Contribution of the Na<sup>+</sup>/K<sup>+</sup> Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Ricardo  Javier Erazo-Toscano; Parker  J. Ellingson; Ronald  L. Calabrese; Gennady  S. Cymbalyuk

doi:10.3791/61473

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Biologia

Na⁺/K⁺ 펌프의 리듬 버스트에 기여, 모델링 및 동적 클램프 분석으로 탐구

Published: May 09, 2021

doi:

10.3791/61473

Ricardo Javier Erazo-Toscano^1,2, Parker J. Ellingson², Ronald L. Calabrese*¹, Gennady S. Cymbalyuk*²

¹Department of Biology,Emory University, ²Neuroscience Institute,Georgia State University

Summary

여기에 소개된 Na⁺/K⁺ 펌프및 동적 클램프를 사용하여 거머리 심장 인터뉴런의 지속적인 Na⁺ 전류의 역할을 조사하는 방법이 있습니다.

Abstract

Na⁺/ K⁺ 펌프는 종종 뉴런 활동에서 배경 기능으로 생각, Na + ([Na^+] i)의내부 농도에 반응 하는 외류 전류(I_펌프)를기여. 리듬운동을 생성하는 중앙 패턴 발생기(CPG) 뉴런 네트워크에서 발견되는 뉴런과 같은 파열뉴런에서 [Na^+]_i 및 I _펌프는 버스트 사이클 전반에 걸쳐 달라질 것으로 예상될 수 있다. 멤브레인 전위로부터의 독립성과 결합된 전기 활동에 대한 이러한 반응성은 채널 기반 전류(예: 전압 또는 송신기 게이트 또는 누설 채널)에 흔하지 않은 동적 특성을 가진 _{i 펌프를} 제공합니다. 더욱이, 많은 뉴런에서, 펌프의 활동은 다양한 변조기에 의해 변조되어, 리듬 파열 활동에서 내가_펌프의 잠재적 인 역할을 더욱 확장한다. 이 백서는 모델링 및 동적 클램프 방법의 조합을 사용하여 CPG에서 지속적인 Na⁺ 현재의 리듬 활동에 영향을 미치는 방법을 결정합니다. 특히,이 논문은 약용 거머리의 심장 신경 신경에 동적 클램프 프로토콜 및 계산 모델링 방법에 초점을 맞출 것이다.

Introduction

거머리의 심장 박동은 많은 중간 체세그먼트 신경질에 걸쳐 분포 심장 interneurons (HNs)의 9 양측 쌍으로 구성된 CPG에 의해 구동된다. CPG의 핵심은 반중심 발진기(HKO)를 형성하는^3rd 및 4^단층 신경리아에 위치한 인터뉴런의 상호 억제 쌍(도1A)이다. 이러한 뉴런은 비큐컬라인^1을사용하여 약리학적으로 합성적으로 분리될 때 계속 파열됩니다. ^7단 국고(이 프로토콜의 초점)의 쌍과 같은 다른 것들은 합성적으로 분리될 때 파열된 활동을 생성할 수 있는 터퍼입니다. 그들은 상호 연결되지 않고 내림차순 입력만 수신하므로 신경 코드의 나머지 부분에서 신경절을 분리하여 쉽게 격리됩니다. 이러한 독립적인 파열 활동은 레코딩을 위한 날카로운 미세 전극으로 침투하여 발생하는 유입전류에 민감하지만 느슨한 패치 방법^1로기록될 때 격렬하게 파열된다.

개별 HN 뉴런과 HN HKO 모두 모델링(호지킨-Huxley 계 단일 등색형 구획 모델 모두 실험적으로 확인된 전압 게이트 및 시냅스 전류를 포함하는 HN 뉴런의 단일 등산구 모델) 및 살아있는 시스템의 모든 버스트 특성이 성공적으로 포착되었다^2. 거머리의 내인성 신경펩티드인 Myomodulin은 고립된 HN 뉴런과 HN HKO의 파열 리듬의 기간(T)을 현저히 감소시합니다. 이 변조기는 h-전류(과극 활성화 내전류, I _hh)를증가시키고 펌프^3을감소시키는 역할을 한다. 이 관찰은 내가_펌프가 I_h와상호 작용하는 방법과 공동 변조가 HN 뉴런의 리듬 활동에 어떻게 기여하는지에 대한 탐구로 이어졌습니다. [Na^+]i(이오노포레 모넨신을 사용하여)를 증가시켜 펌프의 활성화는 HN HKO와 고립된 HN 뉴런⁴모두에서 HN 버스트 리듬을 가속화한다. 이 속도 향상은 I_h에 의존하였다. 그러나, 버스트 지속시간(BD)은 축소되었고, 인터버스트 간격(IBI)은 HN HKO와 고립된 HN 뉴런⁴모두에서 증가했다.

이 프로토콜의 경우, 펌프 전류를 포함한 살아있는 HN(7) 뉴런의 모든 전류가 다음과 같이 HN 모델에 통합된다.

(1)

여기서 C는 막 정전용량(nF)인 경우, V는 멤브레인 전위(V), t는 시간(s)이다. 자세한 이온 전류 설명 및 방정식은 다른 곳에서 설명되었습니다^2,⁴. 완전한 HN 모델 뉴런은 실시간으로 실행됩니다(그림2). 이 소프트웨어는 게시 시 GitHub에서 사용할 수 있으며 재료 표에 설명된 디지털 신호 처리 보드에서 실행하는 것이 적합합니다. 여기서문의 초점은 Na⁺/K⁺ 펌프 전류(I_pump)및 전압 게이트 전류가 중요한 Na⁺ 플럭스를 기여합니다: 빠른 Na⁺ 전류(I_Na)및 영구 Na⁺ 전류(I_P). 이러한 전류의 최대 전도도는 각각 다수입니다. Na⁺/K⁺ 펌프는 두 개의 세포 외 K⁺ 이온에 대한 세 개의 세포 내 Na⁺ 이온을 교환하여 순 바깥쪽 전류를 생성합니다. 중요 한 것은, 그것은 펌프 3 배 많은 Na⁺ 이 전류가 나타내는 대로 뉴런에서, 세포 내 Na⁺ 농도 계산에 중요 하다.

Na⁺/K⁺ 펌프 전류는 세포 내 Na⁺ 농도에 따라 다르며 다음과 같은 시그로이드 기능에 의해 표현됩니다.

(2)

여기서 [Na]_i는 세포내 나⁺ 농도이고, 최대 나⁺/ K⁺ 펌프 전류이며, [Na]_ih는 Na⁺K⁺ 펌프의 반 활성화를 위한 세포내 Na⁺ _{농도이며,} [Na]는 Na⁺/K⁺ 펌프의 감도이다 [ Na]_i. [Na]_I _P와 I _Na에 의해 운반되는 Na⁺ 유입의 결과로 빌드하고 Na⁺/ K⁺ 펌프의 Na⁺ efflux에 의해 감소됩니다. 총 Na⁺ 플럭스로_I _h와 누출의기여는 작고 실시간 모델에서는 고려되지 않습니다.

(3)

여기서, v는 세포내 Na⁺ 저수지의 부피(~6.7pL)이며, F는 패러데이의 일정하며, 세포외 Na⁺ 농도는 일정하게 유지됩니다.

전압 게이트 및 누출 전도도는 분화되어 왔으며- 계산된 세포내 Na⁺ 농도([Na^+]_i)에의해 조절되는 펌프 전류로부터 멤브레인 전위에 반응한다. 【 Na⁺】 _나는 빠른 Na⁺ 전류(I_Na)를통해 Na⁺ 항목을 통해 구축되어 동작 잠재력 (스파이크)과 스파이크를 지원하는 탈극화를 제공하는 지속적인 Na⁺ 전류(I_P)를생성합니다. 【 Na⁺】 _나는 차례로, Na^+의압출을 통해 펌프의 작용에 의해 감소된다 . 기준생활HN값(5nS)과 (150nS)가 가정되었으며, 추가된 동적 클램프를 고려한다.

여기에 설명된 프로토콜의 목표는 단일 HN에서 리듬 파열을 제어하기 위해 전압 게이트 전류(현재 프로토콜의 영구 Na⁺ 전류)와 상호 작용하는 방법을 발견하기 위해 실시간으로 정밀하고 가역적으로 _펌프를 조작하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해 동적 클램프가 사용되었으며, 이 클램프는 명령시 모델이 실행중일 때 계산할 수 있는 전류의 정확한 양을 인위적으로 도입했습니다. 이 방법은 전체 조직에 영향을 미치는 펌프의 약리학적 조작에 비해 장점이 있으며, 종종 되돌리기 어렵고 정확하게 조작할 수 없는 오프 타겟 효과가 있을 수 있습니다. 동적 클램프^5,^6은 기록된 뉴런의 전압을 실시간으로 판독(도1B)하고,모델 방정식및 임의 또는 임의의 세트값에 기초한 전류의 양을 실시간으로 계산및 주입한다. 유사한 방법은 세포내로 기록될 수 있는 모든 뉴런에 쉽게 적용될 수 있다. 그러나, 매개 변수는 선택된 신경으로 재확장되어야 할 것이고, 뉴런은 시냅스 입력, 예를 들면, 약리학적으로 격리되어야 합니다.

Protocol

참고: 무척추 동물 실험 과목은 NIH 또는 에모리 와 조지아 주립 대학에 의해 규제되지 않습니다. 그럼에도 불구하고 모든 조치는이 작업에 사용되는 거머리의 고통을 최소화하기 위해 취해졌습니다. 1. 거머리 신경 코드에서 고립 된 신경절 7을 준비하십시오. 12:12 광암 사이클에서 16°C에서 이온화 된 물에 희석 된 인공 연못 물 (바다 소금 의 0.05 % w /v 포함)에서 거머리를 유지하십시오. 움직이지 않을 때까지 > 10분 동안 분쇄된 얼음 침대에서 차가운 마취를 통해 거머리를 해부할 수 있도록 준비하십시오. 115m MM NaCl, 4mM KCl, 1.7m CaCl2,10mM D-포도당, 10mM HEPES를 함유한 냉각식식으로 수지 안감이 있는 해부 접시를 10m M HEPES를 이온화 수역에서 채웁니다. pH는 M NaOH 1으로 7.4로 조정되었습니다. 거머리 등쪽을 검은 수지 안감 챔버에 고정하십시오 (적어도 2cm 두께의 수지 위의 깊이가 20cm x 10cm 이상). 경사 광 가이드 조명이 있는 20배배율의 스테로현미경으로, 몸의 로스트랄 1/3rd 부분의 체벽을 통해 5mm 스프링 가위로 길이가 3cm 이상 세로절단된다. 핀을 사용하여 바디 벽을 제쳐두고 내부 장기를 노출시십시오.참고: 저장된 혈액 식사는 불을 닦은 파스퇴르 파이펫으로 흡입하여 제거할 수 있습니다. 개별 중간 몸 신경절 을 분리 7 (뇌에 일곱 번째 무료 세그먼트 신경절 코달). 신경 코드가 5mm 스프링 가위를 사용하여 있는 부비동을 엽니다. 부비동을 두 개의 부비동을 남기고 통풍구를 나누어 야 합니다. 날카로운 #5 집게를 사용하여 절단을 안내하고 부비동을 잡습니다. 신경절에서 나오는 두 양자 신경 뿌리각각에 부착된 부비동을 보관하여 신경절을 고정하기 위해 이러한 부비동 스트립을 사용하십시오. 간질과 코골 결합 신경 번들을 잘라서 몸에서 신경절을 제거하여 (가능한 한 7th 신경절에서 멀리) 및 부비동 스트립을 연결한 다음 뿌리를 부비동에서 나오는 곳으로 잘라냅니다. 졸리온(낡은 무딘 #5 집게 사용)을 미세한 곤충 핀으로 고정하고, 복부 쪽을 위로, 투명하고 수지 라이닝 페트리 접시에 놓습니다. 부비동 의 스트립에 핀을 삽입하고 가능한 한 간음에서 멀리, 뿌리와 장미와 코달 결합을 준수 느슨한 조직.참고: 아래에서 좋은 조명이 녹음 중에 달성되어야 하는 경우 수지는 3mm보다 두껍지 않아야 합니다. 신경절이 세로와 측면모두에서 팽팽한지 확인하십시오. 스테레오현미경의 배율을 40배 이상으로 늘리고, 경외세포체가 회음관 바로 아래 의 복부 표면에서 쉽게 볼 수 있도록 경사 조명을 조절한다. 신경절(desheath)의 회음절을 미세 시저로 제거합니다. 한쪽에 있는 뿌리 사이의 느슨한 칼집을 자르고 옆으로 절단을 계속하여 가위 블레이드를 피상적으로 유지하고 칼집 바로 아래에 있는 신경 세포 체에 해를 끼치지 않도록 하십시오. 중간선을 따라 측면 컷에서 비슷한 피상적 인 컷을 확인합니다. 이제 미세 #5 집약과 한쪽에 칼집의 caudolateral 플랩을 잡아, 신경절에서 멀리 당겨, 그리고 미세 시저로 잘라. 다른 쪽에서 반복; 이 절차는 미세 전극으로 기록하기 위한 HN(7) 뉴런을 모두 노출시합니다. 준비 접시를 레코딩 설정에 놓고 실온에서 5mL/min의 유량으로 식염수를 겹칩니다. 2. 날카로운 미세 전극으로 거머리 심장 인터뉴런을 식별하고 기록합니다. HN(7) 뉴런(기록30~60분)의 기록 기간 동안, 디지털 데이터 수집(아날로그 투 디지털, A ~D) 및 자극(디지털 아날로그, D~A) 시스템으로 신경생리적 전기계 샘플링으로부터 세포내 전류 및 전압 추적을 5kHz의 속도로 획득 및 디지털화하고, 컴퓨터 화면에 표시됩니다.참고: 모든 상용 또는 맞춤형 소프트웨어및 A ~D/D 에서 A- 보드로 데이터 수집(A ~ D)에 사용할 수 있습니다. 동적 클램프에는 D에서 A 및 맞춤형 소프트웨어가 필요합니다. 아래에서 암필드 조명이 있는 50-100x의 스테로현미경으로, 중구 신경절 7의 후방 위치에 있는 정경적 위치에 의해 양측 쌍의 HN(7) 뉴런을 잠정적으로 식별한다. 이제 미세 조작기를 사용하여 2M 칼륨 아세테이트및 20mM KCl로 채워진 날카로운 미세 전극으로 퍼티얼 HN(7) 뉴런을 관통하는 것을 목표로 하고 있다. 미세 전극을 표적 세포 몸 체 근처에 배치합니다. 지속적으로 전극계와 기록된 전위를 관찰하고, 뉴런을 관통하기 전에 이 잠재력을 0mV로 설정한다. 조작기와 함께 긴 축을 따라 전극을 천천히 운전하여 마이크로 전극으로 뉴런을 관통하십시오. 전기계 버즈 기능을 사용하여 멤브레인 전위 및 격렬한 스파이크 활동의 부정적인 변화가 관찰 될 때까지 100 ms 버즈 지속 시간으로 설정됩니다. 불연속 전류 클램프 모드(DCC)≥ 3kHz에서 전기계를 설정하여 멤브레인 전위를 동시에 기록하고 단일 마이크로 전극(용량 보정이 링링 바로 아래에 설정된 다음 10%)으로 전류를 통과합니다. 진동에 DCC 동안 전극의 침전을 모니터링합니다. 기록을 안정화하기 위해 1~2분 동안 전기계 의 꾸준한 전류 인젝터와 -0.1 nA의 꾸준한 전류를 주입한다. HN(7) 뉴런을 특성스파이크 형상및 약한 파열활성(도1Ci)으로결정적으로 식별한다. 실험이 완료된 후 오프라인으로 모든 데이터 분석을 수행하고 디스크에 모든 데이터를 저장합니다. 3. 실시간 HN 또는 다른 모델 뉴런 을 구축 디지털 신호 처리 보드(DSB)를 사용하여 사용자 지정 소프트웨어를 빌드합니다. 책상 톱 컴퓨터에서 D to A 및 A) 다른 뉴런 또는 실험에 대해2,4 또는 상이한 모델 전류에 기술된 모델 전류를 실시간으로 구현한다. 호지킨-Huxley 스타일 방정식을 모델 전류를 나타내는 일반적으로 선호하는 방법입니다. 펌프 전류를 추가하기 전에 실시간 HN 모델 및 동적 클램프의 구현에 대한 자세한 설명은7을 참조하십시오. HN 모델에서 살아있는 HN(7) 뉴런의 전류, 세포내 Na+ 농도 및 전도도에 대한 설명을 위한 소개 섹션을 참조하십시오. 4. 동적 클램프 전도도/전류를 구현하고 변화시 DSB에 대한 맞춤형 동적 클램프 소프트웨어를 사용하여 HN(7) 뉴런의 HN 실시간 모델의 그래픽 사용자인터페이스(그림 3)(GUI)에 액세스할 수 있는 프로그래밍된 전도도 및 전류중 임의의 실시간 동적 클램프를 구현하고 변경합니다.참고 : 상기로, 각각 영구 Na + 전류(IP)와최대 펌프 전류(I펌프)의최대 전도도이다. 모델이 실행 중이기 때문에 소프트웨어에서 GUI 엔트리 박스를 사용하여 (PumpMaxL 상자) 및 (GinHNLive 상자)(그림 3)에서변경합니다.참고: GUI 입력 상자는 입력된 값을 허용하며 0.1 nA 단계는 권장되며 1nS의 단계를 권장합니다. 도 1Cii에도시된 바와 같이 소량의 및 동적 클램프를 사용하여 미세 전극 유도 누출에 의해 약화되는 HN(7) 뉴런의 파열을 안정화한다.참고: 날카로운 미세 전극 침투는 누출 전도도 증가 또는 입력 저항 감소로 표현되는 막 손상을 일으킵니다. 먼저 0.1-0.2nA의 값을 추가하여 마이크로전극 유도 누출을 만회하지만 흥분성을 저하시킨 다음 점차 증가하여 일반 파열이 계속될 때까지 일반적으로 ~1-4nS(그림4A)로증가한다. 이러한 전류(0.1nA의 증분 및 1nS용)를 기록된 HN(7) 뉴런으로, 기록된 HN(7) 뉴런에 동적 클램프(그림3)를조정하고, 버스트 특성에 미치는 영향을 평가합니다: 스파이크 주파수(f: 버스트 동안 인터스파이크 간격의 평균의 상호작용), 인터버스트 간격(IBI: 마지막 스파이크 사이의 시간). 버스트 지속 시간(BD: 버스트에서 첫 번째 스파이크와 버스트의 마지막 스파이크 사이의 시간), 버스트 기간(T: 버스트에서 첫 번째 스파이크와 후속 버스트의 첫 번째 스파이크 사이의 시간). 비디오 데모에서와 같이 값을 변경하고 기술에 익숙해지고 밖으로 내다보세요. 특정 고정 값을 유지하고 정기적인 파열 활동을 지원하는 범위의 1nS 단위로 스윕합니다. 이제 고정 값을 0.1 nA로 늘리고 정규 파열 활동을 지원하는 범위를 다시 스윕합니다. 구현된 각 매개변수 쌍에 대해 최소 8개의 버스트가 포함된 데이터를 수집하여 F, IBI, BD 및 T의 신뢰할 수 있는 평균 측정값을 만들 수 있습니다. 강한 스파이크와 진동의 안정적인 기준 잠재력에 의해 평가로, 뉴런이 실행 가능한 남아있는 한 스윕을 계속. 복합그래프(그림 5)를생성하기 위해 여러 뉴런(다른 동물로부터)으로부터 데이터를 수집합니다.

Representative Results

I펌프4를 추가하여 모델링하는 것은 도입 섹션에서 제시된 실험적 결과를 선명한 초점으로 가져왔고 파열의 펌프 보조 메커니즘을 설명하기 시작했습니다. 여기서 입증된 실시간 모델은 f, IBI, BD, T – 실험에서 관찰된 바와 같이 정상 활동의 범위 내에 떨어지는 정기적인 리듬 활성을 생성하도록 조정되었으며, 근모계 변조 파라미터(최대 펌프 전류) 및(h-current의 최대 전도성)가 다양하거나 다양할 때 이러한 활성을 계속 생산하고 있다. 결정된 매개 변수 값은 모델링 실험을 위한 벤치마크 또는 정식 집합으로 사용할 수 있습니다. 이러한 모델 인스턴스에서, 나는 [Na+]i기준 수준 주위에 버스트 사이클 전체에 걸쳐 진동을 펌프. 펌프는 버스트 단계 동안 버스트 종료에 기여하고, 생성되는 과극화는 IBI 동안 Ih를 활성화한다; 버스트개시(그림 2)에가까운 IH의 최대 수준을 알 수 있습니다. 실시간 HN 모델은 모두 전류2,4를 구현하여 동적 클램핑에 사용가능하지만, 여기서 초점이 맞추어진 데, 이는 모델이 동적 클램프 GUI(그림3)에서실행되는 동안 변경에 사용할 수 있습니다. 동적 클램프를 사용하면 실험자가 실제 전도도 또는 전류의 전압 및 이온 의존성을 모방하는 모든 전도도 또는 전류를 인위적으로 뉴런에 추가(또는 음수 또는 전류로 빼는 것)을 허용합니다. 따라서, 특정 전도도/전류가 세포 내부의 내인성 전도도/전류와 상호 작용하는 방법을 완전히 탐구할 수있다(도 1). 실시간 HN 모델은 HN 뉴런의 지속적인 Na+ 전류(IP)가Na+ 항목에 크게 영향을 미치는 [Na+]i (도 2)에크게 기여하는 것을 나타내므로, 나는 펌프한다. IP는 상대적으로 부정적인 멤브레인 전위에서 활성화되어 있기 때문에 IBI 동안에도 펌프를 반대합니다. 이러한 관측은 이전에 논의된 바와 같이 동적 클램프를 가진 고립된 HN 뉴런과 격리된 HN 뉴런간의 상호 작용을 탐구하는 것이 유익하다는 것을 나타낸다 8,9,10. 이러한 실험(진행 중)은 단일, 신디사이저 절연 HN(7) 뉴런(신경 코드에서 절단된 일곱 번째 신경절)에서 날카로운 미세 전극 기록으로 수행됩니다. 현재까지, 이러한 실험은 I P와 IP의 공동 첨가에 의해 톤활성 HN 뉴런(마이크로전극 침투로 인한 누출로 인한) 강력한 파열이 회복된다는 것을 보여준다(도4). 이것은 파열 메커니즘이 이러한 뉴런에서 사용할 수 있음을 나타내는 중요한 관찰이다 (누출이 손상된 경우에도) I펌프와 IP의상호 작용에서 유래. 예비 결과는 모델 및 실험에서 탐구 할 수있는 강력한 복잡한 상호 작용을 나타냅니다(그림 5). 결론적으로, 파열 활동 중 [Na+]i의 주기적인 증가에 대응하여 펌프는 버스트 종료(BD 감소)를 통해 버스트 리듬에 기여합니다. IP와 I펌프의 상호 작용은 내인성 파열 활성을 지원하기에 충분한 메커니즘을 구성한다. 이 메커니즘은 GANGlion 7에서 세포내로 기록된 HN 인터뉴런에서 강력한 파열을 복원할 수 있다. IP와 I 사이의 상호 작용은 [Na+]나는 HN 버스트 기간에 비 모노톤으로 영향을 미치고 자율 파열의 견고성을 보장합니다. 이러한 결론은 척추 동물시스템(11,12)의실험 및모델링과일치한다. 도 1: 거르치 심장 간 전기 활동 및 동적 클램프와 IP의 구현. (A)정상 파열 활성은 동시에 기록, 세포 외 (상단) 및 세포 내 (아래), 제 3 신경절에서 거머리 심장 박동 HCO에서, 기록 된 뉴런의 회로도 및 오른쪽에 상호 억제시 냅 스 연결. (B)분리된 신경절에서 HN(7) 인터뉴런을 기록할 때 동적 클램프 회로도 7; 참고 두 HN (7) 인터뉴런 사이의 시냅스 상호 작용이 없습니다. (Ci) 누출이 손상된 HN(7) 인터뉴런에서 파열. (Cii) 더 견고한 파열은 마이크로 전극 유도 누출을 구성하는 동적 클램프 I펌프(= 0.1 nA)를 추가하여 생성될 수 있지만 흥분성을 저하시키고(1 nS)를 첨가하여 흥분성을 증가시킵니다. 검은색 파선선이 기준값을 나타냅니다. 약어: HN = 심장 인터뉴런; HCO = 하프 센터 발진기; 나는펌프 = 바깥쪽 전류; IP = 영구 Na+ 전류; = 최대 나+/ K+ 펌프 전류; = 영구 Na+ 전류의 최대 전도도; Vm = 멤브레인 전위; 【 Na+】 i = Na+의 내부 농도 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 멤브레인 전위 (Vm)에 대한 흔적을 보여주는 단일 HN 인터뉴런 모델, 나는h, 내가펌프,[Na+]i,및 IP. 외부 과극 전류는 부정적이며 내측 탈극 전류는 긍정적입니다. 검은색 파선선이 기준값을 나타냅니다. 약어: HN = 심장 인터뉴런; 나는펌프 = 바깥쪽 전류; IP = 영구 Na+ 전류; = 최대 나+/ K+ 펌프 전류; 나는h = 과극 활성화 내전류; = 영구 Na+ 전류의 최대 전도도; = 극성광 활성화 내전류의 최대 전도도; Vm = 멤브레인 전위; 【 Na+】 i = Na+의 내부 농도 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 디지털 신호 처리 보드에 구현 된 실시간 심장 인터뉴런 (HN) 모델 및 동적 클램프의 그래픽 사용자 인터페이스. 왼쪽 위: 빨간색 수학 상자는 실시간 모델에 대한 사용자 결정 매개 변수 상자인 반면 Blue Live 상자는 동적 클램프에 사용되는 사용자 결정 매개 변수 상자입니다. El = 누출 전류의 반전 잠재력; Gl = 누출 전도도; Gh = h-전류 최대 전도도; Gp = P 전류 최대 전도도; GCaS = 느린 칼슘 전류 최대 전도도; PumpMax = 펌프 최대 전류; [GSyn2 각 뉴런에 대한 최대 시냅스 전도도; ThreshSyn2 스파이크 교차 임계값 시 냅 스 내 전위 중재 -이 하이브리드 를 만드는 데 사용 (생활/모델) 반 센터 발진기 여기에 설명 되지.]. 동적 클램프를 위해 왼쪽 아래. 맨 왼쪽에는 동적 클램프 변수의 5가지 계산값이 있습니다: I펌프 = 펌프 전류 주입; Ih = h-전류 주입 (여기에 사용되지 않음); IP = P 전류 주입; NaI = 내부 Na+ 농도 계산; ENa = 계산된 나트륨 반전 잠재력. 동적 클램프를 위해 왼쪽 아래. 계산된 변수의 오른쪽에는 6명의 사용자가 결정된 매개변수 상자: GNa = 가정된 내인성 빠른 나트륨 최대 전도도사용으로 작용 잠재력과 관련된 Na+ 플럭스를 계산하는; 펌프맥스L = 동적 클램프에 의해 주입되는 최대 펌프 전류; 나이는 방정식을 참조하십시오 (2); Gh = 동적 클램프에 의해 주입되는 h-전류를 결정하는 최대 전도도; Gp = 내인성 P 전류와 관련된 Na+ 플럭스를 계산하기 위해 내인성 P 전류 최대 전도성 사용으로 가정; GpinHNLive = 동적 클램프에 의해 주입되는 P 전류를 결정하는 최대 전도도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 독립 HN(7) 파열의 동적 클램프 분석. (A)4.0 nS에서(B)9.0 nS의 업규제는 독립적인 HN 버스트 리듬을 느리게 한다. 실험적인 흔적은 동적 클램프를 가진 고립된 HN(7) 뉴런에서 리듬이 파열되는 것을 보여줍니다. [Na+]i 및 Vm의 진동 범위는 조절된 것으로 증가합니다. 트레이스 위쪽에서 아래쪽까지 추적: 기록된 Vm, 주입된 나는펌프,계산 [Na+]i,및 주입IP. 검은색 파선선이 기준값을 나타냅니다. 약어: HN = 심장 인터뉴런; 나는펌프 = 바깥쪽 전류; IP = 영구 Na+ 전류; = 최대 나+/ K+ 펌프 전류; = 영구 Na+ 전류의 최대 전도도; Vm = 멤브레인 전위; 【 Na+】 i = Na+의 내부 농도 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: 독립 HN(7) 파열의 동적 클램프 분석. 규제강화는 감소하고, 그 뒤를 이어 HN 버스트 기간이 증가했다. 동적 클램프를 사용하여 개별 실험(선으로 연결된 점)에서 값을 계속 유지하면서 값을 휩쓸었습니다. 색상은 서로 다른 실험에 사용되는 상수 수준을 나타냅니다. 약어: HN = 심장 인터뉴런; = 최대 나+/ K+ 펌프 전류; = 영구 Na+ 전류의 최대 전도도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

모델링, 동적 클램프 및 이들이 활성화하는 결과 분석은 이온 전도도/전류의 개별 및 그룹이 뉴런의 전기 적 활성에 어떻게 기여하는지 탐구하는 데 유용한 기술이다(그림1, 도 2, 도4,그림 5). 이러한 기술의 사용은 Na⁺/K⁺ 펌프 전류(I_펌프)가전압 게이트 전류, 특히 영구 Na⁺ 전류(I_P)와상호 작용하여 거머리 심장 박동 패턴 생성기의 코어 HN에서 견고한 파열을 촉진하는 방법을 보여줍니다. 동적 클램프 실험과 모델링을 결합하여 일반 전압 레코딩 및 전류 클램프 기술로 가능한 것보다 모델을 보다 직접적으로 테스트할 수 있습니다. 동적 클램프실험(그림 5)에서수집된 결과는 HN 모델을 더욱 구체화하는 데 사용될 것이다. 여기서 입증된 동적 클램핑의 기본 방법은 신경 전류의 수학적 모델이 전압 클램프 실험으로 결정될 수 있는 경우 연구 하에 있는 모든 뉴런의 특성을 반영하도록 사용자 지정할 수 있다.

여기에 도시된 타입의 실험의 성공적인 완성은 전기전극 침투^1에의해 강한 파열이 축소되므로 날카로운 마이크로 전극을 사용할 때 HN 또는 다른 뉴런의 주의 깊은 침전이 필요하다. (전체 세포 패치 기록 기술, 도입 된 누출을 최소화, 또한 다른 뉴런에 적용 할 수 있습니다,하지만 거머리 뉴런에 잘 작동하지 않습니다.) HN 뉴런의 침전은 뉴런에 최소한의 손상을 야기하는 것이 중요하며(추가 누출), 입력 저항을 모니터링해야 하며 성공적인 실험을 위해 60-100 MOhms의 범위에 있어야 한다^4.

동적 클램프는 강력한 기술이지만, 인공 전도도가 기록 전극의 현장에서 구현되기 때문에 신경 형상에 의해 부과되는 한계가 있는데, 이는 일반적으로 리듬 생성전류가 보통 국한된 부위에 있는 세포 체체가^5,^6,^10이다. 거머리 HN 뉴런에서, 세포 체는 대부분의 활성 전류가 국소화되는 뉴런의 통합 영역 (main neurite)에 전기적으로 가깝고 스파이크가 시작됩니다.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 그들의 파열 능력을 입증 HN (7) 뉴런에 예비 동적 클램프 실험크리스티안 Erxleben 감사합니다. 안젤라 베닝은 전문가의 조언으로 실험을 도왔다. 우리는 GSC와 RLC에 그랜트 1 R21 NS11355를 통해이 작업에 자금을 NIH를 인정합니다.

Materials

ANIMALS
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		live leeches 2-3 grams
CHEMICALS
ARTIFICIAL POND WATER
CaCl₂	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM add last after adjusting pH
glucose	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sea salt )	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v) diluted in deionized water
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N Solution	Sigma Aldrich	2105-50ML	Adjust to pH 7.4 with NaOH
MICROELECTRODES
K Acetate	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
SALINE
EQUIPMENT
#5 Forceps	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	For general leech dissection
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Black resin	Dow Sylguard	170	Lines general dissect dish
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter	A-M Systems	615000	For fabricating sharp microelectrodes
Clear resin	Dow Sylguard	184	Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy
Dark field condenser	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	For illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Digital signal processing board	dSpace	CLP1104	Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	For fabricating sharp microelectrodes
Fiber-Lite high intensity illuminator	Dolan Jenner Industries	170D	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Headstage amplifier for AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Gain:0.1LU	Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Light guide	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes
Micromanipulator controller	Sutter Instruments	MPC-200	Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes
Minuten pins	BioQuip	0.15 mm diameter 1208SA	Should be shortened by curtting to ~5 mm
Optical Breadboard 3' x 5' x 8"	Newport	Obsolete	With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Oscilloscope	HAMEG Instruments	HM303-6	To monitor electrode setteling during DCC
Pascheff-Wolff spring scissors	Moria		Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92
pClamp 9 Software	Axon Instruments	9	Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Pneumatic Isolators 28"	Newport	Obsolete	With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Simulink / MATLAB software	MathWorks	2006 (Obsolete)	Implements dynamic clamp on the digital signal processing board
Stereomicroscope	Wild	M5A	10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia
Steromicroscope	Wild	M5	20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	For general leech dissection

Referências

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Citar este artigo

Erazo-Toscano, R. J., Ellingson, P. J., Calabrese, R. L., Cymbalyuk, G. S. Contribution of the Na⁺/K⁺ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses. J. Vis. Exp. (171), e61473, doi:10.3791/61473 (2021).