ثلاثي الأبعاد موتور العصب الجهازية جيل
Summary
يوفر هذا البروتوكول إجراءً شاملاً لتلفيق الجهاز العضوي العصبي الحركي المشتق من الخلايا البشرية من خلال التجميع التلقائي لحزمة قوية من المحاور المُمددة من الزفير في شريحة ثقافة الأنسجة.
Abstract
إنّ كَرَسَة المحاور هي واحدة من الزخارف الهيكلية الرئيسية التي لوحظت في الجهاز العصبي. يمكن أن يسبب اضطراب كراسات المحاور الرئيسية أمراضًا تنموية وعصبية تنكسية. على الرغم من أن العديد من الدراسات التي أجريت على محاور عصبية قد أجريت، فهمنا لتشكيل والخلل الوظيفي من كراسات محور عصبي لا يزال محدودا بسبب عدم وجود نماذج قوية ثلاثية الأبعاد في المختبر. هنا، نحن وصف بروتوكول خطوة بخطوة للجيل السريع من الجهاز العضوي العصب الحركي (MNO) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPS) المستحثة من الإنسان في رقاقة زراعة الأنسجة القائمة على ميكروفلويديك. أولا ، يتم وصف تصنيع رقائق المستخدمة في الطريقة. من خلايا iPS البشرية ، يتم تشكيل الخلايا العصبية الحركية (MNS). بعد ذلك، يتم نقل MNS متمايزة في رقاقة. بعد ذلك ، تنمو المحاور تلقائيًا من الزنجي وتتجمع في كراسة داخل قناة صغيرة مجهزة في الشريحة ، والتي تولد أنسجة MNO تحمل حزمة من المحاور الممتدة من الزفير. لتحليل المصب، يمكن إخراج MNOs من الشريحة ليتم إصلاحها للتحليلات المورفولوجية أو تشريحها للتحليلات الكيميائية الحيوية، وكذلك تصوير الكالسيوم وتسجيلات صفيف متعدد الأقطاب. ويمكن أن تيسر المنظمات غير الحكومية التي تولدت بهذا البروتوكول اختبار المخدرات وفحصها، ويمكن أن تسهم في فهم الآليات الكامنة في تطوير والأمراض الناجمة عن كراسات المحاور.
Introduction
الخلايا العصبية الحركية الشوكية (MN) توسيع محاورها إلى عضلات الهيكل العظمي للسيطرة على حركة الجسم. ومساراتها المحورية منظمة ومنظمة تنظيماً عالياً في العملية الإنمائية. على الرغم من العديد من الدراسات على تمديد محور عصبي والتوجيه1، لا تزال آليات تشكيل حزمة محور عصبي منظمة قيد التحقيق. غالبًا ما تتضرر أكسونات الخلايا العصبية الحركية بسبب الأمراض العصبية التنكسية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS)2، ولكن الآليات الفسيولوجية للأمراض المرضية للضرر على كراسات المحاور غير مفهومة بشكل جيد. وهكذا ، هناك حاجة إلى نموذج فسيولوجي والمرضي لتكخيم تشكيل حزمة المحاور والتراجع في هذا المجال.
الخلايا العصبية الحركية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية هي منصة واعدة لفهم التنمية والأمراض مثل ALS3. يمكن استخدام الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان (خلايا iPS) في نمذجة الأمراض باستخدام الخلايا المشتقة من المريض. حتى الآن، تم الإبلاغ عن طرق مختلفة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى MN4و5و6. ومع ذلك، محاور عصبية في ثقافة ثنائية الأبعاد موجهة بشكل عشوائي ولا تتكخي في بيئة حيوية في داخل الأعصاب النامية التي يتم تجميعها محاور عصبية أحادية من خلال التفاعلات المحورية الكثيفة7. للتغلب على هذه المسألة، قمنا بتطوير تقنية لتوليد نسيج ثلاثي الأبعاد يشبه العصب الحركي من خلايا iPSالبشرية 8، وسمى الأنسجة كعضوي العصب الحركي (MNO). و MNO يتكون من خلايا الهيئات الموجودة في الخلايا العصبية الحركية spheroid (MNS) وملوسمية محور عصبي تمتد من spheroid. المحاور في الكروسة موجهة نحو اتجاه أحادي الاتجاه ، والتي تشبه المحاور في تطوير الأعصاب الحركية. ومن ثم، توفر MNOs بيئة مجهرية فيزيولوجية فريدة، وهو ما لم يتم من قبل أي أساليب أخرى لثقافة الخلايا العصبية تم تطويرها سابقًا.
في هذا البروتوكول، ونحن وصف أساليب لرقائق زراعة الأنسجة تلفيق، وتمايز الخلايا العصبية الحركية السريعة، وتشكيل الجهاز العصبية الحركية في رقائق المتقدمة. لدينا رقاقة ثقافة الأنسجة بسيطة جدا، وأنه يحتوي على مقصورة فقط لقبول spheroid، وميكنانيل لتشكيل حزمة محور عصبي، ومقصورة لمحطات محور عصبي الإسكان. لا يحتوي الجهاز على هياكل معقدة بما في ذلك ميكروغروف أو مرشحات micropore التي غالباً ما تستخدم لفصل المحاور والهيئات الخلية من الحجم9،10. ومن ثم أجهزتنا يمكن أن تكون ملفقة بسهولة باتباع الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول إذا كان إعداد التصوير الضوئي متاحًا.
يتم تحقيق التمايز السريع من خلايا iPS البشرية مع مزيج الأمثل من عوامل الحث والنقش (SB431542، LDN-193189، حمض الريتينويك (RA)، والمجانى الممهدة (SAG)) وعوامل التسارع (SU5402 وDAPT). وقد أفيد أن الجمع بين SU5402 وDAPT يسرع تمايز الخلايا العصبية الطرفية والخلايا العصبية11. في هذا البروتوكول، نقدم ثلاث طرق مختلفة لتوليد MNOs، بحيث يمكن للقراء أن يقرروا طريقة أكثر ملاءمة لاحتياجاتهم. نوصي بإجراء تمايز خلايا iPS البشرية بعد تشكيل spheroid (طريقة 3D) ، حيث يمكن نقل MNS المتمايزة مباشرة إلى شريحة ثقافة الأنسجة. بدلا من ذلك، يمكن تمييز الخلايا iPS الإنسان في الخلايا العصبية الحركية في ثقافة monolayer (2D)، ومن ثم خلق في الخلايا العصبية الحركية ثلاثية الأبعاد spheroids كما أبلغنا سابقا8. لقد قمنا بتحديث البروتوكول، ومع طريقة التمايز ثلاثي الأبعاد الموصوفة في هذا البروتوكول، يمكن تجنب الانتقال من ثنائية الأبعاد إلى ثلاثية الأبعاد ويمكن الحصول على MNOs بوقت تمايز أقصر، وخطوات أقل، وتقليل المخاطر التقنية دون خطوة الانفصام. ويمكن أيضا أن الخلايا العصبية المتاحة تجاريا يمكن استخدامها لتوليد MNS لتقليل الوقت للتمايز.
لتوليد MNO، نحن مثقف MNS في رقاقة ثقافة الأنسجة. تتمدد المحاور من الزاوي وتمتد إلى القناة الدقيقة التي تتجمع فيها المحاور وتحاذي أحادي الاتجاه. وهذا يسهل التفاعل المحوري وتشكيل عفوي من مجموعة مجمعة بإحكام نسيج من المحاور في القنوات الدقيقة، والتي تتحقق بشكل فريد من قبل هذا البروتوكول، في حين إما تشكيل حزمة عفوية أو توجيه محور عصبي التوجه وحده يمكن تحقيقه من قبل بروتوكولات أخرى12،13،14. في تجربة نموذجية، تنتقل خلايا قليلة من الـ spheroids إلى القنوات الدقيقة، وتبقى معظم الخلايا على شكل خلايا سفيرية قريبة. تسمح هذه الطريقة بعزل المحاور بشكل عفوي عن الزائر دون استخدام حواجز مادية تعتمد على الحجم (مثل ميكروغروف أو مرشحات ميكروبور) لفصل المحاور عن أجسام الخلايا.
يمكن أن تخضع MNO الناتجة إلى فحوصات مختلفة، بما في ذلك التحليلات المورفولوجية والبيوكيميائية والفيزيائية. يمكن عزل جسم الخلية وحزمة المحور الموسعة من الناحية الجسدية عن طريق القطع ويمكن تحليلها بشكل منفصل للتجارب المصب، على سبيل المثال، الميكيميا الحيوية. المواد البيولوجية بما في ذلك الحمض النووي الريبي والبروتين يمكن عزلها من مجرد حزم محور عصبي قليلة للمقايس الكيميائية الحيوية العادية بما في ذلك RT-PCR وغرب النشاف. هنا ، نحن وصف بروتوكول لتوليد الجهاز العصبية الحركية من خلايا iPS ، والذي يقدم نموذجًا فسيولوجيًا ومرضيًا جذابًا لدراسة الآلية الكامنة في التطور ومرض كراسات المحاور.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول تشكيل الجهاز العضوي العصبي الحركي (MNO) الذي يحتوي على حزمة محور عصبي ممتدة من الخلايا العصبية الحركية التي تم إنشاؤها من خلايا iPS البشرية. حزمة محور عصبي شكلت سميكة، مرنة، ومنظمة تنظيما جيدا في هياكل أحادي الاتجاه. عن طريق تشريح حزمة محور عصبي، يمكن الحصول على البروتين المحوري عالية النقاوة والرنا بما فيه الكفاية للتحليلات الكيميائية الحيوية. يمكن قياس نشاط الخلايا العصبية في حزم المحاور وspheroids مع تصوير الكالسيوم. لم يتم اكتشاف تلوث البروتينات النووية والتشعبية في lysate محور عصبي من قبل النشاف الغربي ، مما يدل على أن طريقتنا فصل المحاور بكفاءة من أجسام الخلايا والتشعبات.
واحدة من مزايا هذا البروتوكول هو التمايز السريع وتوليد MNO مجهزة حزمة محور عصبي، والتي يمكن أن يتم كل العمليات في 4 أسابيع مع بروتوكول 3D و 5-6 أسابيع باستخدام بروتوكول 2D. هذا هو قصيرة بالمقارنة مع بروتوكولات أخرى والتي عادة ما يستغرق 3-4 أسابيع لمجرد التفريق في MN من الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا iPS17 ويستغرق إضافية 2-4 أسابيع للحصول على استطالة محور عصبي. ويفضل البروتوكول ثلاثي الأبعاد عموماً على البروتوكول الثاني الأبعاد بسبب قصر وقت التمايز، والخطوات الأقل، وتقليل المخاطر التقنية دون خطوة الانفصام مقارنة بالبروتوكول الثاني. تم تصميم رقاقة زراعة الأنسجة القائمة على microfluidic بطريقة بحيث يمكن لمحور عصبي MNS الإطالة نحو المقصورة الأخرى من خلال القناة الدقيقة ، مما يسهل تشكيل حزمة من المحاور عن طريق تحفيز التفاعلات المحورية والتقارب بين المحاور. بسبب مجموعة تجريبية بسيطة، وجميع البروتوكولات المذكورة هنا لا يمكن أن يؤديها فقط من قبل الهندسة الحيوية، الذين هم على دراية التلاعب من رقاقة ثقافة الأنسجة، ولكن أيضا علماء الأحياء وعلماء الأعصاب الذين ليسوا على دراية microfluidics وتقنيات microfabrication. وتجدر الإشارة إلى أن الخطوات 1 و 2 يمكن أيضا أن تنفذ باستخدام خدمة تصنيع خارجي.
إحدى الخطوات الهامة لإنجاز البروتوكول هو تغيير تسلسلي من الوسيطة الثقافة. ينصح بتغيير الوسط الثقافي بشكل كامل في كل خطوة أثناء التمايز بحيث لا تخل العوامل في الوسط المستهلك بتمايز MN. نقطة أخرى هامة من هذا البروتوكول هو الحفاظ على خلايا iPS غير متمايزة في نوعية جيدة. جودة ثقافة خلية iPS الأولية تؤثر بشكل كبير على كفاءة الحصول على الخلايا العصبية الحركية و MNO. نقطة أخرى هي أن قطر MNS يجب أن يكون أصغر من حجم ثقب الرقاقة (1.5 ملم). لا يمكن أن يدخل الزفير الكبير الغرفة ، ويحتمل أن تواجه نخر نقص الأكسجة الشديد في الجزء الأوسط. يمكن التحكم في حجم MNSs عن طريق تغيير عدد البذر الأولي من خلايا iPS (في بروتوكول 3D) أو الخلايا العصبية الحركية (في بروتوكول 2D). يجب تحسين كثافة البذر من الخلايا لكل خط خلية iPS.
وقد استخدمت على نطاق واسع أجهزة microfluidic مجزأة مع microgrooves ومرشحات المسام الصغيرة لفصل المحاور من الهيئات الخلوية dendrites. ويمكن لهذه التقنية أيضا فصل محاور من الأجسام الخلوية وdendrite، مع وفرة متفوقة من المحاور في الأنسجة المجمعة. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى ، أحد القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو أنه لا يمكن فصل اثنين من وسائل الإعلام ثقافة مختلفة في التصميم الحالي لرقاقة ثقافة الأنسجة ، مما يعوق القدرة على الثقافة المشتركة من خليتين مختلفتين تتطلب اثنين من وسائل الإعلام المتميزة. وثمة قيد آخر هو أن رقاقة PDMS وضع قيود محددة سلفا على حجم الأنسجة. لا يمكن أن يدخل الزفير أكبر من الثقب الغرفة ، ولا يمكن أن تنمو حزمة محور عصبي أكثر سمكًا من عرض قناة microfluidic.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع أخرى من الخلايا العصبية. وقد أظهرت مجموعتنا القدرة على نموذج الجهاز الدماغي باستخدام طريقة معدلة جنبا إلى جنب مع تقنيات organoid الدماغية18. تم إدخال كرويات القشرية في كل من المقصورات والمحاور الممدود تلقائياً نحو كل كروية، وبعد ذلك حزمة محور عصبي شكلت تلقائياً. ونتيجة لذلك، يمكن توصيل اثنين من كرويات القشرية من خلال حزمة محور عصبي، ويمكن الحصول على الأنسجة كقطعة واحدة. وهذا يدل على أن النهج هو تنوعا للغاية لتشكيل أنسجة حزمة محور عصبي بغض النظر عن أنواع الخلايا العصبية. في هذا البروتوكول، تم استخدام الخلايا iPS البشرية، ومع ذلك، يمكن استخدام الخلايا الجذعية الأخرى بما في ذلك الخلايا ES البشرية والخلايا الجذعية العصبية البشرية مع تعديلات على البروتوكول المقدم. يمكن توليد 3D spheroids من الخلايا العصبية من بروتوكولات متنوعة19,20. هذه الطريقة لصنع الأنسجة مع حزمة محور عصبي يمكن أن يكون من المحتمل أن تكون مجتمعة في المستقبل مع بروتوكولات التمايز الأخرى لصنع 3D MN spheroid. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التحكم في سمك وطول حزمة محور عصبي ببساطة عن طريق تغيير عرض وارتفاع microchannels من رقاقة ثقافة الأنسجة للتطورات المستقبلية.
ونعتقد أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه لاختبار المخدرات وفحصها ويمكن أن يسهم في فهم الآليات التي تقوم عليها عملية تطوير والأمراض في إطار إطار منابع المحاور.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) المنح في المعونة للبحث العلمي 17H05661 و 18K19903 ، Core-2- الأساسية ، و ما وراء معهد الذكاء الاصطناعي.
Materials
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
| 6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
| Accutase | ICT | AT104 | |
| B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
| Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
| HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
| HBSS | Wako | 085-09355 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
| Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
| MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
| Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
| N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
| Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
| ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
| Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
| SAG | Sigma | SML1314 | |
| SB431542 | Wako | 192-16541 | |
| Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
| Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
| Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
| SU5402 | Sigma | SML0443 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
| TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
| Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
| Y-27632 | Wako | 030-24021 |
Referências
- Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).
- Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
- Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
- Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
- Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
- Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
- Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421 (2018).
- Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
- Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
- Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
- Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
- Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).
- Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).
