Contribution of the Na<sup>+</sup>/K<sup>+</sup> Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Ricardo  Javier Erazo-Toscano; Parker  J. Ellingson; Ronald  L. Calabrese; Gennady  S. Cymbalyuk

doi:10.3791/61473

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Biologia

Beitrag der Na⁺/K⁺ Pumpe zum rhythmischen Bersten, erforscht mit Modellierung und dynamischen Klemmanalysen

Published: May 09, 2021

doi:

10.3791/61473

Ricardo Javier Erazo-Toscano^1,2, Parker J. Ellingson², Ronald L. Calabrese*¹, Gennady S. Cymbalyuk*²

¹Department of Biology,Emory University, ²Neuroscience Institute,Georgia State University

Summary

Hier wird eine Methode zur Untersuchung der Rollen der Na + /^K ⁺Pumpe und des persistenten Na⁺ Stroms in Blutegelherzinteruronen mittels dynamischer Klemme vorgestellt.

Abstract

Die Na⁺/ K⁺ Pumpe, oft als Hintergrundfunktion in der neuronalen Aktivität betrachtet, trägt einen äußeren Strom (_I-Pumpe) bei, der auf die innere Konzentration von Na⁺ ([Na⁺]_i) reagiert. Bei platzenden Neuronen, wie sie in neuronalen Netzwerken des zentralen Mustergenerators (CPG) zu finden sind, die rhythmische Bewegungen erzeugen, kann erwartet werden, dass das [Na⁺]_i und damit die _I-Pumpe während des Burst-Zyklus variieren. Diese Reaktionsfähigkeit auf elektrische Aktivität, kombiniert mit der Unabhängigkeit vom Membranpotential, verleiht _I-Pumpen dynamische Eigenschaften, die bei kanalbasierten Strömen (z. B. spannungs- oder transmittergesteuerte oder Leckkanäle) nicht üblich sind. Darüber hinaus wird in vielen Neuronen die Aktivität der Pumpe durch eine Vielzahl von Modulatoren moduliert, was die potenzielle Rolle der _I-Pumpe bei der rhythmischen Bursting-Aktivität weiter erweitert. Dieser Artikel zeigt, wie man eine Kombination aus Modellierungs- und dynamischen Klemmmethoden verwendet, um zu bestimmen, wie ich_pumpe und seine Wechselwirkung mit persistentem Na⁺ Strom die rhythmische Aktivität in einem CPG beeinflusst. Insbesondere wird sich diese Arbeit auf ein dynamisches Klemmprotokoll und computergestützte Modellierungsmethoden in Herzinterneuren von medizinischen Blutegeln konzentrieren.

Introduction

Der Herzschlag in Blutegeln wird durch ein CPG angetrieben, das aus 9 bilateralen Paaren von Herzinterneurinen (HNs) besteht, die über möglichst viele Segmentganglien im mittleren Körper verteilt sind. Im Kern des CPG befinden sich gegenseitig hemmende Paare von Interneuronen, die sich in den^3. und^4. Segmentganglien befinden und halbzentrische Oszillatoren (HCOs) bilden (Abbildung 1A). Diese Neuronen platzen weiterhin, wenn sie synaptisch pharmakologisch mit Bikukullin 1 isoliert^werden. Andere, wie das Paar in den 7. Segmentganglien (der Fokus dieses Protokolls), sind^ebenfalls Burster, die in der Lage sind, bursting Aktivität zu erzeugen, wenn sie synaptisch isoliert sind. Sie sind nicht miteinander verbunden und erhalten nur absteigenden Input und können daher leicht isoliert werden, indem das Ganglion vom Rest des Nervenstrangs getrennt wird. Diese unabhängige Berstaktivität ist empfindlich gegenüber eingebrachtem Ableitstrom, der durch das Eindringen mit scharfen Mikroelektroden zur Aufzeichnung verursacht wird, aber bei Der Aufzeichnung mit losen Patch-Methoden stark geplatzt^{ist 1}.

Sowohl einzelne HN-Neuronen als auch HN-HCOs wurden modelliert (Hodgkin-Huxley-basierte Einzelisopotentialkompartimentmodelle von HN-Neuronen, die alle experimentell identifizierten spannungsgesteuerten und synaptischen Ströme enthalten), und alle Burst-Eigenschaften des lebenden Systems wurden erfolgreich erfasst². Myomodulin, ein endogenes Neuropeptid in Blutegeln, verringert deutlich die Periode (T) des Burst-Rhythmus isolierter HN-Neuronen und HN-HCOs. Dieser Modulator wirkt, um den h-Strom (hyperpolarisationsaktivierter Innenstrom, I_h)zu erhöhen und die I-Pumpe³zu verringern. Diese Beobachtung führte zur Untersuchung, wie ich mit I_h _interagiere und wie ihre Co-Modulation zur rhythmischen Aktivität von HN-Neuronen beiträgt. Die Aktivierung der Pumpe durch Erhöhung von [Na⁺]_i (unter Verwendung des Ionophormonensins) beschleunigt den HN-Burst-Rhythmus sowohl in HN-HCOs als auch in isolierten HN-Neuronen⁴. Diese Beschleunigung war abhängig von I_h. Als I_h blockiert wurde (2 mM Cs⁺), wurde die Burst-Periode durch diese Methode der Pumpenaktivierung nicht verändert; Die Burstdauer (BD) wurde jedoch verkürzt und das Interburst-Intervall (IBI) nahm sowohl bei HN-HCOs als auch bei isolierten HN-Neuronen^{zu 4}.

Für dieses Protokoll werden alle Ströme eines lebenden HN(7)-Neurons, einschließlich des Pumpenstroms, _I-Pumpe,wie folgt in das HN-Modell integriert:

(1)

wobei C die Membrankapazität (in nF), V das Membranpotential (in V), t die Zeit (in s) ist. Detaillierte ionische Strombeschreibungen und Gleichungen wurden an anderer Stelle beschrieben²^,⁴. Das komplette HN-Modellneuron läuft in Echtzeit (Abbildung 2). Die Software wird nach der Veröffentlichung auf GitHub zur Verfügung gestellt und ist für die Ausführung auf der in der Materialtabelle beschriebenendigitalen Signalverarbeitungsplatine geeignet. Hier liegt der Schwerpunkt der Untersuchung auf dem Na⁺/ K⁺ Pumpenstrom (I_Pumpe) und den spannungsgesteuerten Strömen, die signifikante Na⁺ Fluss beitragen: ein schneller Na⁺ Strom (I_Na) und ein anhaltender Na⁺ Strom (I_P). Die maximalen Leitfanzen dieser Ströme sind jeweils. Die Na⁺/ K⁺ Pumpe tauscht drei intrazelluläre Na⁺ Ionen gegen zwei extrazelluläre K⁺ Ionen aus und erzeugt so einen Nettoauswärtsstrom. Wichtig ist, dass es 3-mal so viel Na⁺ aus dem Neuron pumpt, wie dieser Strom anzeigt, was für die Berechnung der intrazellulären Na⁺ -Konzentration wichtig ist.

Der Na⁺/K⁺ Pumpenstrom hängt von intrazellulären Na⁺ Konzentrationen ab und wird durch die folgende Sigmoidalfunktion ausgedrückt:

(2)

wobei [Na]_i die intrazelluläre Na⁺ -Konzentration ist, der maximale Na⁺/ K⁺ Pumpenstrom ist, [Na]_ih die intrazelluläre Na⁺ -Konzentration für die Halbaktivierung der Na⁺/ K⁺ -Pumpe und [Na] die Empfindlichkeit der Na⁺/ K⁺ -Pumpe gegenüber [Na]_i _ist. [Na]_i baut sich als Ergebnis der Na⁺ -Zuflüsse auf, die von I_P und I_Na getragen werden, und wird durch den Na⁺ Ausfluss der Na^{+ /}K⁺ Pumpe verringert. Der Beitrag von I_h und I_Leak zum gesamten Na⁺ Fluss ist gering und wird im Echtzeitmodell nicht berücksichtigt.

(3)

dabei ist v das Volumen (~6,7 pL) des intrazellulären Na +-Reservoirs, F ist die Faradays konstante und die extrazelluläre Na⁺ -Konzentration wird konstant gehalten.

Spannungsgesteuerte und Leckleitstände wurden unterschieden – diese reagieren auf Membranpotential – vom Pumpenstrom, der durch die berechnete intrazelluläre Na⁺ -Konzentration ([Na⁺]_i) reguliert wird. [Na⁺] _i wird durch Na⁺ Eintritt über den schnellen Na⁺ Strom (I_Na) aufgebaut, der Aktionspotentiale (Spikes) und den persistenten Na⁺ Strom (I_P) erzeugt, der die Depolarisation zur Unterstützung von Spiking bereitstellt. [Na⁺] _i wird wiederum durch die Wirkung der Pumpe durch die Extrusion von Na⁺reduziert. Es wurden lebende HN-Werte von (5nS) und (150 nS) angenommen, und wir berücksichtigen jede zusätzliche dynamische Klemme.

Das Ziel des hier beschriebenen Protokolls ist es, I_Pump präzise und reversibel in Echtzeit zu manipulieren, um herauszufinden, wie es mit spannungsgesteuerten Strömen (persistenter Na⁺ Strom im Stromprotokoll) interagiert, um rhythmisches Bursting in einzelnen HNs zu steuern. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde eine dynamische Klemme verwendet, die auf Befehl künstlich eine genaue Menge eines strombasierten Stroms einführt, der während des Modelllaufs berechnet werden kann. Diese Methode hat Vorteile gegenüber der pharmakologischen Manipulation der Pumpe, die das gesamte Gewebe betrifft, Off-Target-Effekte haben kann, die oft schwer rückgängig zu machen sind und nicht genau manipuliert werden können. Dynamische^{Klemme 5}^,⁶ liest die Spannung eines aufgezeichneten Neurons in Echtzeit ( Abbildung1B) und berechnet und injiziert in Echtzeit die Menge eines beliebigen Stroms basierend auf Modellgleichungen und den Sollwerten eines beliebigen oder . Ähnliche Methoden können leicht auf jedes Neuron angewendet werden, das intrazellulär aufgezeichnet werden kann. Die Parameter müssen jedoch auf das gewählte Neuron neu skaliert werden, und das Neuron sollte aus synaptischen Inputs isoliert werden, z. B. pharmakologisch.

Protocol

HINWEIS: Wirbellose Tierversuchspersonen werden nicht von den NIH oder Emory und Georgia State Universities reguliert. Dennoch wurden alle Maßnahmen ergriffen, um das Leiden der bei dieser Arbeit verwendeten Blutegel zu minimieren. 1. Bereiten Sie isoliertes Ganglion 7 aus dem Blutegelnervenstrang vor Pflegen Sie Blutegel Hirudo verbana in künstlichem Teichwasser (mit 0,05% w/ v Meersalz), verdünnt in deionisiertem Wasser bei 16 °C in einem 12:12 Hell-Dunkel-Zyklus. Bereiten Sie die Blutegel für die Dissektion vor, indem Sie sie in einem Bett aus zerstoßentem Eis für >10 Minuten kalt betäuben, bis sie unbeweglich sind. Füllen Sie eine schwarze, mit Harz ausgekleidete Sezierschale bis zu einer Tiefe von ~1 cm mit gekühlter Kochsalzlösung, die 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl2,10 mM D-Glucose und 10 mM HEPES in entionisiertem Wasser enthält; pH-Wert auf 7,4 mit 1 M NaOH eingestellt. Stecken Sie die Blutegelrückenseite nach oben in die schwarze harzgekleidete Kammer (mindestens 20 cm x 10 cm mit einer Tiefe von mindestens 2 cm über dem Harz, das mindestens 2 cm dick ist). Unter einem Steromicroscope bei 20-facher Vergrößerung mit schräger Lichtleiterbeleuchtung einen mindestens 3 cm langen Längsschnitt mit 5 mm Federschere durch die Körperwand im rostralen 1/3. Körperteil machen. Verwenden Sie Stifte, um die Körperwand zur Seite zu ziehen und die inneren Organe freizulegen.HINWEIS: Jede gelagerte Blutmahlzeit kann durch Absaugen mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette entfernt werden. Isolieren Sie ein einzelnes Mittelkörperganglion 7 (siebtes freies segmentales Ganglion kaudal zum Gehirn). Öffnen Sie den Sinus, in dem sich das Nervenstrang befindet, mit der 5 mm Federschere. Achten Sie darauf, den Sinus dorsal und ventral zu spalten, wobei zwei Sinusstreifen übrig bleiben. Verwenden Sie eine scharfe Zette Nr. 5, um den Schnitt zu führen und den Sinus zu halten. Halten Sie den Sinus an jeder der beiden bilateralen Nervenwurzeln befestigt, die aus dem Ganglion hervorgehen (es haftet fest an jeder Wurzel), um diese Sinusstreifen zum Auspinnen des Ganglions zu verwenden. Entfernen Sie das Ganglion aus dem Körper, indem Sie die rostralen und kaudalen Bindenervenbündel schneiden, die die Ganglien (so weit wie möglich vom7. Ganglion entfernt) und die Sinusstreifen verbinden, und schneiden Sie dann die Wurzeln seitlich zu dem Punkt, an dem sie aus dem Sinus hervorgehen. Stecken Sie das Ganglion (mit einer alten stumpfen #5-Pinzette) mit verkürzten Minuten-Insektenstiften, ventrale Seite nach oben, in klaren, mit Harz ausgekleideten Petrischalen. Setzen Sie Stifte in die Streifen von Sinus und losem Gewebe ein, die an den Wurzeln und den rostralen und kaudalen Verbindungen haften, so weit wie möglich vom Ganglion entfernt.HINWEIS: Das Harz darf nicht dicker als 3 mm sein, wenn während der Aufnahme eine gute Ausleuchtung von unten erreicht werden soll. Stellen Sie sicher, dass das Ganglion sowohl längs als auch seitlich straff ist Erhöhen Sie die Vergrößerung des Stereomikroskops auf das 40-fache oder mehr und stellen Sie die schräge Beleuchtung so ein, dass die neuronalen Zellkörper auf der ventralen Oberfläche des Ganglions direkt unter dem Perineurium leicht zu sehen sind. Entfernen Sie das Perineurium des Ganglions (Desheath) mit Mikroscheren. Beginnen Sie die Entmantelung, indem Sie die lose Scheide zwischen den Wurzeln auf einer Seite schneiden, und setzen Sie den Schnitt seitlich auf der anderen Seite fort, wobei Sie sicherstellen, dass die Scherenklingen oberflächlich bleiben und die neuronalen Zellkörper direkt unter der Hülle nicht schädigen. Machen Sie einen ähnlichen oberflächlichen Schnitt kaudal vom seitlichen Schnitt entlang der Mittellinie. Greifen Sie nun mit der feinen Ziffere #5 auf einer Seite die caudolaterale Hüllenklappe, ziehen Sie sie vom Ganglion weg und schneiden Sie sie mit der Mikroschere ab. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite; Dieses Verfahren setzt beide HN(7)-Neuronen für die Aufnahme mit Mikroelektroden frei. Legen Sie die Zubereitungsschale in das Aufnahmesetup und übertüben Sie es mit Kochsalzlösung bei einer Durchflussrate von 5 ml / min bei Raumtemperatur. 2. Identifizieren und erfassen Sie Blutegelherzinteruronen mit scharfen Mikroelektroden Für die Dauer der Aufzeichnung des HN(7)-Neurons (Aufzeichnungen dauern zwischen 30 und 60 min) erfassen und digitalisieren Sie die intrazellulären Strom- und Spannungsspuren von einem neurophysiologischen Elektrometerabtastung mit einer Rate von 5 kHz mit einem digitalen Datenerfassungssystem (Analog zu Digital, A zu D) und Stimulationssystem (Digital zu Analog, D zu A), und auf einem Computerbildschirm angezeigt.HINWEIS: Jede kommerzielle oder kundenspezifische Software und A bis D / D zu A-Karte können für die Datenerfassung (A bis D) verwendet werden. Für die dynamische Klemme sind D bis A und eine maßgeschneiderte Software erforderlich. Unter einem Steromikroskop bei 50-100x mit Dunkelfeldbeleuchtung von unten identifizieren Sie vorläufig ein HN(7)-Neuron des bilateralen Paares anhand seiner kanonischen Position an der posteriolateralen Position im Mittelkörperganglion sieben. Ziel ist es nun, das mutmaßliche HN(7)-Neuron mit einer scharfen Mikroelektrode, die mit 2 M Kaliumacetat und 20 mM KCl gefüllt ist, mit einem Mikromanipulator zu durchdringen. Platzieren Sie die Mikroelektrode ganz in der Nähe des Zielzellkörpers. Beobachten Sie kontinuierlich das aufgezeichnete Potential mit dem Elektrometer und stellen Sie dieses Potential auf null mV, bevor Sie in das Neuron eindringen. Durchdringen Sie das Neuron mit der Mikroelektrode, indem Sie die Elektrode langsam entlang ihrer langen Achse mit dem Manipulator antreiben. Mit der Elektrometer-Brummfunktion, die auf 100 ms Brummdauer eingestellt ist, bis eine negative Verschiebung des Membranpotentials und eine kräftige Spiking-Aktivität beobachtet werden. Stellen Sie das Elektrometer in den diskontinuierlichen Strom-Klemm-Modus (DCC) ≥ 3 kHz ein, um gleichzeitig das Membranpotential aufzuzeichnen und den Strom mit der einzelnen Mikroelektrode zu leiten (Kapazitätskompensation auf knapp unter dem Klingeln eingestellt und dann um 10% zurückgewählt). Überwachen Sie das Absetzen der Elektrode während des DCC auf einem Oszilloskop. Injizieren Sie einen konstanten Strom von -0,1 nA mit dem Elektrometer-Konstantstrominjektor für ein oder zwei Minuten, um die Aufnahme zu stabilisieren. Identifizieren Sie das HN(7)-Neuron definitiv anhand seiner charakteristischen Spikeform und schwachen Berstaktivität (Abbildung 1Ci). Führen Sie nach Abschluss des Experiments eine Beliebige Datenanalyse offline durch, und speichern Sie alle Daten auf einem Datenträger. 3. Erstellen Sie ein Echtzeit-HN oder ein anderes Modellneuron Erstellen Sie benutzerdefinierte Software mit einer digitalen Signalverarbeitungsplatine (DSB; D bis A und A bis D) in einem Tischcomputer, um in Echtzeit die in2,4 oder verschiedenen Modellströmen beschriebenen Modellströme für andere Neuronen oder Experimente zu implementieren. Verwenden Sie Gleichungen im Hodgkin-Huxley-Stil, da sie die allgemein bevorzugte Methode zur Darstellung von Modellströmen sind. Siehe7 für eine detaillierte Beschreibung der Implementierung des Echtzeit-HN-Modells und der dynamischen Klemme vor der Zugabe des Pumpenstroms. Im Einleitungsabschnitt finden Sie eine Beschreibung der Ströme, der intrazellulären Na+ -Konzentration und der Leitfedancen des lebenden HN(7)-Neurons im HN-Modell. 4. Implementieren und variieren Sie dynamische Klemmleitfleitungen / -ströme Verwenden Sie die speziell entwickelte dynamische Klemmsoftware für den DSB, um in Echtzeit eine der grafischen Benutzeroberflächen(Abbildung 3)(GUI) zugänglichen, programmierten Leitfänge und Ströme des HN-Echtzeitmodells des HN(7)-Neurons zu implementieren und zu ändern.HINWEIS: Zur Erinnerung, und sind die maximale Leitfähigkeit des persistenten Na+ Stroms (IP) bzw. des maximalen Pumpenstroms (IPumpe), jeweils. Verwenden Sie GUI-Eingabefelder in der Software, um Änderungen in der (PumpMaxL-Box) und (GpinHNLive-Box) vorzunehmen , während das Modell ausgeführt wird (Abbildung 3).HINWEIS: Die GUI-Eingabefelder akzeptieren typisierte Werte, und Schritte von 0,1 nA werden empfohlen, und Schritte von 1 nS werden für empfohlen. Fügen Sie kleine Mengen von und mit dynamischer Klemme hinzu, um das Platzen des HN(7)-Neurons zu stabilisieren, das durch ein mikroelektrodeninduziertes Leck geschwächt ist, wie in Abbildung 1Ciigezeigt.HINWEIS: Scharfes Eindringen von Mikroelektroden verursacht Membranschäden, die sich in erhöhter Leckleitfähigkeit oder vermindertem Eingangswiderstand ausdrücken. Beginnen Sie mit der Addition eines Wertes von 0,1-0,2 nA, der das mikroelektrodeninduzierte Leck ausglich, aber die Erregbarkeit unterdrückt, und erhöht sich dann allmählich, was die Erregbarkeit erhöht, bis ein regelmäßiges Bersten folgt, normalerweise bei ~ 1-4 nS (Abbildung 4A). Diese Ströme (Inkremente von 0,1 nA für und 1 nS für ) systematisch mit dem aufgezeichneten HN(7)-Neuron mit dynamischer Klemme(Abbildung 3)zu variieren und ihre Auswirkungen auf die Burst-Eigenschaften zu bewerten: Spike-Frequenz (f: der Kehrwert des Durchschnitts des Interspike-Intervalls während eines Bursts), Interburst-Intervall (IBI: die Zeit zwischen der letzten Spitze in einem Burst und der ersten Spitze im nächsten Burst), Burst-Dauer (BD: die Zeit zwischen der ersten Spitze in einem Burst und der letzten Spitze in einem Burst) und Burst-Periode (T: die Zeit zwischen der ersten Spitze in einem Burst und der ersten Spitze in der nachfolgenden Burst). Ändern Sie die Werte von und, wie in der Videodemonstration, um sich mit der Technik vertraut zu machen und sich dann hinauszuwagen. Halten Sie an einem bestimmten festen Wert und streichen Sie in 1 nS-Schritten über einen Bereich von unterstützenden regelmäßigen Bursting-Aktivitäten. Erhöhen Sie nun den festen Wert von um 0,1 nA und fegen Sie erneut über einen Bereich der unterstützenden regelmäßigen Bursting-Aktivität. Sammeln Sie für jedes implementierte Parameterpaar Daten mit mindestens 8 Bursts, damit zuverlässige Durchschnittsmessungen von f, IBI, BD und T durchgeführt werden können. Fahren Sie mit Sweeps fort, solange das Neuron lebensfähig bleibt, wie durch starkes Spiking und ein stabiles Baseline-Schwingungspotenzial beurteilt. Sammeln Sie Daten von mehreren Neuronen (von verschiedenen Tieren), um einen zusammengesetzten Graphen zu erzeugen (Abbildung 5).

Representative Results

Die Modellierung mit dem Zusatz IPump4 rückte die im Einleitungsteil vorgestellten experimentellen Ergebnisse in den Fokus und begann, den pumpengestützten Mechanismus des Berstens zu erklären. Das hier gezeigte Echtzeitmodell wurde so abgestimmt (und Parameter gewählt), dass es eine regelmäßige rhythmische Aktivität erzeugt, die innerhalb der Grenzen der normalen Aktivität liegt, wie sie in Experimenten beobachtet wurde – f, IBI, BD, T – und weiterhin eine solche Aktivität erzeugt, wenn die myomodulinmodulierten Parameter (der maximale Pumpenstrom) und (maximale Leitfähigkeit des h-Stroms) im Modell variiert oder co-variiert werden. Die ermittelten Parameterwerte können als Benchmark oder kanonischer Satz für Modellierungsexperimente verwendet werden. In diesen Modellinstanzen schwingt I während des gesamten Burst-Zyklus als [Na+]i um ein Basisniveau. IPump trägt zur Burst-Terminierung während der Burst-Phase bei, und die Hyperpolarisation, die sie erzeugt, aktiviert Ih während der IBI; Beachten Sie den maximalen Grad von Ih in der Nähe der Burst-Initiation (Abbildung 2). Obwohl das Echtzeit-HN-Modell alle implementiertenStröme 2,4 für das dynamische Spannen zur Verfügung hat, lag der Fokus hier auf und , die für Änderungen zur Verfügung stehen, während das Modell in der dynamischen Klemm-GUI läuft (Abbildung 3). Die dynamische Klemme ermöglicht es dem Experimentator, einen Leitfähigkeit oder Strom künstlich in ein Neuron zu addieren (oder mit einem negativen oder ) zu subtrahieren, das die Spannung und ionenabhängigkeit eines realen Leitfähigkeits oder Stroms nachahmt. So ist es möglich, vollständig zu untersuchen, wie ein bestimmter Leitwert / Strom mit den endogenen Leitfäden / Strömen in Zellen interagiert (Abbildung 1). Das Echtzeit-HN-Modell zeigt, dass der persistente Na+ Strom (IP) in HN-Neuronen einen Großteil des Na+ -Eintrags beiträgt, der [Na+]i stark beeinflusst (Abbildung 2) und somit pumpeich. Da IP bei relativ negativen Membranpotentialen aktiv ist, steht es dem Pumpenauch während des IBI entgegen. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass es aufschlussreich ist, Wechselwirkungen zwischen und in isolierten HN-Neuronen mit dynamischer Klemme zuuntersuchen,wie zuvor diskutiert8,9,10. Diese (laufenden) Experimente werden mit scharfen Mikroelektrodenaufnahmen in einzelnen, synaptisch isolierten HN(7)-Neuronen (siebtes Ganglion, das vom Nervenstrang getrennt ist) durchgeführt. Bis heute zeigen diese Experimente, dass robustes Bursting in tonisch aktiven HN-Neuronen (aufgrund von Mikroelektrodendurchdringung eingeführtes Leck) durch Co-Addition von IP und I-Pumpe mit dynamischer Klemme wiederhergestellt wird (Abbildung 4). Dies ist eine wichtige Beobachtung, die darauf hinweist, dass in diesen Neuronen ein Bursting-Mechanismus verfügbar ist (auch wenn das Leck kompromittiert ist), der sich aus der Wechselwirkung von I-Pumpe und I Pergibt. Vorläufige Ergebnisse deuten auf ihre starke komplizierte Wechselwirkung hin, die im Modell und in den Experimenten untersucht werden kann (Abbildung 5). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ich als Reaktion auf periodische Erhöhungen von [Na+]i während der Burstaktivität zum Burst-Rhythmus durch Burst-Terminierung (abnehmende BD) beitrage. Die Wechselwirkung von IP und I-Pumpe stellt einen Mechanismus dar, der ausreicht, um die endogene Berstaktivität zu unterstützen; Dieser Mechanismus kann ein robustes Bursting in HN-Interneuronen wiederherstellen, die intrazellulär in Ganglion 7 aufgezeichnet wurden. Die Wechselwirkung zwischen IP und Ipumpt durch [Na+]i die HN-Burst-Periode nicht monoton und gewährleistet die Robustheit des autonomen Burstens. Diese Schlussfolgerungen stehen im Einklang mit Experimenten und Modellierungen in Wirbeltiersystemen11,12. Abbildung 1: Blutegelherz interneuron elektrische Aktivität und Implementierung von I-Pumpe und IP mit dynamischer Klemme. (A) Normale Berstaktivität gleichzeitig aufgezeichnet, extrazellulär (oben) und intrazellulär (unten), in einem Blutegel-Herzschlag HCO von einem dritten Ganglion, ein Schema der aufgezeichneten Neuronen und ihrer gegenseitig hemmenden synaptischen Verbindungen rechts. (B) Dynamisches Klemmschema bei der Aufzeichnung eines HN(7)-Interneurons in einem isolierten Ganglion 7; Beachten Sie, dass es keine synaptische Wechselwirkung zwischen den beiden HN(7)-Interneuronen gibt. (Ci) Platzen in einem leckgefromittierten HN(7)-Interneuron. (Cii) Ein robusteres Bersten kann durch Hinzufügen einer dynamischen Klemme I-Pumpe (= 0,1 nA) erzeugt werden, die das mikroelektrodeninduzierte Leck ausgleichen, aber die Erregbarkeit beeinträchtigt, und (1 nS), was die Erregbarkeit erhöht. Schwarze gestrichelte Linien zeigen Basiswerte an. Abkürzungen: HN = Heart Interneuron; HCO = Halbmitteloszillator; IPumpe = Außenstrom; IP = persistent na+ strom; = maximal Na+/K+ Pumpenstrom; = maximale Leitfähigkeit des persistenten Na +-Stroms; Vm = Membranpotential; [Na+] i = interne Konzentration von Na+. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Einzel-HN-Interneuronmodell mit Spuren für Membranpotential (Vm), Ih, IPumpe, [Na+]iund IP. Nach außen hyperpolarisierende Ströme sind negativ und nach innen depolarisierende Ströme positiv. Schwarze gestrichelte Linien zeigen Basiswerte an. Abkürzungen: HN = Heart Interneuron; IPumpe = Außenstrom; IP = persistent na+ strom; = maximal Na+/K+ Pumpenstrom; Ih = hyperpolarisationsaktivierter Innenstrom; = maximale Leitfähigkeit des persistenten Na +-Stroms; = maximale Leitfähigkeit des hyperpolarisationsaktivierten Innenstroms; Vm = Membranpotential; [Na+] i = interne Konzentration von Na+. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Grafische Benutzeroberfläche des Echtzeit-Heart-Interneuron-Modells (HN) und der dynamischen Klemme, die auf einer digitalen Signalverarbeitungsplatine implementiert ist. Oben links: Rote Mathe-Boxen sind benutzerdestimmte Parameterboxen für das Echtzeitmodell, während Blue Live-Boxen benutzerbestimmte Parameterboxen sind, die in der dynamischen Klemme verwendet werden. El = das Umkehrpotential des Ableitstroms; Gl = Leckleitfähigkeit; Gh = maximale h-Strom-Leitfähigkeit; Gp = P Strom maximaler Leitfähigkeit; GCaS = langsamer Kalziumstrom maximaler Leitfähigkeit; PumpMax = maximaler Pumpenstrom; [GSyn2 maximale synaptische Leitfähigkeit zum jeweiligen Neuron; ThreshSyn2 Spike Crossing Threshold für die Vermittlung eines synaptischen Potentials – diese wurden verwendet, um einen hybriden (lebenden / Modell) Halbmitteloszillator herzustellen, der hier nicht dargestellt ist.]. Unten links für Dynamic Clamp. Ganz links sind 5 berechnete Werte dynamischer Klemmgrößen: Ipump = pump injected; Ih = h-Strom eingespritzt (hier nicht verwendet); IP = P-Strom eingespeist; NaI = berechnetes internes Na+ Konzentration; ENa = berechnetes Natriumumkehrpotential. Unten links für Dynamic Clamp. Rechts von den berechneten Variablen befinden sich 6 vom Benutzer festgelegte Parameterfelder: GNa = angenommene endogene schnelle Natriummaximierung zur Berechnung von Na+ Fluss im Zusammenhang mit Aktionspotentialen; PumpMaxL = maximaler Pumpenstrom, der durch dynamische Klemme eingespeist wird; Naih siehe Gleichung (2); Gh = maximale Leitfähigkeit zur Bestimmung des h-Stroms, der durch dynamische Klemme eingespritzt werden soll; Gp = angenommener endogener P-Strom maximale Leitfähigkeit zur Berechnung von Na+ Fluss assoziiert mit endogenem P-Strom; GpinHNLive = maximale Leitfähigkeit zur Bestimmung des P-Stroms, der durch dynamische Klemme eingespritzt werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Dynamische Klemmanalyse des unabhängigen HN(7)-Berstens. Eine Hochregulierung von (A) 4,0 nS auf (B) 9,0 nS verlangsamt den unabhängigen HN-Burst-Rhythmus. Experimentelle Spuren zeigen rhythmisches Bursting in isolierten HN(7)-Neuronen mit dynamischer Klemme. Die Oszillationsbereiche von [Na+]i und Vm nehmen mit hochregulierter Zunahme zu. Spuren von oben nach unten: aufgezeichnete Vm, injizierte I-Pumpe,berechnete [Na+]iund injizierte IP. Schwarze gestrichelte Linien zeigen Basiswerte an. Abkürzungen: HN = Heart Interneuron; IPumpe = Außenstrom; IP = persistent na+ strom; = maximal Na+/K+ Pumpenstrom; = maximale Leitfähigkeit des persistenten Na +-Stroms; Vm = Membranpotential; [Na+] i = interne Konzentration von Na+. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Dynamische Klemmanalyse des unabhängigen HN(7)-Berstens. Die Hochregulierung von neigt dazu, abzunehmen, gefolgt von einer erhöhten HN-Burst-Periode. In einzelnen Experimenten (Punkte, die durch Linien verbunden sind) mit dynamischer Klemme wurden die Werte gekehrt, während sie konstant gehalten wurden. Farben repräsentieren verschiedene konstante Ebenen der zugesetzten Zusätze, die in verschiedenen Experimenten verwendet werden. Abkürzungen: HN = Heart Interneuron; = maximal Na+/K+ Pumpenstrom; = maximale Leitfähigkeit des persistenten Na+ Stroms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Modellierung, dynamische Klemme und die daraus resultierenden Analysen sind nützliche Techniken, um zu untersuchen, wie einzelne und Gruppen von Ionenleitfähigkeit/-strömen zur elektrischen Aktivität von Neuronen beitragen (Abbildung 1, Abbildung 2,Abbildung 4und Abbildung 5). Die Verwendung dieser Techniken zeigt, wie der Na⁺/ K⁺ Pumpenstrom (_I-Pumpe) mit spannungsgesteuerten Strömen interagiert, insbesondere dem persistenten Na⁺ Strom (I_P), um ein robustes Platzen in den Kern-HNs des Blutegel-Herzschlagmustergenerators zu fördern. Durch die Kombination von dynamischen Klemmexperimenten und Modellierung ist es möglich, Modelle direkter zu testen, als es mit gewöhnlichen Spannungsaufzeichnungs- und Stromzangetechniken möglich ist. Die Ergebnisse der dynamischen Klemmexperimente (Abbildung 5) werden zur weiteren Verfeinerung des HN-Modells verwendet. Die hier demonstrierte grundlegende Methode der dynamischen Klemmung kann angepasst werden, um die Eigenschaften jedes untersuchten Neurons widerzuspiegeln, wenn ein mathematisches Modell neuronaler Ströme mit Spannungsklemmexperimenten bestimmt werden kann.

Der erfolgreiche Abschluss der Experimente der hier gezeigten Art erfordert eine sorgfältige Aufspießung eines HN oder eines anderen Neurons bei Verwendung einer scharfen Mikroelektrode, da starkes Platzen durch Elektrodenpenetration¹eingedämmt wird. (Ganzzell-Patch-Aufzeichnungstechniken, die eingeführte Lecks minimieren, sind auch auf andere Neuronen anwendbar, funktionieren aber nicht gut auf Blutegelneuronen.) Es ist wichtig, dass die Aufspießung des HN-Neurons minimale Schäden am Neuron verursacht (zusätzliches Leck), und der Eingangswiderstand sollte überwacht werden und muss im Bereich von 60-100 MOhms für erfolgreiche Experimente^{liegen 4}.

Dynamische Klemme ist eine mächtige Technik, aber sie hat Einschränkungen durch neuronale Geometrie, da die künstlichen Leitfäden an der Stelle der Aufzeichnungselektrode – normalerweise dem Zellkörper – implementiert werden, nicht an der Stelle, an der rhythmuserzeugende^Strömenormalerweise lokalisiert sind 5^,⁶^,¹⁰. In Blutegel-HN-Neuronen befindet sich der Zellkörper elektrisch nahe an der Integrationszone (Hauptneurit) des Neurons, wo die meisten aktiven Ströme lokalisiert und Spikes initiiert werden.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Christian Erxleben für vorläufige dynamische Klemmexperimente an HN(7)-Neuronen, die ihre Berstfähigkeiten demonstrierten. Angela Wenning unterstützte die Experimente mit fachkundiger Beratung. Wir danken dem NIH für die Finanzierung dieser Arbeit durch Grant 1 R21 NS111355 an GSC und RLC.

Materials

ANIMALS
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		live leeches 2-3 grams
CHEMICALS
ARTIFICIAL POND WATER
CaCl₂	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM add last after adjusting pH
glucose	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sea salt )	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v) diluted in deionized water
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N Solution	Sigma Aldrich	2105-50ML	Adjust to pH 7.4 with NaOH
MICROELECTRODES
K Acetate	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
SALINE
EQUIPMENT
#5 Forceps	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	For general leech dissection
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Black resin	Dow Sylguard	170	Lines general dissect dish
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter	A-M Systems	615000	For fabricating sharp microelectrodes
Clear resin	Dow Sylguard	184	Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy
Dark field condenser	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	For illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Digital signal processing board	dSpace	CLP1104	Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	For fabricating sharp microelectrodes
Fiber-Lite high intensity illuminator	Dolan Jenner Industries	170D	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Headstage amplifier for AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Gain:0.1LU	Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Light guide	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes
Micromanipulator controller	Sutter Instruments	MPC-200	Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes
Minuten pins	BioQuip	0.15 mm diameter 1208SA	Should be shortened by curtting to ~5 mm
Optical Breadboard 3' x 5' x 8"	Newport	Obsolete	With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Oscilloscope	HAMEG Instruments	HM303-6	To monitor electrode setteling during DCC
Pascheff-Wolff spring scissors	Moria		Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92
pClamp 9 Software	Axon Instruments	9	Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Pneumatic Isolators 28"	Newport	Obsolete	With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Simulink / MATLAB software	MathWorks	2006 (Obsolete)	Implements dynamic clamp on the digital signal processing board
Stereomicroscope	Wild	M5A	10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia
Steromicroscope	Wild	M5	20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	For general leech dissection

Referências

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Erazo-Toscano, R. J., Ellingson, P. J., Calabrese, R. L., Cymbalyuk, G. S. Contribution of the Na⁺/K⁺ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses. J. Vis. Exp. (171), e61473, doi:10.3791/61473 (2021).