Contribution of the Na<sup>+</sup>/K<sup>+</sup> Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Ricardo  Javier Erazo-Toscano; Parker  J. Ellingson; Ronald  L. Calabrese; Gennady  S. Cymbalyuk

doi:10.3791/61473

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Biologia

Contribuição da Na⁺/K⁺ Bomba para Estouro Rítmico, Explorada com Modelagem e Análises dinâmicas de grampo

Published: May 09, 2021

doi:

10.3791/61473

Ricardo Javier Erazo-Toscano^1,2, Parker J. Ellingson², Ronald L. Calabrese*¹, Gennady S. Cymbalyuk*²

¹Department of Biology,Emory University, ²Neuroscience Institute,Georgia State University

Summary

Apresentado aqui é um método de investigação dos papéis da bomba Na⁺/K⁺ e persistente Na⁺ corrente em interneurônios de coração de sanguessuga usando grampo dinâmico.

Abstract

A bomba Na⁺/K^+, muitas vezes considerada como uma função de fundo na atividade neuronal, contribui com uma corrente externa (eu_bombeio) que responde à concentração interna de Na⁺ ([Na⁺]_i). Em neurônios estourando, como os encontrados em redes neuronais geradoras de padrão central (CPG) que produzem movimentos rítmicos, o [Na⁺]_i e, portanto, a _bombaI, pode-se esperar que varie ao longo do ciclo de estouro. Essa capacidade de resposta à atividade elétrica, combinada com a independência do potencial da membrana, doto que eu_bombeio com propriedades dinâmicas não comuns às correntes baseadas em canais (por exemplo, canais de tensão ou transmissores ou canais de vazamento). Além disso, em muitos neurônios, a atividade da bomba é modulada por uma variedade de moduladores, expandindo ainda mais o papel potencial de eu_bombear em atividade de estouro rítmico. Este artigo mostra como usar uma combinação de modelagem e métodos dinâmicos de grampo para determinar como eu_bombeio e sua interação com a atividade rítmica de Na⁺ corrente persistente em um CPG. Especificamente, este artigo se concentrará em um protocolo de grampo dinâmico e métodos de modelagem computacional em interneurônios cardíacos de sanguessugas medicinais.

Introduction

O batimento cardíaco em sanguessugas é impulsionado por um CPG composto por 9 pares bilaterais de interneurônios cardíacos (HNs) distribuídos em tantos gânglios segmentais do corpo médio. No núcleo do CPG estão pares mutuamente inibidores de interneurônios localizados nos gânglios^3º e 4^segmentos que formam osciladores de meio centro (HCOs)(Figura 1A). Esses neurônios continuam a estourar quando isolados farmacologicamente sinacicamente usando bicuculina¹. Outros, como a dupla no^7º gânglios segmentais (foco deste protocolo), também são estouros, capazes de produzir atividade estourando quando isolados sinapticamente. Eles não estão mutuamente conectados e recebem apenas entrada descendente, e assim são facilmente isolados cortando o gânglio do resto do cordão nervoso. Esta atividade de estouro independente é sensível à introdução da corrente de vazamento causada pela penetração com microeletrodos afiados para gravação, mas vigorosamente estourada quando gravada com métodos de patch soltos¹.

Ambos os neurônios HN individuais e HCOs HN foram modelados (modelos individuais de compartimento isopotencial baseados em Hodgkin-Huxley de neurônios HN contendo todas as correntes sinopáticas e de tensão identificadas experimentalmente), e todas as características de explosão do sistema vivo foram capturadas com sucesso². A miomodulina, um neuropeptídeo endógeno em sanguessugas, diminui significativamente o período (T) do ritmo de explosão de neurônios HN isolados e HN HCOs. Este modulador atua para aumentar a corrente h (corrente interna ativada por hiperpolarização, I_h) e diminuir a_bomba³. Essa observação levou à exploração de como eu_bombeio interage com I_h, e como sua co-modulação contribui para a atividade rítmica dos neurônios HN. A ativação da bomba aumentando [Na⁺]_i (usando o monensin ionophore) acelera o ritmo de explosão hn tanto em HCOs HN quanto em neurônios HN isolados⁴. Essa aceleração dependia de I_h. Quando i_h foi bloqueado (2 mM Cs⁺), o período de estouro não foi alterado por este método de ativação da bomba; no entanto, a duração da explosão (BD) foi reduzida, e o intervalo de interexploração (IBI) aumentou tanto em HN HCOs quanto em neurônios HN isolados⁴.

Para este protocolo, todas as correntes de um neurônio HN(7) vivo, incluindo a corrente da bomba, eu_bombeio,são incorporadas no modelo HN da seguinte forma:

(1)

onde C é a capacitância de membrana (em nF), V é o potencial de membrana (em V), t é tempo (em s). Descrições e equações detalhadas da corrente iônica foram descritas em outros lugares²^,⁴. O neurônio modelo HN completo é executado em tempo real(Figura 2). O software será disponibilizado no GitHub após a publicação e será adequado para ser executado na placa de processamento de sinal digital descrita na Tabela de Materiais. Aqui, o foco da investigação é a corrente na⁺/K⁺ da bomba(eu_bombeio)e as correntes fechadas de tensão contribuindo significativamente na⁺ fluxo: um Na⁺ corrente rápida (I_Na) e uma corrente na⁺ persistente(I_P). As conduções máximas dessas correntes são, respectivamente,. A bomba Na⁺/K⁺ troca três íons Intracelulares Na⁺ por dois íons extracelulares K⁺ ions, produzindo assim uma corrente externa líquida. É importante ressaltar que ele bombeia 3 vezes mais Na⁺ para fora do neurônio do que esta corrente indica, o que é importante para calcular a concentração intracelular Na^+.

A corrente de bomba Na⁺/K⁺ depende de concentrações na⁺ intracelulares e é expressa pela seguinte função sigmoidal:

(2)

onde [Na]_i é a concentração intracelular Na^+, é a máxima Na⁺/K⁺ corrente de bomba, [Na]_ih é a concentração intracelular Na⁺ para a meia-ativação da bomba Na⁺/K⁺ e [Na]_é a sensibilidade da bomba Na⁺/K⁺ para [Na]_i. [Na]_eu constrói como resultado dos influxos Na⁺ transportados por I_P e I_Na e é diminuído pelo Na⁺ efflux da bomba Na⁺/K^+. A contribuição de I_h e I_Leak para o fluxo na⁺ total é pequena e não é considerada no modelo em tempo real.

(3)

onde, v é o volume (~6,7 pL) do reservatório intracelular Na⁺ , F é constante de Faraday, e a concentração extracelular Na⁺ é mantida constante.

As condutenções de tensão e de vazamento têm sido diferenciadas – estas respondem ao potencial da membrana – da corrente da bomba, que é regulada pela concentração na⁺ intracelular calculada ([Na⁺]_i). [Na⁺] _i é construído através da entrada Na⁺ através da rápida Na⁺ corrente (I_Na) que produz potenciais de ação (picos) e a persistente Corrente Na⁺ (I_P) que fornece a despolarização para suportar o spiking. [Na⁺] _i é, por sua vez, reduzido pela ação da bomba através da extrusão de Na⁺. Os valores hn vivos da linha de base de (5nS) e (150 nS) foram assumidos, e levamos em conta qualquer grampo dinâmico adicionado.

O objetivo do protocolo descrito aqui é manipular eu_bombear com precisão e reversivelmente em tempo real para descobrir como ele interage com correntes fechadas de tensão (corrente na⁺ persistente no protocolo atual) para controlar o estouro rítmico em HNs únicos. Para atingir esse objetivo, utilizou-se um grampo dinâmico, que introduz artificialmente, sob o comando, uma quantidade precisa de qualquer corrente que possa ser calculada à medida que o modelo está em execução. Este método tem vantagens sobre a manipulação farmacológica da bomba, que afeta todo o tecido, pode ter efeitos fora do alvo que muitas vezes são difíceis de reverter, e não podem ser precisamente manipulados. O grampo dinâmico⁵^,⁶ lê a tensão de um neurônio registrado em tempo real(Figura 1B) e calcula e injeta, em tempo real, a quantidade de qualquer corrente baseada em equações de modelo e os valores definidos de qualquer ou . Métodos semelhantes podem ser facilmente aplicados a qualquer neurônio que possa ser registrado intracelularmente. No entanto, os parâmetros terão que ser redimensionados ao neurônio escolhido, e o neurônio deve ser isolado de entradas sinápticas, por exemplo, farmacologicamente.

Protocol

NOTA: Os indivíduos experimentais animais invertebrados não são regulados pelo NIH ou pelas Universidades Estaduais de Emory e Geórgia. Todas as medidas foram tomadas, no entanto, para minimizar o sofrimento das sanguessugas utilizadas neste trabalho. 1. Prepare o gânglio isolado 7 do fio nervoso sanguessuga Mantenha as sanguessugas Hirudo verbana em água artificial da lagoa (contendo 0,05% c/v de sal marinho) diluída em água desionizada a 16 °C em um ciclo claro-escuro de 12:12. Prepare as sanguessugas para dissecção anestesizando-as em uma cama de gelo esmagado por >10 min até ficar imóvel. Encha um prato de dissecação preto, forrado de resina a uma profundidade de ~1 cm com soro fisiológico refrigerado contendo 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl2,10 mM D-glicose e 10 mM HEPES em água desominada; pH ajustado para 7,4 com 1 M NaOH. Fixar o lado dorsal de sanguessuga na câmara revestida de resina preta (pelo menos 20 cm x 10 cm com uma profundidade de pelo menos 2 cm acima da resina que tem pelo menos 2 cm de espessura). Sob um steromicroscópio a 20x de ampliação com iluminação guia de luz oblíqua, faça um corte longitudinal de pelo menos 3 cm de comprimento com uma tesoura de mola de 5 mm através da parede do corpo na parte 1/3do rostral do corpo. Use pinos para puxar a parede do corpo e expor os órgãos internos.NOTA: Qualquer refeição de sangue armazenada pode ser removida por sucção com uma pipeta Pasteur polida com fogo. Isole um gânglio médio individual 7 (sétimo gânglio segmental livre caudal para o cérebro). Abra o seio no qual o fio nervoso reside usando a tesoura de mola de 5 mm. Certifique-se de dividir o seio dorsalmente e ventrally deixando duas tiras de seio. Use fórceps nítidos nítidos para ajudar a guiar o corte e segurar o seio. Mantenha o seio ligado a cada uma das duas raízes nervosas bilaterais que emergem do gânglio (ele adere firmemente a cada raiz) para usar essas tiras de seios para fixar o gânglio. Remova o gânglio do corpo cortando os feixes de nervos rostral e caudal que ligam o gânglio (o mais longe possível do7º gânglio) e as tiras sinusas, e então corte as raízes laterais para onde elas emergem do seio. Fixar o gânglio (usando fórceps nº 5 enlatados) com pinos de insetos minuten encurtados, lado ventral para cima, em pratos de Petri claros e forrados de resina. Insira pinos nas tiras de seios e tecidos soltos aderindo às raízes e aos conectivos rostrais e caudais, o mais longe possível do gânglio.NOTA: A resina não deve ser mais espessa que 3 mm se uma boa iluminação de baixo for alcançada durante a gravação. Certifique-se de que o gânglio está tenso, tanto longitudinalmente quanto lateralmente Aumente a ampliação do estereótipo para 40x ou mais, e ajuste a iluminação oblíqua para que os corpos das células neuronais possam ser facilmente vistos na superfície ventral do gânglio logo abaixo do perineurium. Remova o perineúrio do gânglio (desheath) com microscissores. Comece a desheathing cortando a baia solta entre as raízes de um lado, e continue o corte lateralmente para o outro lado, certificando-se de manter as lâminas da tesoura superficiais e não prejudicar os corpos celulares neuronais diretamente abaixo da baia. Faça um corte superficial semelhante caudally do corte lateral ao longo da linha média. Agora pegue o retalho caudolateral de bainha de um lado com as fórceps finas #5, puxe-o para longe do gânglio, e corte-o com os microscisores. Repita do outro lado; este procedimento expõe ambos os neurônios HN(7) para registro com microeletros. Coloque o prato de preparação na configuração de gravação e superfuse com soro fisiológico a uma vazão de 5 mL/min à temperatura ambiente. 2. Identifique e grave interneurônios de coração de sanguessuga com microeletrodos afiados Durante a duração do registro do neurônio HN(7) (gravações duram entre 30 a 60 min), adquira e digitalize os traços de corrente intracelular e tensão a partir de uma amostragem de eletrometro neurofisiológico à taxa de 5 kHz com uma aquisição de dados digitais (Analógico ao Digital, A a D) e sistema de estimulação (Digital to Analógico, D a A), e exibir em uma tela de computador.NOTA: Qualquer software comercial ou personalizado e placa de A a D/D para A pode ser usada para aquisição de dados (A a D). D para A e software personalizado são necessários para grampo dinâmico. Sob um steromicroscope a 50-100x com iluminação de campo escuro de baixo, identifique provisoriamente um neurônio HN(7) do par bilateral por sua localização canônica na posição posteriolateral no gânglio do corpo médio sete. Agora procure penetrar no neurônio putativo HN(7) com uma microeletrodiça afiada preenchida com acetato de potássio de 2 M e 20 mM KCl usando um micromanipulador. Coloque a microeletrídria bem perto do corpo da célula alvo. Observe continuamente o potencial registrado com o eletrometro, e estabeleça esse potencial para zero mV antes de penetrar no neurônio. Penetre o neurônio com o microeletro, dirigindo lentamente o eletrodo ao longo de seu longo eixo com o manipulador. Utilizando a função de zumbido eletrometro, fixada em 100 ms de duração do zumbido, até que seja observada uma mudança negativa no potencial da membrana e atividade de espeto vigoroso. Defina o eletrometro no modo de fixação atual descontínua (DCC) ≥ 3 kHz para registrar simultaneamente o potencial da membrana e passar corrente com o microeletrol (compensação de capacidade definida para um pouco abaixo do toque e, em seguida, discada para trás 10%). Monitore a fixação do eletrodo durante o DCC em um osciloscópio. Injete uma corrente constante de -0,1 nA com o injetor de corrente estável eletrometro por um minuto ou dois para estabilizar a gravação. Identifique definitivamente o neurônio HN(7) por sua forma característica de pico e atividade de estouro fraca(Figura 1Ci). Execute qualquer análise de dados offline após a conclusão do experimento e salve todos os dados em um disco. 3. Construa um HN em tempo real ou outro neurônio modelo Crie software personalizado usando uma placa de processamento de sinal digital (DSB; D para A e A a D) em um computador de mesa para implementar em tempo real as correntes do modelo descritas em2,4 ou diferentes correntes de modelo para outros neurônios ou experimentos. Use equações de estilo Hodgkin-Huxley, pois elas são o método geralmente preferido para representar correntes de modelos. Consulte7 para obter uma descrição detalhada da implementação do modelo HN em tempo real e do grampo dinâmico antes da adição da corrente da bomba. Consulte a seção de introdução para a descrição das correntes, na+ concentração intracelular e conduções do neurônio HN(7) vivo no modelo HN. 4. Implementar e variar conduências/correntes dinâmicas do grampo Use o software de grampo dinâmico personalizado para o DSB implementar e alterar em tempo real grampo dinâmico qualquer uma das interfaces de usuáriográfica (Figura 3) (GUI) acessíveis, conducionas programadas e correntes do modelo HN em tempo real do neurônio HN(7).NOTA: Como lembrete, e são a condutância máxima da persistente Corrente Na+ (IP) e da corrente máxima da bomba(eubomba),respectivamente. Use caixas de entrada GUI no software para fazer alterações, pois o modelo está em execução, na (caixa PumpMaxL) e (caixa GpinHNLive)(Figura 3).NOTA: As caixas de entrada gui aceitam valores digitados, e são recomendadas etapas de 0,1 nA para e as etapas de 1 nS são recomendadas para . Adicione pequenas quantidades de e com grampo dinâmico para estabilizar o estouro do neurônio HN(7), que é enfraquecido por um vazamento induzido por microeletrodos, como mostrado na Figura 1Cii.NOTA: A penetração acentuada da microelerodia causa danos à membrana expressos como aumento da condutância do vazamento ou diminuição da resistência à entrada. Comece adicionando um valor de 0,1-0,2 nA, que compensa o vazamento induzido pela microeletrico, mas deprime a excitabilidade e, em seguida, aumenta gradualmente, o que aumenta a excitabilidade, até que o estouro regular se segue, geralmente em ~1-4 nS(Figura 4A). Sistematicamente co-variam essas correntes (incrementos de 0,1 nA para e 1 nS para ) ao neurônio HN(7) registrado com grampo dinâmico(Figura 3),e avaliam seus efeitos sobre características de explosão: frequência de pico (f: a recíproca da média do intervalo interspique durante uma explosão), intervalo interexplorativo (IBI: o tempo entre o último pico em um estouro para o primeiro pico na próxima rajada), duração do estouro (BD: o tempo entre o primeiro pico em uma rajada e o último pico em uma rajada), e período de explosão (T: o tempo entre o primeiro pico em uma rajada e o primeiro pico na explosão subsequente). Mude os valores e, como na demonstração de vídeo, para se familiarizar com a técnica e, em seguida, se aventurar. Segure-se em um valor fixo específico e varrer em incrementos de 1 nS sobre uma gama de suporte atividade de estouro regular. Agora aumente o valor fixo de 0,1 nA e volte a varrer uma gama de suporte à atividade de estouro regular. Para cada par de parâmetros implementados, colete dados contendo pelo menos 8 rajadas para que medidas médias confiáveis de f, IBI, BD e T possam ser feitas. Continue com varreduras enquanto o neurônio permanecer viável, como avaliado por forte espetamento e um potencial de oscilação estável na linha de base. Coletar dados de vários neurônios (de diferentes animais) para gerar um gráfico composto(Figura 5).

Representative Results

A modelagem com a adição de Ipump4 trouxe os achados experimentais apresentados na seção de introdução em foco mais nítido e começou a explicar o mecanismo assistido pela bomba de estouro. O modelo em tempo real demonstrado aqui foi ajustado ( e parâmetros escolhidos) para que produza atividade rítmica regular caindo dentro dos limites da atividade normal, como observado em experimentos – f, IBI, BD, T – e continue a produzir tal atividade quando os parâmetros modulados pela miomodulina (a corrente máxima da bomba) e (condutância máxima da corrente H) são variados ou co-variados no modelo. Os valores dos parâmetros determinados podem ser usados como um conjunto de referência ou canônico para experimentos de modelagem. Nestes casos de modelo, eubombeio oscila ao longo do ciclo de estouro como [Na+]i em torno de um nível de linha de base. Abomba contribui para o término do estouro durante a fase de estouro, e a hiperpolarização que produz ativa Ih durante o IBI; observe o nível máximo de Ih perto de iniciação de explosão(Figura 2). Embora o modelo HN em tempo real tenha implementado todas as correntes2,4 disponíveis para fixação dinâmica, o foco aqui estava e , que estão disponíveis para alterações enquanto o modelo está em execução no grampo dinâmico GUI (Figura 3). O grampo dinâmico permite que o experimentador adicione (ou subtraia com uma ou ) conduance negativa ou corrente em um neurônio artificialmente que imita a tensão e a dependência iônica de uma condutância real ou corrente. Assim, é possível explorar plenamente como uma determinada conduência/corrente interage com as conduências/correntes endógenas dentro das células(Figura 1). O modelo HN em tempo real indica que a persistente corrente Na+ (IP) nos neurônios HN contribui muito com a entrada Na+ que afeta fortemente [Na+]i (Figura 2) e, portanto, eubombeio. Como iP é ativo em potenciais de membrana relativamente negativos, ele se opõe a eubombear mesmo durante o IBI. Essas observações indicam que é instrutivo explorar interações entre e em neurônios HN isolados com grampo dinâmico como discutido anteriormente8,9,10. Esses experimentos (em andamento) são realizados com gravações afiadas de microeletrodos em neurônios HN(7) isolados (sétimo gânglio cortado do cabo nervoso). Até o momento, esses experimentos mostram que o estouro robusto é restaurado em neurônios HN tonicamente ativos (devido à penetração de microeletrodo introduzido vazamento) por co-adição de bomba IP e I com grampo dinâmico(Figura 4). Esta é uma observação importante indicando que um mecanismo de estouro está disponível nesses neurônios (mesmo quando o vazamento está comprometido) que resulta da interação de Ibomba e IP. Resultados preliminares indicam sua forte interação complicada, que pode ser explorada no modelo e experimentos(Figura 5). Em conclusão, eu bombeio em resposta a aumentos periódicos em [Na+]i durante a atividade de estouro contribui para o ritmo de estouro através de terminação de estouro (diminuição de BD). A interação da bomba IP e I constitui um mecanismo suficiente para suportar a atividade de estouro endógeno; este mecanismo pode restabelecer o estouro robusto em interneurônios HN registrados intracelularmente no gânglio 7. A interação entre IP e Ibombeio através [Na+]afeta o período de estouro HN não monotonicamente e garante robustez do estouro autônomo. Essas conclusões estão em consonância com experimentos e modelagem em sistemas de vertebrados11,12. Figura 1: Cirurgia elétrica de coração de sanguessuga e implementação de I bomba e IP com grampo dinâmico. (A) Atividade normal de estouro registrada simultaneamente, extracelularmente (superior) e intracelular (inferior), em um HCO de batimentos cardíacos de sanguessuga de um terceiro gânglio, um esquema dos neurônios registrados e suas conexões sinápticas mutuamente inibitórias à direita. (B) Esquema de grampo dinâmico ao registrar um interneuron HN(7) em um gânglio isolado 7; note que não há interação sináptica entre os dois interneurônios HN(7). (Ci) Estourando em um interneuron HN(7) comprometido por vazamento. (Cii) Um estouro mais robusto pode ser produzido adicionando a bomba dinâmica de grampo I ( = 0,1 nA), que compensa o vazamento induzido por microeletroda, mas deprime a excitabilidade, e (1 nS), o que aumenta a excitabilidade. Linhas tracejadas pretas indicam valores de linha de base. Abreviaturas: HN = interneuron cardíaco; HCO = oscilador de meio centro; Eubombeio = corrente externa; IP = Na persistente+ corrente; = maximal Na+/K+ corrente da bomba; = condutância máxima da persistente Na+ corrente; Vm = potencial de membrana; [Na+] i = concentração interna de Na+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Modelo de interneurônio HN único mostrando traços para potencial de membrana (Vm), I h, Ipump, [Na+]i, e IP. As correntes hiperpolarizantes externas são negativas, e as correntes despolarizantes para dentro são positivas. Linhas tracejadas pretas indicam valores de linha de base. Abreviaturas: HN = interneuron cardíaco; Eubombeio = corrente externa; IP = Na persistente+ corrente; = maximal Na+/K+ corrente da bomba; Ih = corrente interior ativada por hiperpolarização; = condutância máxima da persistente Na+ corrente; = condutância máxima da corrente interior ativada pela hiperpolarização; Vm = potencial de membrana; [Na+] i = concentração interna de Na+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Interface gráfica do usuário do modelo de interneuron cardíaco (HN) em tempo real e grampo dinâmico implementado em uma placa de processamento de sinal digital. Superior Esquerdo: As caixas de matemática vermelha são caixas de parâmetros determinadas pelo usuário para o modelo em tempo real, enquanto as caixas Blue Live são caixas de parâmetros determinadas pelo usuário usadas no grampo dinâmico. El = o potencial de reversão da corrente de vazamento; Gl = condução de vazamento; Gh = condução máxima h-corrente; Gp = Condução máxima de corrente P; GCaS = condução máxima de corrente de cálcio lento; PumpMax = corrente máxima da bomba; [Condutância sinapática máxima GSyn2 para o respectivo neurônio; ThreshSyn2 limiar de cruzamento de picos para mediar um potencial sináptico – estes usados para fazer um híbrido (vivo/modelo) oscilador de meio centro não ilustrado aqui.]. Inferior esquerdo para grampo dinâmico. À esquerda estão 5 valores computados de variáveis de grampo dinâmico: Ibomba = corrente de bomba injetada; Ih = corrente h injetada (não utilizada aqui); IP = Corrente P injetada; NaI = na+ concentração interna calculada; ENa = potencial de reversão de sódio calculado. Inferior esquerdo para grampo dinâmico. À direita das variáveis computadas estão 6 caixas de parâmetros determinadas pelo usuário: GNa = uso de condutância máxima de sódio rápido e endógeno para calcular Na+ fluxo associado aos potenciais de ação; PumpMaxL = corrente máxima da bomba a ser injetada por grampo dinâmico; Naih ver equação (2); Gh = condutalidade máxima para determinar a corrente h a ser injetada por grampo dinâmico; Gp = uso de condutância máxima de corrente endogensa P para calcular Na+ fluxo associado à corrente P endógena; GpinHNLive = condução máxima para determinar a corrente P a ser injetada por grampo dinâmico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Análise dinâmica do grampo do estouro independente de HN(7). A regulação de (A) 4.0 nS para(B) 9.0 nS retarda o ritmo de explosão HN independente. Traços experimentais mostram estouro rítmico em neurônio HN(7) isolado com grampo dinâmico. As faixas de oscilação de [Na+]i e Vm aumentam com o aumento regulamentado . Traços de cima a baixo: Vm gravado, injetado i bomba,calculado [Na+]i, e injetado IP. Linhas tracejadas pretas indicam valores de linha de base. Abreviaturas: HN = interneuron cardíaco; Eubombeio = corrente externa; IP = Na persistente+ corrente; = maximal Na+/K+ corrente da bomba; = condutância máxima da persistente Na+ corrente; Vm = potencial de membrana; [Na+] i = concentração interna de Na+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Análise dinâmica do grampo do HN(7) independente. A regulação tende a diminuir, seguida de um aumento do período de estouro do HN. Em experimentos individuais (pontos conectados por linhas) utilizando grampo dinâmico, os valores foram varridos enquanto eram mantidos constantes. As cores representam diferentes níveis constantes de adicionados usados em diferentes experimentos. Abreviaturas: HN = interneuron cardíaco; = maximal Na+/K+ corrente da bomba; = condutância máxima da corrente na+ persistente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Modelagem, grampo dinâmico e as análises resultantes que permitem são técnicas úteis para explorar como indivíduos e grupos de conduência/correntes iônicas contribuem para a atividade elétrica dos neurônios(Figura 1, Figura 2,Figura 4e Figura 5). O uso dessas técnicas mostra como a corrente de bomba Na⁺/K⁺ (eu_bombeio)interage com correntes fechadas de tensão, particularmente a persistente Corrente Na⁺ (I_P),para promover uma explosão robusta no núcleo de HNs do gerador de batimentos cardíacos de sanguessuga. Combinando experimentos dinâmicos de grampos e modelagem, é possível testar modelos mais diretamente do que é possível com técnicas comuns de gravação de tensão e grampo de corrente. Os resultados obtidos a partir dos experimentos dinâmicos de grampo(Figura 5) serãoutilizados para refinar ainda mais o modelo HN. O método básico de fixação dinâmica demonstrado aqui pode ser personalizado para refletir as propriedades de qualquer neurônio em estudo se um modelo matemático de correntes neuronais pode ser determinado com experimentos de grampo de tensão.

A conclusão bem sucedida dos experimentos do tipo aqui mostrados requer um empetivo cuidadoso de um HN ou outro neurônio ao usar uma microeletrídra afiada, pois o forte estouro é reduzido pela penetração de eletrodos¹. (Técnicas de gravação de patches de células inteiras, que minimizam o vazamento introduzido, também são aplicáveis a outros neurônios, mas não funcionam bem em neurônios de sanguessuga.) É fundamental que o emalamento do neurônio HN cause danos mínimos ao neurônio (vazamento adicional), e a resistência à entrada deve ser monitorada e deve estar na faixa de 60-100 MOhms para experimentos bem sucedidos⁴.

O grampo dinâmico é uma técnica poderosa, mas tem limitações impostas pela geometria neuronal porque as condutâncias artificiais são implementadas no local do eletrodo de gravação – geralmente o corpo celular não no local onde as correntes geradoras de ritmo são geralmente localizadas^5,^6,¹⁰. Nos neurônios HN de sanguessuga, o corpo celular está eletricamente próximo da zona de integração (neurite principal) do neurônio onde a maioria das correntes ativas são localizadas, e picos são iniciados.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Christian Erxleben por experimentos preliminares de grampo dinâmico em neurônios HN(7) que demonstraram suas capacidades de estouro. Angela Wenning ajudou os experimentos com conselhos de especialistas. Reconhecemos o NIH por financiar este trabalho através do Grant 1 R21 NS111355 para gsc e RLC.

Materials

ANIMALS
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		live leeches 2-3 grams
CHEMICALS
ARTIFICIAL POND WATER
CaCl₂	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM add last after adjusting pH
glucose	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sea salt )	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v) diluted in deionized water
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N Solution	Sigma Aldrich	2105-50ML	Adjust to pH 7.4 with NaOH
MICROELECTRODES
K Acetate	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
SALINE
EQUIPMENT
#5 Forceps	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	For general leech dissection
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Black resin	Dow Sylguard	170	Lines general dissect dish
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter	A-M Systems	615000	For fabricating sharp microelectrodes
Clear resin	Dow Sylguard	184	Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy
Dark field condenser	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	For illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Digital signal processing board	dSpace	CLP1104	Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	For fabricating sharp microelectrodes
Fiber-Lite high intensity illuminator	Dolan Jenner Industries	170D	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Headstage amplifier for AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Gain:0.1LU	Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Light guide	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes
Micromanipulator controller	Sutter Instruments	MPC-200	Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes
Minuten pins	BioQuip	0.15 mm diameter 1208SA	Should be shortened by curtting to ~5 mm
Optical Breadboard 3' x 5' x 8"	Newport	Obsolete	With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Oscilloscope	HAMEG Instruments	HM303-6	To monitor electrode setteling during DCC
Pascheff-Wolff spring scissors	Moria		Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92
pClamp 9 Software	Axon Instruments	9	Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Pneumatic Isolators 28"	Newport	Obsolete	With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Simulink / MATLAB software	MathWorks	2006 (Obsolete)	Implements dynamic clamp on the digital signal processing board
Stereomicroscope	Wild	M5A	10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia
Steromicroscope	Wild	M5	20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	For general leech dissection

Referências

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Citar este artigo

Erazo-Toscano, R. J., Ellingson, P. J., Calabrese, R. L., Cymbalyuk, G. S. Contribution of the Na⁺/K⁺ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses. J. Vis. Exp. (171), e61473, doi:10.3791/61473 (2021).