Обнаружение экспрессии микроРНК в почках мышей-нефропатических иммуноглобулинов А
Summary
микроРНК участвуют в патогенезе IgA-нефропатии. Мы разработали надежный метод определения уровней экспрессии микроРНК в почках мышиной модели IgA-нефропатии (мыши HIGA). Этот новый метод облегчит проверку участия микроРНК в IgA-нефропатии.
Abstract
Иммуноглобулиновая нефропатия А (IgA) – это тип первичного гломерулонефрита, характеризующийся аномальным отложением IgA, приводящим к терминальной стадии почечной недостаточности. В последние годы сообщалось об участии микроРНК (миРНК) в патогенезе IgA-нефропатии. Однако не существует установленного метода профилирования микроРНК при IgA-нефропатии с использованием моделей мелких животных. Поэтому мы разработали надежный метод анализа микроРНК в почках мышиной модели IgA (мышь HIGA). Целью этого протокола является обнаружение измененных уровней экспрессии микроРНК в почках мышей HIGA по сравнению с уровнями в почках контрольных мышей. Вкратце, этот метод состоит из четырех этапов: 1) получение образцов почек от мышей HIGA; 2) очистка общей РНК из образцов почек; 3) синтез комплементарной ДНК из общей РНК; и 4) количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (qRT-PCR) микроРНК. Используя этот метод, мы успешно определили уровни экспрессии нескольких микроРНК (miR-155-5p, miR-146a-5p и miR-21-5p) в почках мышей HIGA. Этот новый метод может быть применен к другим исследованиям, профилирующим микроРНК при IgA-нефропатии.
Introduction
Иммуноглобулиновая нефропатия А (IgA) представляет собой тип первичного гломерулонефрита, характеризующийся аномальным отложением IgA в почечной клубочковой мезангиальной области 1,2. Он является наиболее распространенным из первичных гломерулонефритов и приводит к терминальной стадии почечной недостаточности у 20–40% пациентов2. Причина до сих пор неизвестна, но была зафиксирована персистирующая инфекция слизистой оболочки 1,3. Кортикостероиды, иммунодепрессанты и ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы были предложены в качестве терапевтических методов1,3, но не были полностью установлены 3. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для уточнения этиологии и терапевтических методов лечения IgA-нефропатии.
микроРНК (миРНК) представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые играют важную роль в регуляции экспрессии генов 4,5. Сообщается, что микроРНК участвуют в патогенезе различных заболеваний, и некоторые из них были идентифицированы как биомаркеры заболеваний и терапевтические агенты 4,5. В последние годы также сообщалось о связи между микроРНК и патогенезом IgA-нефропатии 2,6,7. Например, было показано, что miR-148b участвует в структурных аномалиях IgA у пациентов с IgA-нефропатией 2,6,7, в то время как miR-148b и let-7b были задокументированы как новые биомаркеры для выявления IgA-нефропатии7. Хотя понимание влияния микроРНК на IgA-нефропатию может помочь в дальнейшем выяснении этиологии и лечения 2, стандартные методы профилирования микроРНК при IgA-нефропатии с использованием моделей мелких животных еще не установлены2.
Здесь мы разработали простой и надежный метод измерения уровней экспрессии микроРНК в почках мышиной модели нефропатии IgA (мыши HIGA). Мышь HIGA представляет собой характерный штамм ddY, демонстрирующий особенно высокий уровень сывороточного IgA и аномальное отложение IgA в почечных клубочках 8,9,10,11. Таким образом, мышей HIGA можно использовать в качестве мышиной модели нефропатии IgA 8,9,10,11. Наш метод состоит из четырех основных этапов: во-первых, хирургическое получение образцов почек от мышей HIGA; во-вторых, гомогенизация образцов и очистка общей РНК с использованием спиновой колонки на основе кремнеземной мембраны; в-третьих, синтез комплементарной ДНК (кДНК) из общей РНК с использованием обратной транскрипции; и, в-четвертых, определение уровней экспрессии микроРНК с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR). Обоснование этого метода и достоверность результатов основаны на предыдущих отчетах12,13. Мы показываем, что это полезный метод для точного измерения уровней экспрессии микроРНК в мышиной модели нефропатии IgA, и что он может быть использован для облегчения будущих исследований микроРНК при нефропатии IgA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы смогли измерить уровни экспрессии микроРНК в почках мышиной модели нефропатии IgA (мыши HIGA) с помощью этого нового метода. IgA-нефропатия является необъяснимым заболеванием, которое нуждается в дальнейших исследованиях для уточнения его этиологии и терапевтических целей …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сару Уильямс, доктора философии из Edanz Group (www.edanzediting.com) за редактирование черновика этой рукописи.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
Referências
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
