能性がありますので、あまりにも多くのピペットしないでください. 上清を吸引し、20 ng/mL BDNFを添加した成熟培地(3.1.4)の1mLでペレットを再懸濁する。 ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。BDNFの20 ng /mlを添加した成熟培地の96ウェルU底板でウェルあたり10,000-40,000細胞で細胞をプレートします。初期シード密度は、iPS細胞株や細胞の状態に応じて最適化し、組織培養チップに導入した際に回転楕円体の直径が800~900μmになるようにする必要があります。ほとんどの場合、最初はウェルあたり 20,000 個のセルから開始し、サイズに応じてセルの数を増減します。 細胞が滑らかなエッジを有する回転楕円体を形成するまで、さらに3〜10日間培養する。 (代替オプション): 運動ニューロンからのMNS形成注:市販のヒトiPS細胞由来運動ニューロン( 材料表を参照)は、ヒトiPS細胞と区別する代わりにMMOを生成するために使用することができます。 運動ニューロンのクライボシャルを解凍した後、すぐに運動ニューロン培地の9 mLで細胞を再中断する。室温で5分間 400×g でスピンダウンします。 上清を吸引し、運動ニューロン培地でペレットを再懸濁する。 MNS を生成するには、上記と同じ手順 (5.3.12- 5.3.13) を実行します。 6. 運動神経オルガノイド(MNO)形成のための組織培養チップの調製 ペトリ皿に70%エタノールを少なくとも1時間浸漬して(ステップ2.13から)調製したPDMSを殺菌する。注: 以下の手順はすべて、バイオセーフティキャビネットで操作する必要があります。 ペトリ皿に70%エタノールに浸漬して顕微鏡ガラス(76 x 52mm)を殺菌します。 顕微鏡ガラスの乾燥工程中、PDMS装置を半湿式顕微鏡ガラスの上に置き、一晩待って完全に乾かします。完全に乾燥したら、PDMS装置はガラスに付着する必要があります。注:この結合は、組織採取のための培養後に顕微鏡ガラスからPDMSデバイスを取り外すことを可能にするために永久的ではありません。酸素プラズマによる永久結合は、PDMSとガラスの接着を最大化するために使用することができますが、それはチップと組織の収集の分解を禁止します。 マイクロチャネルの表面をPDMSデバイスと顕微鏡ガラスに30μLのDMEM/F12(1:40)の希釈基質膜マトリックスでコーティングし、チャネルの入口の片側に液滴を作り、入口の反対側からピペットまたは吸引ポンプで溶液を吸引する(図3A)。泡の汚染を避けるために溶液の過度の量を吸引しないでください。 次いで、PDMS装置を2次容器(例えば、ペトリ皿)に室温または4°Cで一晩で1時間インキュベートする。 7. 運動神経オルガノイド(MNO)形成 コーティング溶液を、使用直前に20 ng/mLのBDNFを補充した成熟培地の150 μLをあらかじめ温めたものに交換してください。 次に、ステップ 5.2.9 または 5.3.13 の MNS を、ワイドボアチップ付きのマイクロピペットを使用してマイクロチャネルの入口に配置します。MNSは、重力によってデバイスの底部に自然に落ち着くことができます。MNSを注入する際に圧力をかけすぎないでください(図3B)。注:MNSが組織培養チップの穴の側壁に貼り付いている場合は、入口の別の側から溶液をそっと吸引します。 小さなリザーバー(例えば、15 mLチューブのキャップ)に滅菌水を充填し、培地の蒸発を防ぐために、組織培養チップの近くに置きます。その後、5%CO2/37°Cインキュベーターに入れ。 培地変化の場合、培地貯留部の中心から排出された培養培地を吸引する(図3C)。すべての培地と組織を吸引しないでください。 新鮮な成熟培地(BDNF)をそっと加えます。培地は2〜3日ごとに変更する必要があります。培養中は、いつでも培養液を乾燥させないでください。軸索はMNSからチャネルに成長し、2〜3週間で自発的に単一のバンドルに組み立てられ、MNOの形成をもたらす。MNOは、デバイス内で1ヶ月以上培養することができます。 8. MNOの下流解析 全マウント免疫染色 装置または皿を化学発煙フードに持って来なさい。8%パラホルムアルデヒド(PFA)のほぼ等量を培地に添加してMNOを固定し、最終濃度の4%PFAを達成します。ガラスからPDMS装置を剥がし、室温で15〜20分間インキュベートします。 PBSでMNOを洗い、PBS洗浄2倍を繰り返します。 PBSでトリトンX-100の0.2%でMNOを透過させ、室温で5分間インキュベートします。 PBSでMNOを洗い、PBS洗浄2倍を繰り返します。次いで、1%BSAを含むPBSでMNOをブロックし、室温で1時間インキュベートする。 0.1%BSAを含有するPBSの希薄な一次抗体と、一次抗体溶液を一晩4°CでインキュベートMNO。 Pbs で MNO を 3 回洗います。 PBSで希釈された二次抗体は、0.1%BSAを有し、MNOを室温で2時間用の二次抗体溶液でインキュベートする。その後、PbsでMNOを3回洗います。 0.2%トリトン-Xを含むPBSのHoechstでMNOを染色し、室温で5分間インキュベートします。 MNOをPBSで3回洗います。免疫染色されたMNOは、蛍光または共焦点レーザー顕微鏡でイメージングする準備ができています。 軸索束の組織採取と分離 10 cmのペトリ皿に10 mLのHBSS溶液を注ぎます。次に、PDMSデバイス全体をHBSSソリューションに浸します。 顕微鏡のガラスからPDMSを実体顕微鏡で慎重に取り外します。組織がPDMSデバイスに貼り付ける場合は、ピペットを使用して穴の上から1mLのHBSS溶液を静かに塗布します。 PDMSから組織が外れたら、顕微鏡ガラスに1mLのHBSSを塗布して、顕微鏡ガラスからPDMSを完全に取り外します。 回転楕円体から軸索束を分離するには、顕微鏡下で外科用ナイフまたはツイーザーで軸索束を切断する。移行した細胞の汚染を避けるために、軸索束をスフェロイドから少し離れた場所(>1 mm)カットします。 分離した軸索束およびスフェロイドは、RT-PCR、RNA-seq、ウェスタンブロッティングなどの様々なダウンストリーム解析により、さらに解析することができます。 PDMS カルチャ チップを再利用できます。培養チップを洗浄するには、蒸留水内の培養チップを15分間超音波処理します。その後、1%の洗剤を加えた蒸留水でチップを超音波処理します。蒸留水で培養チップを5回洗います。 カルシウムイメージング注:神経活動は、組織培養チップから組織を収集する前後のカルシウム指標(8.2から)で測定することができます。プロトコルは、特定の商用キットに基づいています ( 資料一覧を参照)。あるいは、他のカルシウムイメージングキットまたは同等の方法を使用することができます。 3回のPBS(Ca2+とMg2+なし)でMNOを洗浄します。 記録媒体(20 mM HEPES、115 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.8 mM MgCl 2、1.8 mM、CaCl2、13.8mMグルコース)を37°Cで30〜60分間、Fluo-4AMの5μMでインキュベートします。 Pluronic F-127の0.01-0.02%を添加すると、フルー-4 AMの細胞への取り込みが助けになります。 次いで、(Ca2+とMg2+なし)で組織を洗浄し、記録媒体に交換します。 GFP/Cy2フィルターセットを用いた蛍光顕微鏡を用いて、タイムラプス画像を取得します。フレームあたり 20 ミリ秒未満の露出時間を設定します。 取得したムービーファイルをイメージJを使用して画像シーケンスとして開きます。 カラー CCD または CMOS カメラを使用している場合は、RGB 画像を 16 ビットモノ画像に変換します。開く “分析 | ツール|ROI マネージャ」 をクリックし、対象地域を描画し、[追加] をクリックします。[マルチメジャー] をクリックします。結果には、複数のROIの強度の平均が表示されます。 一般的なデータ解析ソフトウェアを使用して、信号強度の変化をプロットします。 多電極アレイによる神経活動の測定メモ:運動ニューロンの活動は、多電極アレイ(MEA)によって捉えることができます。 MNOを作成した後、それを膜マトリックスに転写したMEAプローブに移します。電極上に組織を配置します。 200 μLの成熟培地を加え、37°Cで1-2 hをインキュベートして、MNOを表面に取り付けます。 メディアを記録媒体(8.3.2)に交換してください。必要に応じて、MNO の上にメッシュと重量を配置して、電極との契約を増やします。 MEAプローブを記録ヘッドステージに設定します。MEAプローブとヘッドステージの接触を70%エタノールで拭きます。 MEAの製造業者の指示に従って、神経活動の記録を開始します。