トランスクリプトームプロファイリングのためのセザリー症候群患者からのヒト末梢血単核球およびCD4+ T細胞の単離

ヒト細胞は潜在的に感染性である。したがって、実験は、労働安全衛生管理(OSHA)および個人用保護具(PPE)として議論されている必要な予防措置および手順に従って厳密に実施される。 1. 全血からのPBMCの単離 表1から必要なすべての材料を集め、室温(RT)にします。RP10Fを37°Cに温めます。 遠心分離機をRTに調整します。遠心分離と細胞計数を除き、生物学的安全キャビネット内の生細胞を使用してすべての手順を実行します。 抗凝固剤を含む5本の10mLチューブ(所望の量)で血液を得る。全血を周囲温度(18°C)で保存する。50mL分離チューブに、処理する血液サンプルのヒト研究対象番号をラベル付けする。 10〜101215mLの血液を、一致する被験者番号で各分離チューブに移す。血液をハンクのバランス塩溶液(HBSS)で少なくとも2倍に希釈します。チューブあたり35mLの希釈血液を超えないでください。 血液を約13mLの密度培地で注意深くゆっくりと下敷きにします。チューブの底にある透明な密度媒体を通し、ピペットがほとんど空になったらピペッティングを停止します(気泡放出を防ぐため)。ピペットを慎重に取り外して、血液と密度媒体層が混ざらないようにします。 充填された分離チューブを、層を乱すことなく遠心分離機に慎重に移します。 遠心分離機ブレーキをオフにして500 x g で30分間遠心分離します(減速をゼロに設定します)。メモ: 遠心分離機に rpm しか表示されない場合は、ローターの仕様を参照して、500 x g の rpm 相当額を見積もり ます。 層を乱すことなく遠心分離機から分離チューブを慎重に取り外します。密度媒体層とプラズマ層の間に形成されたバフィーコートを観察します。 上部からピペットを除去し、上部血漿画分の大部分を廃棄し、10mLがバフィーコートの上に残るようにする。慎重にゆっくりとバフィーコートを集めます。バフィーコートを2つの分離チューブから、 図1に示すように、新しい予め標識された滅菌50mLチューブに移します。 PBMCをHBSSで少なくとも2倍に希釈し、新しいチューブの容量を最大50mLにします。遠心分離機ブレーキをフルに切り替えてください。ペレットPBMCsを400 x g で10分間遠心分離した。上澄み液をできるだけ取り除き、チューブの底をタップしてペレットを緩めます。 残留赤血球(RBC)を溶解するために、各細胞ペレットを元の血液量10mLあたり1〜1〜122mLの塩化アンモニウム – カリウム(ACK)溶解緩衝液に再懸濁する。正確に5分間インキュベートする。同容量以上のHBSSによる溶解を速やかに停止し、容量を50mLに調整する。400 x g で10分間遠心分離する。 上清を取り出し、チューブの底をタップして細胞ペレットを緩めます。同じドナーからのプール細胞。HBSSで最大50mLのボリュームを持参してください。400 x g で10分間遠心分離する。 上清を取り出し、チューブの底をタップして細胞ペレットを緩めます。細胞を10mLの温かいRP10F培地に再懸濁し、トリパンブルーを用いて生細胞計数のためにアリコートをとる。 血球計数器を用いて各試料中の総細胞数を計算する。 2. PBMCからのCD4+CD45RO+ T細胞の精製 注:PBMCsからのCD4+CD45RO+ T細胞の精製は、市販の磁気分離( 材料表を参照)を使用して、若干の修正を加えて行われる。各市販キットには独自の指示書があるため、インキュベーション時間についてはキットのマニュアルに従うことをお勧めします。 所望の量のPBMCを10mLの選択緩衝液で洗浄する。400 x g で10分間遠心分離する。上澄み液を取り出し、チューブの底をタップしてペレットを緩めます。 PBMCを選択バッファーで5 x107 細胞/mLに希釈し、5 mLのポリスチレン丸底チューブ(12 x 75 mm)に移します。 サンプル1 mLあたり50 μLの抗体カクテルを加え、穏やかに混合する。室温で5分間インキュベートする。 使用直前に、磁性粒子を高速で30秒間渦巻きます。PBMCsを含むチューブにサンプル1mLあたり50μLの磁性粒子を加え、穏やかに混合する。 選択バッファーで2.5 mLまでの容量を持ち込み、優しく混ぜます。チューブ(蓋なし)を磁石に入れ、RTで2.5分間インキュベートします。 磁石を拾い上げ、連続的な動きで、磁石とチューブを反転させて、濃縮細胞懸濁液を新しい滅菌チューブに注ぐ。 回収率を上げるには、固定化ビーズを乱すことなく、磁石に残っているチューブに2.5 mLの選択バッファーを追加します。磁石の中にさらに2.5分間保持し、ステップ2.6を繰り返して追加の細胞を回収する。 トリパンブルーを使用して生細胞計数のためのアリコートを取ります.血球計数器または細胞カウンターを使用して総細胞数を計算する。 フローサイトメトリーにより純度を確認する(図3)。 3. 化学活性化 温かいRP10F培地でCD4+CD45RO+ T細胞を5 x106 細胞/mLに調整し、所望のサイズの培養皿に細胞を分配する。加湿した37°C5%CO2 インキュベーター内で細胞を一晩休ませた。 ペレットは、400 x g で10分間遠心分離することによって細胞を休ませた。上清を取り出し、チューブの底をタップして細胞ペレットを緩めます。 温かいRP10F培地で細胞濃度を5 x106 細胞/mLに調整し、0.5〜107 細胞を3つの滅菌スクリューキャップチューブのそれぞれに分配する。注:十分な細胞が利用可能な場合、重複した刺激または追加の時点が実験計画に含まれる可能性がある。 チューブ2および3内の細胞をPMAおよびA23187で刺激する。PMAを25 ng/mL、A23187を500 ng/mLに添加し、穏やかに混ぜる。等量のジメチルスルホキシド(DMSO)を、ビヒクルとして機能するチューブ1内の細胞に加える(対照)。たとえば、1 μL の PMA と 1 μL の A23187 を使用する場合は、2 μL の DMSO をビヒクルチューブに追加します。DMSOの最終濃度をすべてのチューブで0.5%未満に保ちます。 チューブ上のキャップを緩め、細胞を37°Cの5%CO2 インキュベーターに2時間(チューブ2)および6時間(チューブ1および3)戻した。示された時間に、細胞を500 x g で10分間遠心分離する。 溶解前に、細胞ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの上清を捨てる。 市販のRNA単離キットからの指示に従い、速やかに細胞を溶解する( 材料表を参照のこと)。RNA単離を進めるか、溶解液を-80°Cで凍結して、後で追加のサンプルで処理します。注:RNAの純度および完全性は、マイクロキャピラリー電気泳動を用いて検証することができる。 オプション: 精製された RNA サンプルからすべての微量の DNA を完全に除去するには、製造元の指示に従って、RNA クリーンアップキット ( 材料表を参照) を使用します。