O ensaio ex vivo descrito neste estudo utilizando extratos de homogeneização intestinal e coloração de imunofluorescência representa um novo método para examinar a morfogênese húfa de Candida albicans no trato GI. Este método pode ser utilizado para investigar os sinais ambientais que regulam a transição morfogenética no intestino.
A morfogênese húfala candida albicans no trato gastrointestinal (GI) é fortemente controlada por vários sinais ambientais, e desempenha um papel importante na disseminação e patogênese deste patógeno fúngico oportunista. No entanto, os métodos para visualizar a hifa fúngica no trato GI in vivo são desafiadores, o que limita a compreensão dos sinais ambientais no controle desse processo de morfogênese. O protocolo aqui descrito demonstra um novo método ex vivo para visualização da morfogênese hifal em extratos homogeneizados intestinais. Usando um ensaio ex vivo, este estudo demonstra que o conteúdo cecal de camundongos tratados com antibióticos, mas não de camundongos de controle não tratados, promovem a morfogênese háfagênese C. albicans no conteúdo intestinal. Além disso, adicionar de volta grupos específicos de metabólitos intestinais ao conteúdo cecal de camundongos tratados com antibióticos regula diferencialmente a morfogênese hifalina ex vivo. Em conjunto, este protocolo representa um novo método para identificar e investigar os sinais ambientais que controlam a morfogênese húfa cofálica no trato GI.
Candida albicans é um patógeno fúngico oportunista e polimórfico que normalmente é commensal, mas pode sofrer uma alteração morfológica em uma forma virulenta capaz de causar infecções fatais em indivíduos imunocomprometidos1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans é uma das principais causas de infecções nosocomiais sistêmicas, com uma taxa de mortalidade de 40\u201260% mesmo com tratamento antifúngico2,14,15. Embora os albicanos residam em diferentes nichos hospedeiros, incluindo o sistema reprodutivo feminino16,17, a cavidade oral de indivíduos saudáveis18 e o trato gastrointestinal (GI)19,20, a maioria das infecções sistêmicas originárias do trato GI e, além disso, a fonte de infecção sistêmica é frequentemente confirmada como o trato GI21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. a patogenicidade dos albicanos no trato GI é influenciada por uma ampla gama de fatores; no entanto, uma característica importante necessária para a virulência é a transição de uma morfologia celular levedura para uma morfologia de células hífas virulenta35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. o apego e disseminação do trato de GI durante a infecção está altamente associado à sua capacidade de transição de uma levedura commensal para hifa virulenta, permitindo que os fungos causem doença invasiva44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Uma variedade de fatores no intestino, incluindo n-acetilglucosamina, regulam a formação hifáfal por C. albicans. Portanto, é crucial diminuir a lacuna de conhecimento sobre a morfogênese hifal deste patógeno fúngico no trato GI54,55,56. Evidências recentes indicam que vários metabólitos intestinais controlam diferencialmente a morfogênese háfa de C. albicans in vitro57,58,59,60. No entanto, as restrições técnicas apresentam problemas ao tentar estudar a formação de c. albicans hyphae em amostras in vivo, especialmente a coloração de leveduras e células de higia e análise quantitativa do desenvolvimento de higificos. Para entender a morfogênese hábica de C. albicans no trato GI, um método ex vivo foi desenvolvido utilizando extratos solúveis de conteúdo intestinal homogeneizado de camundongos para estudar o efeito de metabólitos na morfogênese húfa fúngica. Utilizando amostras intestinais de camundongos resistentes e suscetíveis à infecção por C. albicans GI, este método ajudará a identificar e estudar o efeito de metabólitos, antibióticos e xenobióticos na morfogênese húfa fúngica no trato GI.
O método descrito aqui apresenta uma nova maneira de investigar o efeito de antibióticos, impactos dietéticos, xenobióticos e terapêuticos na morfogênese hífa de C. albicans no trato GI. Uma vez que a maioria das infecções sistêmicas se origina do trato GI21,22,23,24,25,26,27</s…
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem recursos e apoio da instalação de pesquisa de núcleos celulares e moleculares da Universidade do Centro-Oeste.
1 – 10 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | Misc |
100 – 1000 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-400 | Misc |
20 – 200 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-451 | Misc |
2-methylbutyric acid | Sigma | 193070-25G | hyphal-inhibitory compound |
488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen (Fisher) | A11008 | IF Staining secondary ab |
Agar | Fisher | BP1423-500 | YPD agar component |
Automated Imaging Microscope | Keyence | BZX700 | |
Candida Albicans Antibody | Invitrogen (Fisher) | PA1-27158 | IF Staining primary ab |
cefoperazone | Cayman | 16113 | antibiotic |
deoxycholic acid | Sigma | 30960 | hyphal-inhibitory compound |
D-Glucose | Fisher | D16-500 | hyphal-promoting compound |
forceps | Fisher | 08-885 | |
lactic acid | Alfa Aesar | AAAL13242-06 | hyphal-inhibitory compound |
lithocholic acid | Sigma | L6250-10G | hyphal-inhibitory compound |
palmitic acid | Sigma | P5585-10G | hyphal-inhibitory compound |
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | IF Staining fixative |
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x | Alfa Aesar | J62692 | PBS component |
p-tolylacetic acid | SCBT | sc-257959 | hyphal-inhibitory compound |
sebacic acid | Sigma | 283258-250G | hyphal-inhibitory compound |
sharp ended scissors | Fisher | 28301 | |
sterile Milli-Q water | N/A | N/A | Misc |
YPD Broth | BD Biosciences | 242810 | YPD agar component |