Dreidimensionale Motornerve Organoid Generation

1. SU-8 Formherstellung durch Photolithographie HINWEIS: Bei diesem Verfahren handelt es sich um gefährliche Chemikalien. Verwenden Sie Rauchhaube und PSA durchgängig. Den Siliziumwafer (4 Zoll Durchmesser, 1 mm Dicke, poliert) mit Aceton reinigen und mit Stickstoffgas blasen. Dann bei 180 °C für 3 min zum Trocknen backen. Geben Sie 3 ml SU-8 2100 auf einen gereinigten Wafer auf. Die SU-8 gleichmäßig auf dem Wafer mit einem Spincoater bei 500 U/min für 10 s beschichten und dann nacheinander bei 1500 U/min für 30 s mit einer Beschleunigung von 300 U/m/s drehen, um eine 150 m dicke Schicht SU-8 zu erhalten.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Siliziumwafer in der Mitte des Spincoaters positioniert und durch Vakuum korrekt fixiert ist. Den Wafer auf der Kochplatte bei 50 °C für 10 min, bei 65 °C 7 min und bei 95 °C für 45 min weich backen. Stellen Sie die Fotomaske (Abbildung 1) auf den Maskenausrichter ein und setzen Sie UV-Licht (365 nm) für 60 s aus.HINWEIS: Die Belichtungszeit muss durch eine angemessene Dosis UV-Licht optimiert werden. Nach der Belichtung den Wafer bei 65 °C für 6 min und bei 95 °C für 13 min auf der Kochplatte backen. Entwickeln Sie den Wafer für 10-20 min in SU-8 Entwickler mit Agitation mit einem Orbital-Shaker, die Entwicklung der Lösung einmal während des Prozesses ändern.HINWEIS: Verlängern Sie die Entwicklungszeit, wenn die Trümmer von SU-8 verbleiben. Spülen Sie den Wafer in Isopropanol und trocknen Sie den Wafer vorsichtig mit Stickstoffgas. Messen Sie die Höhe des abgelagerten SU-8 mit einem Messmikroskop und stellen Sie sicher, dass er ca. 150 m dick ist. Es kann auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden. 2. PDMS mikrofluidische Gewebekultur Chip-Fertigung Befestigen Sie den SU-8-abgelagerten Wafer mit doppeltem Seitenband in einem Behälter (z. B. 15 cm Kunststoff Petrischale). Blasen Sie den Staub mit Stickstoffgas vom Wafer. Zum Silanisieren den SU-8-abgelagerten Wafer zusammen mit einem kleinen Behälter (z.B. 35 mm Schale) in eine Vakuumkammer geben. Lassen Sie 10 l (Tridecafluor-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorsilan in den kleinen Behälter fallen. Das (Tridecafluor-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorsilan nicht direkt auf SU-8-Wafer auftragen. Schließen Sie die Vakuumkammer fest und schalten Sie eine Vakuumpumpe für mindestens 2 h ein. Nehmen Sie einen Plastikbecher und gießen Sie das Silikonelastomer (z.B. Silpot 184 oder entsprechend Sylgard 184) und das Härtungsmittel mit einem Gewichtsverhältnis von 10:1. Dann gut mit einem Spachtel und Degas in der Vakuumkammer mischen, bis Blasen vollständig entfernt werden. Gießen Sie das PDMS-Gemisch mit dem SU-8-Wafer auf die gewünschte Dicke (3-4 mm) in den Behälter und entgasen Sie erneut, um Blasen zu entfernen. Backen Sie das PDMS im Ofen bei 60 °C für mindestens 3 h, um das PDMS vollständig auszuhärten. Nach dem Abkühlen das ausgehärtete PDMS mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge vom Wafer abschneiden. Um die beiden Kammern des Gewebekulturchips zu erstellen, schlagen Sie zwei Löcher, in denen sich die beiden Fächer befinden, indem Sie einen Biopsie-Punch mit einem Durchmesser von 1,5 mm verwenden. Um ein mittleres Reservoir zu erstellen, bereiten Sie eine weitere PDMS-Mischung (Silikonelastomer und das Härtungsmittel bei einem Gewichtsverhältnis von 10:1) vor und gießen Sie es in eine neue 10 cm Petrischale. Stellen Sie das Gießvolumen auf 5 mm Dicke von PDMS ein. Backen Sie das PDMS im Ofen bei 60 °C für mindestens 3 h, um das PDMS vollständig auszuhärten. Nach dem Abkühlen des PDMS schneiden Sie das ausgehärtete PDMS mit einem Skalpell ab, um einen rechteckigen Ring zu erhalten. Verkleben Sie die untere Schicht mit dem medium Reservoir, indem Sie ungehärtetes PDMS zwischen ihnen auftragen und die montierten PDMS-Schichten backen. Diese gebundene Struktur führt zum PDMS-Gewebekulturchip. Reinigen Sie den PDMS-Gewebekulturchip mit einem Scotch-Tape, um Staub und kleine Partikel von der Oberfläche zu entfernen. PDMS Gewebekulturchips können bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie vor Staub und UV geschützt sind. 3. Vorbereitung der Kultur KulturmediumHINWEIS: Alle unten aufgeführten Medien sollten für die Sterilisation gefiltert werden, sofern nicht anders angegeben. Vorbereitete Medien können bei 4 °C gelagert und innerhalb eines Monats verwendet werden. Zur Zubereitung von mTeSR Plus Medium: Kombinieren Sie eine Flasche 100 ml mTeSR Plus 5x Ergänzung mit einer Flasche 400 ml mTeSR Plus Basal Medium. Zur Vorbereitung von 100 ml KSR-Medium: In 85 ml DMEM/F12 15 ml Knockout-Serumersatz (KSR, 15%), 1 ml kommerzielleglutamin-Ergänzung (1%) hinzufügen und 1 ml nicht essentielle Aminosäure (NEAA, 1%). Zur Vorbereitung 100 ml N2 Medium: In 100 ml neurobasalen Mediums 1 ml N2 (100x), 1 ml kommerzielle Glutaminergänzung und 1 ml NEAA hinzufügen. Zur Vorbereitung von 250 ml Reifungsmedium: In 250 ml neurobasalen Mediums 5 ml B27 (2%), 2,5 ml kommerzielleGlutaminergänzung (1%) und 2,5 ml Penicillin/Streptomycin (1%) hinzufügen. Setzen Sie die Verbindungen (Retinosäure (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) in der Zellkultur-Grade-DMSO auf die gewünschte Konzentration aus. Aliquots vorbereiten und bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern. Folgende Lagerlösungen kommen zum Einsatz: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 m LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632. BeschichtungHINWEIS: Um eine Polymerisation der Kellermembranmatrix durch Hitze zu verhindern, vermeiden Sie sich wiederholende Gefrier-Tau-Zyklen. Behandeln Sie alle Beschichtungsverfahren mit vorgekühlten Pipettenspitzen und Rohren, wenn möglich. Die Kellermembranmatrix sollte über Nacht bei 4 °C aufgetaut und mit vorgekühlten Pipettenspitzen und -rohren aliquotediert werden. Die Aliquots können bei -20 °C oder -80 °C eingefroren werden. Das gefrorene Aliquot bei 4°C auf Eis auftauen. Das Aliquot sollte während des Beschichtungsvorgangs kalt gehalten werden. Mit einer vorgekühlten Pipettenspitze die Kellermembranmatrix mit eiskaltem DMEM/F12 im Verhältnis 1:40 verdünnen. Nicht verwendete verdünnte Kellermembranmatrix kann bei 4 °C für 2-3 Tage gelagert werden, da keine Polymerisation aufgetreten ist. Fügen Sie 1 ml der Kellermembranmatrix/DMEM-F12 Lösung hinzu, um einen Brunnen der 6 Wellplatte zu beschichten. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens eine Stunde oder 4 °C über Nacht. Beschichtete Platten können maximal eine Woche bei 4 °C gelagert werden. 4. Wartung von iPS-Zellen HINWEIS: Undifferenzierte iPS-Zellen werden in mTeSR Plus-Medium und Subkulturbeibehalten beibehalten, wenn die Konfluenz von ≥ 90 % in einer 6-Well-Platte in diesem Protokoll beobachtet wird. Für iPS-Zellen, die in anderen Medien kultiviert werden, sind möglicherweise geringfügige Anpassungen erforderlich. Bereiten Sie Kellermembran-Matrix-beschichtete Gerichte vor, wie bereits in Schritt 3.2 erwähnt. Das mTeSR Plus Medium vollständig aspirieren. Waschen Sie den Brunnen einmal mit PBS und fügen Sie 0,5 ml Passaging-Reagenz hinzu (siehe Tabelle der Materialien). Warten Sie einige Sekunden und saugen Sie die Lösung an. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C im Inkubator für 5 min oder bis die Zellen rund werden.HINWEIS: Die Inkubationszeit kann zwischen verschiedenen iPS-Zelllinien und der Konfluenz variieren. Bitte überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop, um die Dissoziationszeit während der Inkubation zu bestimmen. Fügen Sie 1 ml mTeSR Plus Medium hinzu und tippen Sie auf die Platte für 30-60 s, um die Kolonien zu lösen. 1 ml der Zellsuspensionslösung mit 7 ml frischem mTeSR plus Medium vorsichtig mischen. Pipette nicht mehr als 5 Mal. Platte im Verhältnis 1:8. In der Regel 1 ml der Suspension aus Schritt 4.5 hinzufügen und 1 ml mTeSR plus Medien hinzufügen, ergänzt durch 5-10 ‘M y-27632 (ROCK-Hemmer). Das Verdünnungsverhältnis der Passage hängt von der iPSC-Leitung ab. Legen Sie die Zelle in einen 5% CO2/37 °C Inkubator. Entfernen Sie am nächsten Tag Y-27632, indem Sie ein frisches mTeSR Plus-Medium hinzufügen. Danach wechseln Sie die Medien zunächst jeden zweiten Tag und jeden Tag, wenn die Zelle eine höhere Konfluenz erreicht. 5. Differenzierung von iPS-Zellen in motorische Neuronen HINWEIS: Alle optionen unten (5.2, 5.3 und 5.4) erzeugen MNOs mit > 90% Effizienz. Passaging iPSC zur motorischen NeurondifferenzierungHINWEIS: Die Differenzierung kann entweder in 3D-Protokollen (5.2) oder 2D (5.3) erfolgreich durchgeführt werden. Lassen Sie undifferenzierte iPS-Zellen wachsen, bis sie eine Konfluenz von ca. 80% in mTeSR Plus Medium in einer 6-Well-Platte erreicht. Das Medium vollständig ansaugen. Waschen Sie den Brunnen sofort einmal mit sterilem PBS und fügen Sie 0,5 ml Zelldissoziationslösung in die Zellen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C im Inkubator für ca. 2-3 min, oder bis die Zellen abgetrennt und rund werden, aber am Brunnen befestigt bleiben. Mit einer 5 ml serologischen Pipette 1 ml Medium und sanfte Pipette ein paar Mal nach oben und unten geben. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Rohr, das aus 4 ml des Mediums besteht. Zentrifuge bei 200 x g für 3 min. Den Überstand vorsichtig ansaugen, das Pellet ungestört lassen und die Zellen in 1 ml des Mediums, ergänzt durch 10 M Y-27632, wieder aussetzen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fahren Sie entweder zu 5,2 (3D-Differenzierung) oder 5,3 (2D-Differenzierung). Bildung von Motorneuronsphäroid (MNS) in 3D-Differenzierung (“3D-Protokoll”)HINWEIS: Eine vollständige mittlere Änderung erfolgt täglich ab den Tagen 0-12 der Differenzierung (Abbildung 2). Säen Sie die iPS-Zellen von Schritt 5.1.7 bis zu einer 96 Well U Bodenplatte bei 40.000 Zellen/Well in 100 l mTeSR Plus, ergänzt um 10 m Y-27632. Am nächsten Tag jeden Brunnen durch 100 l des frischen Mediums ersetzen. An den Tagen 0 und 1: Aspirieren Sie das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch 100 l KSR-Medium (3.1.2), ergänzt durch 10 m SB431542 und 100 nM LDN-193189. An den Tagen 2 und 3: Saugen Sie das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch 100 l KSR-Medium, ergänzt durch 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 ‘M DAPT, 5 ‘M SU5402, 1’M RA und 1 ‘M SAG. An den Tagen 4 und 5: Bereiten Sie ein Mischmedium vor, das aus 75% KSR medium und 25% N2 medium (3.1.3) besteht. Dann saugen Sie das Kulturmedium an und ersetzen Sie es durch 100 l Mischmedium, ergänzt durch 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 ‘M DAPT, 5’M SU5402, 1’M RA und 1’M SAG. An den Tagen 6 und 7: Bereiten Sie ein Mischmedium vor, das aus 50% KSR medium und 50% N2 medium besteht. Dann, Aspirat-Kultur-Medium und ersetzen Sie es durch 100 l gemischtes Medium ergänzt mit 5 M DAPT, 5 M SU5402, 1 M Retinsäure und 1 M SAG. An den Tagen 8 und 9: Bereiten Sie ein Mischmedium vor, das aus 25% KSR medium und 75% N2 medium besteht. Dann, Aspirat-Kultur-Medium und ersetzen sie mit 100 l gemischtes Medium ergänzt mit 5 M DAPT, 5 M SU5402, 1 M RA und 1 M SAG. An den Tagen 10 und 11: Ersetzen Sie das Medium durch 100 l N2-Medium, ergänzt durch 5 M DAPT, 5 M SU5402, 1 M RA und 1 M SAG. Am 12. Tag: Übertragen Sie die MNs in den Gewebekulturchip (Schritt 6) oder ersetzen Sie das Medium durch 100 l des Reifungsmediums (3.1.4), ergänzt durch den 20 ng/mL-neurotrophen Faktor (BDNF).HINWEIS: Das MNS kann ab Tag 12 bis 19 auf den Gewebekulturchip übertragen werden. Sphäroide, die nicht übertragen werden, sollten bis zur Übertragung in 96 Well U Bodenplatten im Reifungsmedium kultiviert gehalten werden, ergänzt mit 20 ng/mL BDNF. (Alternative Option) 2D-Differenzierung und Übergang zu 3D-MNS (“2D-Protokoll”) Saugen Sie die Beschichtungslösung aus einer vorbeschichteten 12-Well-Platte. Säen Sie die iPS-Zellen aus Schritt 5.1.7 mit einer Dichte von 100.000 – 200.000 Zellen pro Brunnen in mTeSR Plus Medium mit 10 m Y-27632.HINWEIS: Die undifferenzierte iPS-Zellen in mTeSR Plus-Medium ohne Y-27632 weiter kultivieren, bis die Zellen 80 % Konfluenz erreichen, wenn die Zellen für den nächsten Schritt zu spärlich sind (5.3.3). An den Tagen 0 und 1: Saugkulturmedium und ersetzen durch 1 ml KSR-Medium (3.1.2), ergänzt durch 10 M SB431542 und 100 nM LDN-193189. An den Tagen 2 und 3: Saugkulturmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml KSR-Medium, ergänzt durch 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 ‘M DAPT, 5’M SU5402, 1’M RA und 1 ‘M SAG. An den Tagen 4 und 5: Bereiten Sie ein Mischmedium vor, das aus 75% KSR medium und 25% N2 medium (3.1.3) besteht. Aspiratkulturmedium und ersetzen durch 1 ml Mischmedium, ergänzt durch 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 m DAPT, 5 m SU5402, 1 M RA und 1 M SAG. An den Tagen 6 und 7: Bereiten Sie ein Mischmedium vor, das aus 50% KSR medium und 50% N2 medium besteht. Aspirieren Sie das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml Mischmedium, ergänzt durch 5 M DAPT, 5 M SU5402, 1 M Retinsäure und 1 m SAG. An den Tagen 8 und 9: Bereiten Sie ein Mischmedium vor, das aus 25% KSR medium und 75% N2 medium besteht. Aspirieren Sie das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml des Mischmediums, ergänzt durch 5 M DAPT, 5 M SU5402, 1 M RA und 1 M SAG. An den Tagen 10 und 11: Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml N2-Medium, ergänzt durch 5 M DAPT, 5 M SU5402, 1 M RA und 1 M SAG. An Tag 12: Das Differenzierungsmedium ansaugen, einmal mit PBS gut waschen und 0,5 ml des Zellablösungsmediums hinzufügen. Legen Sie die Platte in einen 37 °C-Inkubator für 1-3 min (z. B. bei Verwendung von TrypLE Express) oder 20-30 min (z. B. bei Anwendung von Accutase). Mit einer P1000 Pipette die Zellen vorsichtig sammeln und die Zellen in ein 15 ml konisches Rohr mit frischem Reifungsmedium und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min übertragen. Wenn Zellen klumpig sind, pipette ein paar Mal sanft nach oben und unten. Pipette nicht zu viel, da dies Schäden an den Zellen verursachen kann. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml Reifungsmedium (3.1.4) mit 20 ng/mL BDNF ergänzt auf. Zählen Sie die Zelle mit einem Hämozytometer. Die Zellen bei 10.000-40.000 Zellen pro Brunnen in einer 96 well U Bodenplatte im Reifungsmedium mit 20 ng/ml BDNF ergänzt. Die anfängliche Saatdichte sollte in Abhängigkeit von der iPS-Zelllinie und dem Zustand der Zellen optimiert werden, so dass der Durchmesser des Sphäroids bei der Einweinung in den Gewebekulturchip 800-900 m beträgt. In den meisten Fällen beginnen Sie zunächst bei 20.000 Zellen pro Brunnen und erhöhen oder verringern sie dann die Anzahl der Zellen entsprechend der Größe. Kultur für weitere 3-10 Tage, bis die Zellen ein Sphäroid mit einer glatten Kante bilden. (Alternative Option): MNS-Bildung aus motorischen NeuronenHINWEIS: Kommerziell erhältliche menschliche iPS-Zell-abgeleitete motorische Neuronen (siehe Materialtabelle) können verwendet werden, um MNOs zu generieren, anstatt sich von menschlichen iPS-Zellen zu unterscheiden. Nach dem Auftauen der Kryovial der motorischen Neuronen, schnell die Zellen mit 9 ml des motorischen Neuronen Medium sausen. Drehen Sie bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit dem Motorneuronmedium wieder auf. Führen Sie die gleichen Schritte wie oben (5.3.12- 5.3.13) aus, um MNSs zu erstellen. 6. Vorbereitung des Gewebekulturchips zur Motornervenorganoidbildung (MNO) Sterilisieren Sie das vorbereitete PDMS (ab Schritt 2.13), indem Sie es mindestens 1 h in 70% Ethanol in die Petrischale eintauchen.HINWEIS: Alle folgenden Schritte sollten in einem Biosicherheitsschrank manipuliert werden. Sterilisieren Sie das Mikroskopglas (76 x 52 mm), indem Sie es in 70% Ethanol in die Petrischale eintauchen. Während des Trocknungsprozesses des Mikroskopglases das PDMS-Gerät auf das halb nasses Mikroskopglas legen und durch Warten über Nacht vollständig trocknen lassen. Nach dem vollständigen Trocknen sollte das PDMS-Gerät am Glas haften.HINWEIS: Diese Verklebung ist nicht dauerhaft, um das Lösen der PDMS-Geräte aus dem Mikroskopglas nach der Kultur für die Gewebesammlung zu ermöglichen. Die permanente Verklebung durch Sauerstoffplasma kann verwendet werden, um die Haftung zwischen PDMS und Glas zu maximieren, aber es würde die Demontage der Chips und der Gewebesammlung verbieten. Beschichten Sie die Oberfläche des Mikrokanals in PDMS-Gerät und Mikroskopglas mit 30 l verdünnter Kellermembranmatrix in DMEM/F12 (1:40), indem Sie einen Tröpfchen auf einer Seite des Kanaleinlasses anlegen und dann die Lösung von der anderen Seite des Einlasses mit einer Pipette oder Saugpumpe ansaugen (Abbildung 3A). Nicht zu viel Lösungsvolumen ansaugen, um Blasenkontamination zu vermeiden. Dann inkubieren Sie das PDMS-Gerät für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C in einem Sekundärbehälter (z.B. Petrischale). 7. Motornervenorganoid (MNO) Bildung Ersetzen Sie die Beschichtungslösung durch vorgewärmte 150 l Reifungsmedium, ergänzt durch 20 ng/ml BDNF kurz vor Gebrauch. Legen Sie dann das MNS von Schritt 5.2.9 oder 5.3.13 mit einer Mikropipette mit einer Breitbohrspitze in den Einlass des Mikrokanals. MNS kann sich durch Schwerkraft spontan am Boden des Geräts niederlassen. Wenden Sie beim Einspritzen des MNS nicht zu viel Druck auf (Abbildung 3B).HINWEIS: Wenn das MNS an der Seitenwand eines Lochs in einem Gewebekulturchip klebt, saugen Sie die Lösung vorsichtig von einer anderen Seite des Einlasses an. Füllen Sie ein kleines Reservoir (z. B. eine Kappe von 15 ml Rohr) mit sterilem Wasser und legen Sie es in der Nähe des Gewebekulturchips in den Sekundärbehälter, um eine mittlere Verdunstung zu verhindern. Dann legen Sie es in einen 5% CO2/37 °C Inkubator. Für eine mittlere Veränderung, aspirieren Sie das erschöpfte Kulturmedium aus der Mitte des mittleren Reservoirs (Abbildung 3C). Besaugen Sie nicht das gesamte Medium und das Gewebe. Fügen Sie vorsichtig frisches Reifungsmedium (mit BDNF) hinzu. Das Medium sollte alle 2-3 Tage gewechselt werden. Trocknen Sie das Kulturmedium zu keinem Zeitpunkt während der Kultur. Axone wachsen von einem MNS in den Kanal und fügen sich spontan in 2-3 Wochen zu einem einzigen Bündel zusammen, was zur Bildung eines MNO führt. MNO kann für mehr als 1 Monat im Gerät kultiviert werden. 8. Nachgelagerte Analyse von MNO Ganzkörper-Immunostainierung Bringen Sie das Gerät oder Geschirr zu einer chemischen Rauchhaube. Fixieren Sie MNO, indem Sie dem Medium ungefähr ein ungefähres Volumen von 8 % Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen, um eine Endkonzentration von 4 % PFA zu erreichen. Das PDMS-Gerät aus dem Glas abziehen und 15-20 min bei Raumtemperatur brüten. Waschen Sie den MNO mit PBS und wiederholen Sie dann PBS Waschen 2x. Permeabilisieren Sie die MNO mit 0,2% Triton X-100 in PBS und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie den MNO mit PBS und wiederholen Sie dann PBS Waschen 2x. Blockieren Sie dann das MNO mit PBS, das 1% BSA enthält, und brüten sie 1 h bei Raumtemperatur. Primäre Antikörper in PBS mit 0,1% BSA verdünnen und MNO mit der primären Antikörperlösung über Nacht bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie den MNO dreimal mit PBS. Sekundärantikörper in PBS mit 0,1% BSA verdünnen und MNO mit der Sekundärantikörperlösung für 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Dann waschen Sie die MNO dreimal mit PBS. Beflecken Sie das MNO mit Hoechst in PBS mit 0,2% Triton-X und brüten sie 5 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie den MNO dreimal mit PBS. Das immunbefleckte MNO ist bereit für die Bildgebung mit fluoreszierenden oder konfokalen Lasermikroskopen. Gewebesammlung und Isolierung des Axonbündels 10 ml HBSS-Lösung in eine 10 cm Petrischale gießen. Tauchen Sie dann das gesamte PDMS-Gerät in die HBSS-Lösung ein. Lösen Sie das PDMS vorsichtig vom Mikroskopglas unter einem Stereomikroskop. Wenn das Gewebe am PDMS-Gerät klebt, tragen Sie vorsichtig 1 ml HBSS-Lösung von der Oberseite des Lochs mit einer Pipette auf. Sobald das Gewebe vom PDMS abkommt, tragen Sie vorsichtig 1 ml HBSS auf das Mikroskopglas auf, um das PDMS vollständig vom Mikroskopglas zu lösen. Um ein Axonbündel von einem Sphäroid zu isolieren, schneiden Sie das Axonbündel mit einem chirurgischen Messer oder einer Pinzette unter das Mikroskop. Schneiden Sie das Axonbündel etwas weit vom Sphäroid ab, um eine Kontamination der migrierten Zellen zu vermeiden. Isolierte Axonbündel und Sphäroide können durch verschiedene nachgeschaltete Analysen wie RT-PCR, RNA-seq und Western Blotting weiter analysiert werden. Der PDMS-Kulturchip kann wiederverwendet werden. Um den Kulturchip zu reinigen, beschallen Sie den Kulturchip in destilliertem Wasser für 15 min. Dann beschallen Sie den Chip in destilliertem Wasser, ergänzt mit 1% Reinigungsmittel. Waschen Sie den Kulturchip mit destilliertem Wasser 5 mal. Calcium-BildgebungHINWEIS: Die neuronale Aktivität kann mit Kalziumindikator sowohl vor als auch nach der Entnahme von Gewebe aus dem Gewebekulturchip (ab 8.2) gemessen werden. Das Protokoll basiert auf einem bestimmten kommerziellen Kit (siehe Tabelle der Materialien). Alternativ können auch andere Calcium-Bildgebungskits oder gleichwertige Methoden verwendet werden. Waschen Sie den MNO dreimal mit PBS (ohne Ca2+ und Mg2+). Inkubieren Sie das Gewebe mit 5 m Fluo-4AM im Aufnahmemedium (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgCl2, 1,8 mM, CaCl2, 13,8 mM Glukose) für 30-60 min bei 37 °C. Eine Zugabe von 0,01-0,02 % von Pluronic F-127 kann die Aufnahme von Fluo-4 AM in die Zellen unterstützen. Dann waschen Sie das Gewebe mit PBS (ohne Ca2+ und Mg2+)und ersetzen Sie es durch Aufnahmemedium. Erfassen Sie Zeitrafferbilder mit fluoreszierender Mikroskopie mit einem GFP/Cy2-Filtersatz. Stellen Sie die Belichtungszeit weniger als 20 ms pro Frame ein. Öffnen Sie die erfasste Filmdatei als Bildsequenz mit Bild J. Wenn Sie eine Farb-CCD- oder CMOS-Kamera verwenden, konvertieren Sie RGB-Bilder in 16-Bit-Monobilder. Öffnen “Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager”, Zeichnen Sie die Region von Interesse und klicken Sie auf “Hinzufügen”. Klicken Sie auf “Multi Measure”. Der Mittelwert der Intensität in mehreren ROI wird im Ergebnis angezeigt. Zeichnen Sie die Änderung der Signalintensität mit einer allgemeinen Datenanalysesoftware. Messung der neuronalen Aktivität durch Multielektroden-ArrayHINWEIS: Die Aktivität von motorischen Neuronen kann durch ein Multi-Elektroden-Array (MEA) erfasst werden. Nach der Erstellung einer MNO, übertragen Sie es auf eine Kellermembran Matrix beschichtet MEA Sonde. Positionieren Sie das Gewebe auf Elektroden. Fügen Sie 200 L Reifungsmedium hinzu und brüten Sie 1-2 h bei 37 °C, damit sich das MNO an der Oberfläche anheften kann. Ersetzen Sie das Medium durch aufnahmemittel (8.3.2). Legen Sie Gitter und Gewicht optional auf ein MNO, um den Kontrakt mit den Elektroden zu erhöhen. Stellen Sie die MEA-Sonde auf die Aufnahmekopfstufe ein. Wischen Sie den Kontakt zwischen der MEA-Sonde und der Kopfstufe mit 70% Ethanol ab. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung neuronaler Aktivität, indem Sie den Anweisungen der Hersteller des MEA folgen.