JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Графеновый корпус химически фиксированных клеток млекопитающих для жидкой фазовой электронной микроскопии

Published: September 21, 2020
doi:
10.3791/61458
, ,
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics,Saarland University

Summary

Здесь представлен протокол для маркировки мембранных белков в клетках млекопитающих и покрытия образца графеном для жидкой фазы сканирования электронной микроскопии передачи. Стабильность образцов против ущерба, причиненного радиацией, также может быть изучена с помощью этого протокола.

Abstract

Протокол описан для исследования человеческого эпидермального фактора роста рецептора 2 (HER2) в нетронутой плазменной мембране раковых клеток молочной железы с помощью сканирующей электронной микроскопии передачи (STEM). Клетки линии раковых клеток молочной железы млекопитающих SKBR3 были выращены на кремниевых микрочипах с кремниевым нитридом (SiN) окнами. Клетки были химически зафиксированы, и белки HER2 были помечены наночастицами квантовой точки ( qDs), используя двухступный биотин-стрептавидин связывающий протокол. Клетки были покрыты многослойным графеном для поддержания гидратированного состояния, а также для защиты их от повреждения электронным лучом во время STEM. Для изучения устойчивости образцов при облучению электронным лучом был проведен эксперимент серии доз. Сравнивались образцы с графеновой покрытием и без покрытия. Индуцированные лучами повреждения, в виде ярких артефактов, появились для некоторых неохвитных образцов при повышенной дозе электрона D,в то время как никаких артефактов на образцах с покрытием не появилось.

Introduction

Анализ функции мембранного белка имеет важное значение для биологических исследований клеток, а также для разработки лекарственных препаратов. Класс важных экспериментов включает в себя изучение положения мембранного белка в клетках. Эта информация может быть использована для вывода выводов о сборке белков в белковых комплексах и их специфических местах в плазменной мембране, которая с помощью динамической сборки и разборки управляет широким спектром клеточных функций. Среди других методов, световая микроскопия (LM) и электронная микроскопия (EM) используются для изучения белковых функций в клетках. LM позволяет анализ целых клеток в жидкости; однако, разрешение ограничено 200-300 нм для обычных и до 20 нм для супер резолюции флуоресцентной микроскопии припрактических условиях 1,,2. EM обеспечивает около 1 разрешение 3 , нообычныйпрепарат образца требует обезвоживания, окрашивания металла для повышения контрастности изображения, и встраивания в монтажное вещество, такое как смола, для передачи электронной микроскопии (TEM)4. Для сохранения биологических образцов в более родной среде, крио-EM методы могут бытьиспользованы 5,6. Образцы быстро замораживаются в аморфный лед, и, при необходимости, секционо. Другим вариантом является замораживание ГРП EM7.

EM методы для изучения мембранных белков в нетронутых клетках в их родном, жидкомсостоянии появились в последнее десятилетие 8,9,10,11. Пространственное разрешение в 2 нм было достигнуто на квантовой точке (КД) помечены мембранных белков в целых клетках, выращенных на мембране SiN и прилагается слоемграфена 9.

Здесь описаны детали протокола для маркировки белка и графеновогопокрытия 9,12. Целью этого протокола является анализ пространственного распределения HER2 в мембране целых, фиксированных клеток, сохраняя при этом клетки в гидратированном состоянии. Покрытие графеном предотвращает высыхание клеток в вакууме, а также уменьшает радиационное повреждение13. Этот метод предоставляет информацию о помеченных мембранных белках в нетронутой плазменной мембране, но метод не полезен для изучения клеточной ультраструктуры, как это обычно делается с EM.

Графен является самым тонким наноматериалом из известных, и состоит из одного атома углерода толстый кристаллический лист расположен в сотовойрешетке 14. Он имеет уникальные свойства, включая высокую гибкость и механическую прочность. Недавние исследования показали, что без дефектов графен непроницаем для газов и жидкостей, но дефекты позволяют пронизыванияводорода 15. Эта утечка может быть уменьшена с помощью многослойного графена, используемого здесь. Bilayer графен недавно показал, чтобы быть полезным в качестве поддержки для крио-EM образцов, улучшение однородности тонкого слоя льда по сравнению с оксидом графена, где только неуниформные слои могут бытьсформированы 16. Графен также было показано, уменьшить повреждение пучка биологических образцов во время жидкостной фазы передачи электронноймикроскопии 13,17. В качестве образцового эксперимента, HER2 выражается в млекопитающем рака молочной железы клеточной линии SKBR3 был помеченс QDs 18 и его пространственное распределение записано с помощью STEM. Клетки были посеяны на микрочипе Si с прозрачной электронной мембраной SiN19. Микрочипы были выбраны в качестве поддержки, поскольку они являются надежными, совместимыми с LM и EM, и вся процедура маркировки может быть выполнена непосредственно намикрочипе 19. После вложения ячейки HER2 был помечен двухстуговой маркировкой протокола20. Во-первых, биотинилированные анти-HER2 антитела миметическоесоединение 21 был прикреплен к HER2. Клетки были затем химически фиксированной для предотвращения этикетки индуцированных рецепторов кластеризации, а также для повышения стабильности клеточной ультраструктуры. Streptavidin покрытием ЗД были впоследствии связаны с HER2-антитела миметического комплекса. Яркий флуоресцентный сигнал и электрон-плотное ядро ДД позволили коррелировать флуоресценцию- и электронную микроскопию (CLEM)20. CLEM особенно полезен, потому что клеточные области, представляющие интерес для анализа STEM, могут быть выбраны из обзорных изображений микроскопии флуоресценции, подчеркивающих локализацию HER2 на клетках. Клетки были проанализированы с помощью микроскопии флуоресценции для выявления клеточных регионов с высоким уровнем HER2. После этого лист графена толщиной 3-5 слоя был перенесен на клетки дляпокрытия 9,,22. Впоследствии образец был установлен в держателе образца EM. Данные STEM были получены с помощью детектора кольцевого темного поля (ADF), предоставляя информацию о пространственном распределении HER2 по поверхности клетки относительно расположения поверхности клетки, но не давая никакой информации об ультраструктуре клетки. Для определения устойчивости образца при облучению электронным лучом образцы были исследованы при увеличениидозы (D)в серии изображений. Исследована разница между образцами с графеном и без покрытия. Было оценено несколько видов радиационного ущерба.

Протокол, описанный здесь использует HER2 переэкспрессии млекопитающих рака молочной железы линии SKBR3 в качестве модели системы для ориентации HER223. Протокол включает в себя подготовку одного образца с графеном и одного аналогичного образца, но без графенового покрытия для сравнения. Эксперимент подготовлен в дубликате, так как окно SiN может раз в разы разбиться, и получить экспериментальный дубликат в большинстве случаев. Общая урожайность метода высока, что означает, что микрочипы с клетками, покрытыми графеном, обычно получаются с исключительной ошибкой, даже если не все окно SiN может быть покрыто графеном во всех случаях. Дубликаты не описаны в протоколе.

Протокол маркировки (шаги 1-5) сопоставим с протоколом маркировки рецептора эпидермального фактора роста в фибробластных клетках COS7, опубликованныхранее 24; детали в этой бумаге упоминаются в отношении обработки микрочипов и использования пластин хорошо. Следующий протокол оптимизирован для маркировки HER2, графеновогопокрытия 9и изучения радиационной толерантности образца.

Protocol

1. Очистка микрочипов и покрытий поли-L-лизином (PLL) и фибронектин-как белок (FLP) Поместите два микрочипа с мембраной SiN (2,0 х 2,6 мм) в 50 мл ацетона. Тщательно обрабатывайте микрочипы с плоской стороной вверх. Избегайте разрушения краев с помощью пинцета с плоским клювом. Избегайте касания верхней поверхности микрочипов при обработке пинцетом, чтобы предотвратить поломку окна SiN.ПРИМЕЧАНИЕ: Можно также использовать полиэтилен покрытием или кончиком углерода пинцет, чтобы предотвратить повреждение микрочипов. Вымойте чипсы в течение 2 минут, тщательно встряхивая стакан, наблюдая микрочипы не перевернуться. Перенесите микрочипы на 50 мл этанола и промойте в течение 2 минут, тщательно встряхивая стакан. Убедитесь, что передача быстро, так что избыток ацетона не высыхает дюйма Вымойте микрочипы с 50 мл воды в течение 10 мин. Опустите микрочипы в свежеприготовленный стакан из 20 мл этанола. Поместите микрочипы на чистую ткань для сушки. Плазма очищает микрочипы с 11,5 скм O2 и 35 скм Ar на 70 мТорр и радиочастоты (РФ) -цель 50 Вт в течение 5 мин. Поместите микрочипы в капот ламинарного потока для стерильной работы клеток. Подготовь решение 0,01% PLL в воде. Подготовь решение 15 мкг/мл FLP в фосфатно-буферной солевой растворе (PBS). Подготовь 24 скважины под капотом ламинарного потока и заполните 5 колодцев индивидуально 1 мл растворов в следующем порядке: ну 1 – PLL; хорошо 2 – вода; хорошо 3 – вода; а также 4 – FLP; а 5 – PBS и хорошо 6 – PBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение мытья шаги, окунув микрочип в указанные 24 или 96 хорошо в течение нескольких секунд с помощью пинцета. Выполните инкубационые шаги, инкубируя микрочипы в 24 или 96 хорошо в указанном растворе для указанного времени и температуры. Перенесите микрочипы в другой колодец в течение нескольких секунд. Инкубировать микрочипы в решении PLL в течение 5 минут. Затем мыть микрочипы в воде в два раза. Инкубировать микрочипы в FLP в течение 5 мин. Затем мыть микрочипы в PBS в два раза. Передача обоих микрочипов в скважины (по одному на каждый микрочип) новой пластины 96 скважин, предварительно заполненной 50 МКЛ без сыворотки среды для посева клеток. Инкубировать микрочипы при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 до тех пор, пока подвеска клетки не будет подготовлена. 2. Посевные клетки на мембранных микрочипах SiN Настройка всех принадлежностей и оборудования в ламинарный капот потока для обеспечения стерильной работы. Вымойте линию раковых клеток молочной железы, SKBR3, в колбе культуры клеток со средой роста один раз. Используйте модифицированную среду орла Дулбекко (DMEM), содержащую 10% сыворотки теленка плода (FCS), и 1% несущественных аминокислот (NEAAs) в качестве среды роста. Инкубировать клетки с 1 мл клеточного раствора отряда, пока клетки отсоединились от колбы. Добавьте 5 мл среды роста к отдельным клеткам в колбе. Перенесите эту подвеску в центрифугу. Пипетка 20 МКЛ клеточной подвески в гемоцитометр для получения концентрации клеток. Используйте следующую формулу.. Подготовь разрозненную подвесную ячейку 2,5 х10 5 ячеек/мл. Рассчитайте необходимое количество подготовленной подвески ячейки по:и заполнить с ростом от среднего до желаемого объема. Добавьте 100 МКЛ клеточной суспензии к двум скважинам пластины из 96 скважин, содержащей микрочипы с покрытием PLL и FLP с мембраной SiN лицом вверх и 50 мкл среды, свободной от сыворотки, так что каждая скважина содержит 25 000 клеток. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в течение 5 минут ждать клетки, чтобы прикрепить к микрочипу.ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, клетки могут отделиться от микрочипа, потому что они еще не придерживались. Проверьте плотность клеток на микрочипе с помощью перевернутого микроскопа. Убедитесь, что ячейки покрывают окно достаточным пространством для выравнивания и прилипения (см. рисунок 1A).ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные ячейки могут быть добавлены на данный момент, если это необходимо. Перенесите микрочипы в новые скважины, содержащие 200 МКЛ среды роста и инкубировать при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в одночасье. Во второй половине следующего дня перенесите оба микрочипа в безотхо сыворотку (среда голодания сыворотки), если клетки выровняются и прилипли к визуально проверенной слиянию (т.е. к фракции оконной зоны, покрытой клетками) около 2/3 (см. рисунок 1B). Изменение в сыворотке свободной среде по мере необходимости, чтобы привести клетки в определенном исходном состоянии по мере необходимости для сравнения между различнымиэкспериментами 25. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в одночасье.ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что количество клеток может отличаться в зависимости от темпов роста и морфологии клеток для других клеточных линий. 3. Маркировка и фиксация HER2 Подготовь решения, описанные в дополнительной таблице 1. Работа под капотом ламинарного потока для обеспечения стерильной работы. Используйте 96 хорошо пластины называют маркировки пластины I, и заполнить 6 скважин на микрочип с 200 йл маркировки пластины I решения: PBS / BSA, PBS / BSA / GS, антитела миметических, PBS / BSA, PBS / BSA, PBS / BSA. Используйте одну строку (одна буква на строку, например, A1 до A6) пластины хорошо на микрочип. Разогреть маркировку пластины до 37 градусов по Цельсию. Под капотом дыма, подготовить 24 хорошо пластины называют фиксации пластины, и заполнить 8 скважин на микрочип с 500 йл решений фиксации пластины: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS / глицин, PBS / BSA.ВНИМАНИЕ: CB является остро токсичным при вдыхании или пероральном приеме пищи и опасен для воды. Работа под капотом дыма с соответствующей защитой и распоряжаться CB в соответствии с листом данных безопасности (SDS). FA является коррозионным и вредным для кожи и здоровья. Работа под капотом дыма и обратитесь к SDS для получения информации об обработке и утилизации. Подготовь пластину из 96 скважин, именуемую маркировкой пластины II, и заполните 4 скважины на микрочип 200 злами маркировки пластин II растворов: ДД, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, 24 хорошо пластины используется, чтобы лучше видеть микрочипы в колодцах. Чтобы использовать меньше миметических антител (шаг 3.2) и QDs (шаг 3.4), используйте 96 пластин хорошо для этих шагов. Этикетка HER2 в клетках. Как только эти пластины будут готовы, начните маркировку, поместив микрочипы в колодцы первого ряда маркировки пластины 1. Вымойте микрочипы с PBS / BSA в 96 хорошо пластины отмечены как маркировка пластины I. Блокируйте неспецифические участки, чтобы предотвратить неспецифическое связывание миметического антитела путем инкубации с PBS/BSA/GS в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Инкубировать с 200 nM антителами миметических в течение 10 мин при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Вымойте микрочип три раза в PBS/BSA. Исправьте клетки. Перенесите микрочипы на 24 хорошо фиксационые пластины в дым капот.ПРИМЕЧАНИЕ: Отсюда не требуется стерильная работа. Вымойте один раз с CB в течение нескольких секунд. Исправить клетки с 3% FA в течение 10 мин. Вымойте один раз с CB и три раза с PBS. Блок свободных альдегидных групп FA путем инкубации с PBS-глицин в течение 2 мин. Вымойте микрочипы с PBS-BSA один раз. Прикрепите КД. Перемести микрочипы на 96 хорошо маркированную пластину II. Инкубировать с 20 нМ ЗД в течение 12 мин. Вымойте микрочипы с PBS / BSA в два раза. Храните микрочипы в колодец, содержащий PBS/BSA. 4. Световая микроскопия фиксированных клеток Приготовьте стеклянное дно диаметром 3,5 см с 2 мл раствора PBS/BSA. Возьмите первые микрочипы, поместите его вверх дном (клетки лицом вниз) в стеклянное дно блюдо и поместите блюдо в флуоресценции микроскопа. Медленно опустите микрочип в жидкость, чтобы предотвратить повреждение клеток. Приобретайте дифференциальные интерференционные контрасты (DIC) и флуоресцентные изображения каждого микрочипа с целью 40x и соответствующим каналом флуоресценции.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, возбуждение длины волны 540-580 нм и излучающей длины волны 607-683 нм используется для обнаружения йD655. Повторите процедуру для второго микрочипа. 5. Постфиксация Выполните все шаги под капотом дыма. Заполните 6 скважин на микрочип пластины из 96 скважин с 200 йл постфиксаторных решений:ЦБ, ГА, ЦБ, PBS, PBS, PBS.ВНИМАНИЕ: ГА опасна для воды, вредна для кожи, дыхательной системы и глаз. Работа под капотом дыма и обратитесь к SDS для получения информации об обработке и утилизации. Поместите оба микрочипа в соответствующие скважины с клетками вверх. Вымойте один раз с CB. Исправить клетки с 2% ГА в течение 10 мин. Вымойте один раз с CB. Вымойте три раза с PBS / BSA.ПРИМЕЧАНИЕ: Первый шаг фиксации с FA уже фиксирует биологическую структуру, но снижение уровня диффузии мембранного белка все еще может произойти, возможно, приводит к этикетке индуцированной кластеризации из-за наличия нескольких стрептавидинов на йД. Держите время экспериментальных шагов от фиксации FA до ГА, поэтому, как можно короче, чтобы свести к минимуму диффузию белков в мембране. Хранить в PBS/BSA, чтобы предотвратить осмотические шоки и 0,02% азида натрия (NaN 3 ), чтобыпредотвратитьрост бактерий при 4 градусов по Цельсию до графенового покрытия в новой пластине. Печать хорошо пластины с парафиновой пленкой, чтобы предотвратить высыхание. Микрочипы и клетки стабильны до 2 недель при хране при 4 градусах Цельсия.ВНИМАНИЕ: NaN3 опасен для воды и остро токсичен при приеме внутрь, для кожи и дыхательной системы. Работа под капотом дыма и обратитесь к SDS для получения информации об обработке и утилизации. 6. Очистка и передача графена на кристаллы соли Удалить поли (метилмхакрилат) (PMMA)-графен из PMMA-графена-на-полимере(рисунок 2A). Pipette несколько капель воды на полимер вокруг PMMA-графена.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что PMMA-графен легко исходит от поддерживающего полимера, как он плавает на поверхности воды. Погрузите PMMA-графен-на-полимер в воду с углом 30-45 “, чтобы освободить PMMA-графена.ПРИМЕЧАНИЕ: Полимер должен быть только слегка смочено. Трубопровод слишком много воды на полимер поднимет вверх и, возможно, сложить PMMA-графен. Etch медных загрязняющих веществ с использованием персульфатного раствора натрия(рисунок 2B).ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческий графен, выращенный на медной фольге, часто содержит субмимеметровые остатки меди, которые могут быть удалены с помощью медного травленияраствора 22. Приготовьте 50 мл раствора 0,42 М натрия persulfate в воде. Передача PMMA-графена в раствор персульфата натрия с графеной стороной вниз с помощью стандартной стеклянной горки. PMMA-графен будет плавать поверх раствора. Оставьте PMMA-графен в растворе персульфата натрия на ночь. Удалите PMMA-графен из раствора персульфата натрия и поместите его на чистую воду с помощью стеклянной горки. Пусть он плавает на воде в течение получаса. Повторите предыдущий шаг в общей сложности три раза, чтобы удалить все остатки натрия persulfate из PMMA-графена. Перенесите PMMA-графен на кристалл хлорида натрия (NaCl). Приготовьте насыщенный раствор NaCl в воде в чашке Петри. Перенесите PMMA-графен поверх раствора NaCl с помощью графена вниз с помощью стеклянной горки. Держите кристалл NaCl с пинцетом и возьмите плавающий PMMA-графен.ПРИМЕЧАНИЕ: Размер кристалла NaCl должен быть немного больше, чем размер PMMA-графена, чтобы избежать складывания выступающего графена на краю соли или контакта графена с пинцетом. В этих экспериментах кристалл NaCl 12 мм х 12 мм х 0,5 мм используется для подбирания 10 мм х 10 мм графена листа и его поддержки впоследствии. Держите PMMA-графен-на-соли вертикально в течение 2 минут, чтобы избыток воды вытекать. Пусть PMMA-графен-на-соли сухой при комнатной температуре в течение 30 минут и выпекать его в духовке при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 20 минут, чтобы полностью удалить воду. Удалить PMMA с помощью ацетона мыть (Рисунок 2C). Разогреть ацетон в стеклянной чашке Петри до 50 градусов по Цельсию на плите в дымовой капот. Внимательно следите за температурой, чтобы избежать пожара. Погрузите PMMA-графен-на-соли в чашку Петри заполнены ацетоном и оставить его для растворения PMMA в течение 30 минут. Повторите предыдущий шаг в общей сложности три раза с новым, чистым ацетоном. Пусть графен-на-соли воздух сухой тщательно, прежде чем использовать его для подготовки образца. 7. Графеновое покрытие ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура графенового покрытия схематично показана на рисунке 3A. Вымойте один микрочип, приготовленный с фиксированными клетками и помеченный HER2 в чистой воде, чтобы удалить любые остатки соли из буфера. Поместите микрочип на фильтровальную бумагу. Клетки видны как темные пятна(рисунок 3B). Вырежьте многослойный графен на кристалле NaCl на кусок, который подходит к окну SiN микрочипа с помощью лезвия бритвы. Подготовь стакан чистой воды и удалите графен из кристалла NaCl, наклонив кристалл примерно на 45 градусов по отношению к поверхности воды и касаясь воды. Графен будет плавать на поверхности воды(рисунок 3C). Поймать графен с металлической петли с поверхности воды. Графен будет плавать в капле ниже петли(рисунок 3D). Прикоснитесь к верхней поверхности микрочипа с нижней поверхностью петли. Микрочип будет прилипать к металлической петле. Графен можно увидеть поверх микрочипа(рисунок 3E). Под стереомикроскопом используйте фильтровальную бумагу для удаления оставшейся воды из микрочипа, чтобы графен покрывал все клетки на окне SiN.ПРИМЕЧАНИЕ: Графен будет двигаться, когда пятно. Убедитесь, что графен остается в верхней части окна, касаясь микрочипа только с краем фильтровальной бумаги. Используйте пинцет, чтобы удалить микрочип из металлической петли и поместить его на фильтровальную бумагу. Графен виден как фиолетовый мерцание на микрочипе(рисунок 3F). Перенесите микрочип из бумаги в отсек чашки Петри. Pipette капли воды в один из свободных отсеков и закрыть крышку, чтобы обеспечить насыщенную водой атмосферу. Печать отсек блюдо с парафиновой пленкой и хранить в холодильнике при 4 градусов по Цельсию, если требуется для дальнейших измерений. 8. СТЕМ Отрегулируйте STEM на энергии пучка 200 kV используя образец выравнивания/испытания для размера зонда по крайней мере 0.2 nm путем регулировать объективы конденсатора, ток зонда I q 180 pA (информация о томе зонда для по-разному настроек микроскопа обеспечена изготовлением в пределах точности 5%) и пучка semi-угол конвергенции 13.2 mrad путем вставлять апертуру. Установите детектор ADF STEM, открываюющий полуугольный диапазон (внутренний и внешний) до 68-280 мрад, регулируя настройки объектива проектора. Установите размер изображения STEM до 2048 х 2048 пикселей, а время обитаемого пикселя т 6 мкс. Загрузите микрочип с графен-покрытыми клетками в стандартный держатель образца для TEM таким образом, что клетки сталкиваются вверх. Загрузите держатель в электронный микроскоп. Приобрети обзорное изображение приувеличении (M) 800x(рисунок 4)с помощью настроек в шаге 8.1. Определите область интереса на ячейке. Изображение qDs с детектором ADF на M 80,000x при размере пикселя d и 1,3 нм(рисунок 4) с использованием настроек в шаге 8.1. Приобрети изображение области после экспозиции с более низким увеличением (здесь, M и 50,000x), чтобы показать выставленную область(рисунок 4). Рассчитать дозу электронагде e является элементарным зарядом. С настройками, данной в вышесказанной,и погрешность в 5%. Приобрети 20 изображений для серии доз с теми же настройками, но с т 60, что приводит к накопленной дозе. Чтобы подтвердить наличие графена, переключитесь микроскоп на TEM на M 1200x, выберите область рядом с ячейкой и переключитесь в режим дифракции. Запись дифракции шаблона во время экспозиции 0,5 с, 2048 х 2048 х 3 пикселей, и выбранной области диафрагмы 50 мкм (Рисунок 4). В конце сеанса удалите образец из микроскопа, поместите микрочип обратно в блюдо отсека, запечатав блюдо парафиновой пленкой, и храните его в холодильнике при 4 градусов по Цельсию, если это необходимо для дальнейших измерений. Выберите второй микрочип, приготовленный так же, как первый микрочип, но без графенового покрытия. Повторите шаги 8.2-8.11, но теперь для этого образца. Завехать дифракционный шаблон с теми же настройками, что и в вышеуказанном, в сравнении(рисунок 4). 9. Анализ ПРИМЕЧАНИЕ: Для автоматического обнаружения позиций в изображении STEM, анализ использует плагин локального дизайна для ImageJ (NIH), как описано в другомместе 20. Плагин доступен по запросу. Программное обеспечение автоматически применяет следующие шаги для обнаружения частиц на изображении STEM: Нанесите гауссийский фильтр, чтобы уменьшить уровень пиксельного шума. Нанесите фильтр диапазона Fast Fourier Transform (FFT) только для получения наночастиц. Установите порог для бинаризации изображения. Используйте диаметр частицы 10 нм с фактором толерантности 2 для обнаружения частиц. Обнаружить положение частиц. Измерьте расстояние от центра до центра между десятью парами ДД за серию. Здесь было измерено 10 расстояний разного размера за ряд. Рассчитайте относительное изменение расстояния частиц, сравнив расстояние каждой частицы с расстоянием на первом изображении с помощью:.

Representative Results

Рисунок 1A показывает клетки, посеянные таким образом, что окно покрыто, но с достаточным пространством, чтобы позволить им сгладить и придерживаться, что приводит к слиянию около 2/3rd (Рисунок 1B). В случае, если слишком много клеток посеяно намикрочипе (рисунок 1C), не хватает места для всех клеток, чтобы придерживаться микрочипа. На рисунке 1D показан тот же микрочип после 24 ч. Более половины клеток не сплющились. С другой стороны, если слишком мало клеток посеяны(рисунок 1E), окно SiN будет в конечном итоге с большим пустым пространством после 24 ч, как видно на рисунке 1F. На рисунке 1G показано изображение DIC клеток на рисунке 1A и рисунке 1B. Рисунок 1H показывает соответствующее изображение флуоресценции ложного цвета желтым цветом, указывающим на успешную маркировку HER2. Представитель STEM данные показаны на рисунке 4. Исследованы клетки SKBR3 с графеновой покрытием (левая колонка) и не покрытые покрытием (правая колонна). Рисунок 4A,B показать M и 800x обзор изображения клеток на окне. Области, показанные в качестве вяса были изображены на M 80,000x во время дозы серии, см. Рисунок 4C,D. ЗД видны как яркие пятна здесь. Рисунок 4E и рисунок 4F показывают M и 50,000x увеличенные изображения, приобретенные в местах прямоугольников на рисунке 4C,D. Оба изображения были записаны после приобретения дозы серии с D и (7,8 х 0,4) х 103 e-/2. Серия доз была записана на M 80,000x. Открытые области могут быть признаны прямоугольниками, в результате которых прямоугольник был хорошо виден для образца без покрытия(рисунок 4F). Для проверки наличия графена были приобретены дифракционные узоры областей без клеток, но с графеном или без него на окне SiN. Шестиугольная структура графена наблюдалась в дифракционном рисунке образца с графеновым покрытием(рисунок 4G),в то время как он отсутствовал для образца без покрытия(рисунок 4H). Дифракционная структура одного кристаллического графена будет иметь шестикратную симметрию из-за высоко заказанной шестиугольной структуры графена. Таким образом, шестиугольная структура указывает на наличие графена на образцах. Для исследования влияния освещения электронного луча на образец, STEM изображения были приобретены в серии изображений с накапливающейся дозой электрона. Репрезентативные результаты для образцов с покрытием и графеном показаны на рисунке 5A-D и рисунке 5E-Gсоответственно. Все данные были получены на краю клетки, где клетка является плоской, и наблюдаемая структура, таким образом, ближе всего к мембране SiN. Воздействие не покрытых образцов привело к появлению ярких структур на поверхности клеток в D (1,9 и 0,1) x 103 e -/q 2 (Рисунок 5B). Эти структуры стали больше с более высокими дозами, поэтому они были четко видны на последнем изображении серии на D (7,8 и 0,4) х 103 e -/q 2 (Рисунок 5C, D). Эти пятна не появились ни на одном из образцов с графеновой покрытием(рисунок 5E-G). Дополнительные микрочипы были подготовлены и изучены с использованием протокола, описанного в вышеуказанной. Всего было исследовано шесть образцов с покрытием и семь образцов без покрытия. Два из семи образцов без покрытия показали эти артефакты. Ни один из образцов с покрытием не показал каких-либо дополнительных ярких пятен. В качестве еще одной меры радиационного ущерба было изучено расстояние между РД. Если бы был нанесен структурный ущерб, можно было бы ожидать изменения расстояний между ЗД. Изменения расстояний измерялись для различных пар РД с накоплением D для диапазона парных расстояний. На рисунке 5H показано, что относительное изменение частиц для образцов, не покрытых покрытием, оставалось ниже 1,3% в среднем, в то время как среднее относительное расстояние оставалось ниже 0,8% для образцов с покрытием. Таким образом, можно сделать вывод, что графеновое покрытие стабилизировало образец, но высушенные образцы без графенового покрытия также были удивительно стабильными. Рисунок 1: Посев клеток на окне SiN кремниевого микрочипа и HER2 помечены. (A)Образцовое изображение области окна SiN с ячейками SKBR3 через 5 минут после посева на микрочипе. (B) Те же клетки распространяются на том же окне SiN после 24ч.( C ) SKBR3 клетки на микрочипе Si 5 мин после посева. (D)Те же клетки, что и в (C) после 24 ч. Клетки не сплющить должным образом, как было слишком много клеток на чипы при посеве. (E) Клетки на микрочипе 5 мин после посева. (F)Только немногие клетки были видны на окне, потому что слишком мало клеток были посеяны на микрочипе. (G)DIC изображение тех же клеток SKBR3 после маркировки HER2. (H)Наложение изображения DIC и соответствующего изображения флуоресценции помеченных клеток SKBR3 с HER2-D655 (ложный желтый цвет). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Очистка и передача графена на кристаллы NaCl. (A) PMMA-графен-на-полимер погружается в чистую воду, чтобы освободить PMMA графена. PMMA-графен можно поймать со стеклянной горкой. (B)Загрязнения на основе меди были выгравированы с использованием раствора персульфата натрия. Для очистки графена его перевели в стакан, содержащий деионизированную воду. Эти шаги повторялись 3 раза. PmMA-графен затем был переведен в насыщенный раствор NaCl в чистой воде. Кристалл NaCl был использован для того чтобы выбрать вверх графен от раствора соли. (C)PMMA-графен на кристалле NaCl высушивается в течение 30 минут при комнатной температуре. PMMA был удален путем инкубации блока в ацетоне в течение 30 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Графеновое покрытие клеток, посеянных на микрочипе Si. (A)Процедура графенового покрытия. Графен на кристалле NaCl высвобождается на поверхность воды. Графен кусок затем поймали с металлической петли и переданы на микрочип Si. (B) Микрочип (2,0 х 2,6 мм) с окном SiN размеров 400 х 160 мкм без графена. Клетки SKBR3 были видны как темные пятна. (C)Графен (красный круг), плавающий на поверхности стакана, наполненного водой. (D)Графен поймали с металлической петлей. (E) Микрочип, прикрепленный к капле воды, так что графен был на вершине окна SiN. (F)Микрочип после графенового покрытия. Графен был виден как фиолетовый мерцание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: STEM графена покрытием и без покрытия SKBR3 клеток на окне SiN. (A) STEM изображение графена покрытием образца, приобретенного на M й 800x.(B) STEM изображение не покрытием образца, приобретенного в M й 800x. ( C )Mи 80,000x изображение, записанное в положении синего прямоугольника в A. желтые линии представляет примеры расстояния, измеренные в частице. M (D ) M и 80,000x изображение, записанное в положении синего прямоугольника в B. желтая линия представляет примеры расстояний, измеренных в частицах.D (E) M – 50,000x изображение той же области, что и C, подвергаемое воздействию D (7.8’0.4) x 103 e-/2. (F) M – 50,000x изображение той же области, что и D, и подвергается воздействию D (7,8’0,4) x 103 e-/2. Открытое воздействие было хорошо видно. (G)Дифракционная картина образца с графеном из области без клеток. Шестикратная симметрия графена видна как яркие пятна. (H)Дифракционный рисунок образца без графена, показывающего отсутствие 6-кратных ярких пятен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Артефакты, возникающие на образцах без графенового покрытия. (A) Первые изображения регионов на образцах без графенового покрытия, приобретенных на M 80,000x, и подвергаются D (0,39 и 0,02) х 102 e-/q 2. (B) Изображения с первыми артефактами, возникающими в D (1,94 и 0,1) x 103 e -/2(желтые стрелки). (C, D) Последнее изображение серии, приобретенное с D q (7.8 и 0.4) x 103 e-/q2. Артефакты были видны как яркие пятна. (E-G) Образцы с графеном покрытием без возникающих артефактов. (E) D (0.39 й 0.02) x 102 e-/2 (F) D (1.94 й 0.1) x 103 e-/q2 ( G ) D (7.8 х 0.4) x 103 e-q2.2 (H)Относительное изменение расстояний частиц для образцов с покрытием графена и без покрытия. Были проанализированы два образца без покрытия, показывающие артефакты, один из которых показан в (A-C), и последнее изображение второго образца в D, а также три образца с покрытием (один показан в E-G). В общей сложности на одну выборку было исследовано десять пар ЗД с расстояниями от 250 нм до 3 мкм. Относительное изменение отражает среднее значение всех измерений в одной группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительная таблица 1: Рецепты решений и буферов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

Чтобы лучше понять белковую функцию, важно получить информацию о местах белка в плазменной мембране нетронутых клеток. Методы получения этой информации включают флуоресцентную микроскопиюсупер-разрешения 1,,2. Хотя микроскопия супер-разрешения более добавочена над прошлыми летами, свое разрешение все еще ограничено до около 20 nm для практически условий экспериментов клетки, пока типичные протеины приемных рецепторов имеют размеры в ряде 1-10 nm. С помощью EM возможна визуализация белков на уровне одной клетки и одной молекулы с достаточным разрешением для визуализации белков. Но из-за секционирования, обычные методы EM обычно неоставляют клетку нетронутой 26,что приводит к потере важной информации о контексте и пространственном распределении белков в плазменной мембране. Методы для целых клеток с крио-TEMбыли разработаны 6, это возможно, чтобы объединить белковой маркировки с крио-EM27, также крио-STEM былопродемонстрировано 28. Тем не менее, крио-EM рабочие процессы оптимизированы для изучения клеточной ультраструктуры и структуры белка, и не столько для анализа мембранного белка пространственных распределений. Критическая точка сушки является еще одним методом подготовки целых клеток, но образцы подвергаются несколько этапов сушки, и техника очень многовремени 29. Мембранные белки также были изучены с помощью заморозкиперелома 7. В этом методе клетки фиксируются, замораживаются и ломаются. Раздробленные части реплицируются слоями углерода и платины, а биологический образец удаляется. Реплики могут быть проанализированы с EM30. Анализ целых клеток невозможен с замораживанием фракции, потому что теряется информация о распределении белков в мембране в контексте всей клетки.

Представленный здесь метод позволяет изучать клеточную мембрану без необходимости тонко нарезать образец9,,31. Клетки остаются нетронутыми, так что локализация мембранных белков видна на изображениях флуоресценции, которые коррелируют с изображениями EM. Изучение белков на уровне одной клетки и одной молекулы в нетронутых клетках в гидратированном состоянии показало, что это возможно с разрешением 2 нм с использованием STEM помеченных белков, использующих этот метод корпусаграфена 9. Сохранение клеток в их родном состоянии имеет решающее значение, так как сохраняет пространственное распределение мембранных белков таким образом, что анализы возможны на уровне одной клетки и одной молекулы, что важно для понимания белковых функций, и разработки новых препаратов для подходов к терапии.

Другим важным аспектом визуализации биологических образцов с ПОМОЩЬЮ EM является радиационное повреждение образцов, вызванных электронным лучом. Решения часто включают в себя снижение дозы электрона как можно больше или различные методы покрытия, такие как инкапсуляция образца между тонкими слоямиуглерода 32. Наш метод показывает, что графеновое покрытие уменьшает индуцированные лучом артефакты, которые появляются на поверхности клетки для не покрытием образцов. Изучение химически фиксированных и графеновых биологических образцов возможно при облучении электронным лучом при 200 энергиях луча кеВ до D (7,8 х 0,4) x 103 e –/q 2 без повреждения радиацией, таких как яркие пятна, появляющиеся на образце. По сравнению с другими методами EM, которые включают в себя разработку подготовки образца, например, окрашивание, встраивание, (крио-) раздел, ГРП и т.д., метод, описанный здесь, требует меньше времени. Маркировка белков выполняется в течение нескольких часов, а графеновое покрытие требует всего около 15 минут для обученных исследователей. Препарат образца сопоставим с процедурами, необходимыми для флуоресценции микроскопии.

Протокол может быть изменен в некоторых шагах. Графен на микрочипе также может быть высушен воздухом, чтобы убедиться, что графен не двигается при смытом фильтровальной бумагой. Если графен загрязнен солью, можно позволить ему плавать на поверхности воды в течение примерно одного часа, чтобы растворить соль и тем самым свести к минимуму загрязнение. Возникновение загрязнения меди или PMMA графеном может быть уменьшено путем расширения соответствующих этапов травления в протоколе. Другие методы графенового покрытия были описаны, где, например, графен-PMMA был непосредственно депонирован на клетки, и PMMA был удален путем мытья в ацетонепотом 33. В нашем методе, PMMA был удален перед покрытием, чтобы избежать любого возможного повреждения клеток, вызванных дополнительными шагами мытья ацетона. NaCl был выбран в качестве субстрата здесь, потому что он плоский, поэтому он не морщин графена, и он растворяется в воде, чтобы освободитьграфен 9. Кроме того, его можно нарезать на нужный размер и не оставить на графене остатки субстрата. Но принимая эти критерии во внимание, другие субстраты, как хлорид калия, возможно, могут быть использованы также.

Чтобы уменьшить вероятность потенциальной кластеризации, вызванной этикеткой, шаг фиксации ГА может быть реализован сразу после фиксации FA, после чего все мембранные белки обездвижены. Первый шаг фиксации с FA уже фиксирует биологическую структуру, но снижение уровня диффузии мембранного белка все еще можетпроизойти 34, возможно, приводит к этикетке индуцированной кластеризации из-за присутствия нескольких стрептавидин на йД. Фиксация с ГА может привести к автоматическому сигналу флюоресценции во время LM, и, следовательно, делается после LM в описанном протоколе, но может быть уменьшена, как описано вдругом месте 34. Какодилат буфер является довольно токсичным, и другие фиксаторы могут быть использованы, а также, но какодилат используется здесь, как это широко используется буфер для EM протоколов, избегает осадков, предотвращает рост бактериальных и грибков, и совместим с ионами кальция, которые необходимы для сохранения ультраструктурнойцелостности липидных мембран 35. При необходимости, осмий тетроксид может быть использован в качестве дополнительной фиксации для стабилизации липидов. Это помогло бы повысить контрастность клеточной структуры, а также добавить еще один металл в систему и уменьшить контраст, полученный на йDs.

Протокол, описанный здесь, содержит много шагов, которые требуют хорошей инструкции. Некоторые тренировки необходимы перед обработкой микрочипов, чтобы избежать царапин на поверхности SiN микрочипов и предотвратить поломку. Как упоминалось ранее, рекомендуется готовить микрочипы в дубликатах, так как окно SiN может время от времени ломаться. Получение необходимого количества ячеек на микрочипе также требует некоторого опыта. Покрытие клеток графеном нуждается в некоторой подготовке, как это может быть трудно найти правильный угол наклона плавать графена на воде. При ловле графена из воды, это также может быть трудно увидеть тонкий графен. Как только графен находится на микрочипе, избыток воды должен быть смыт фильтровальной бумагой. Это должно быть сделано только с кончиком фильтровальной бумаги, чтобы избежать удаления графена из микрочипа.

Графеновое покрытие предотвратило появление артефактов на образце. Но для D Lt; 4 x 102 e–/No 2 также не появились артефакты для образца без покрытия, и артефакты появились только для 2 образцов без покрытия. Таким образом, исследования клеток, не покрытых покрытием, также кажутся возможными, хотя было бы лучше использовать графен и избежать риска образования артефактов. Состав этих артефактов может быть проанализирован в будущем, чтобы дать подсказки о том, как предотвратить их образование. Что касается структурной устойчивости клеток, то наблюдалось лишь незначительное улучшение графенового покрытия. Фиксированные клетки, по-видимому, стабилизировались в исследованных тонких областях, где их структура была в непосредственной близости от мембраны SiN. То, что мы не изучить здесь, однако, были сушки артефактов, которые, как известно, происходят для клеточных образцов при воздействии вакуума4. Высыхание клеток приведет к усадение клеток, так что также расстояния йД изменится, как следствие. Для используемой здесь дозы электрона расстояние до 2Ds образцов с графеновой покрытием и без покрытия оставалось стабильным. Необходимы дальнейшие исследования для изучения влияния графенового покрытия на клетки для EM.

Одним из ограничений этого метода является то, что химическая фиксация клеток необходима; поэтому никакие эксперименты на живых клетках не могут быть выполнены. Но в случае, если маркировка не нужна и клетки с более высокой структурной устойчивостью используются, например, бактерии, то нефиксированные клетки могут быть заключены в графен для EM36, хотя и с другой толерантностью к дозе электрона. Кроме того, белки не обнаруживаются непосредственно, поэтому для визуализации белков необходимы хд. Метод выиграл бы от небольших меток. Смысл дискуссии заключается в том, хорошо это или плохо, что ультраструктура не очень хорошо видна. Наш метод аналогичен флуоресцентной микроскопии, где видны только отдельные белки37. Повышение видимости ультраструктуры также добавит гораздо больше информации к изображению, а затем в какой-то момент предотвратит обнаружение отдельных позиций метки. Кроме того, метод, описанный здесь для одного вида белка, и дополнения протокола необходимы, чтобы иметь возможность маркировать несколько белков. Наконец, метод работает, когда небольшое высокое сродство специально связывающей молекулы, такие какантитела миметические 21 илинанотела 38 доступна. Обычно используемые антитела гораздо больше и предотвратит обнаружение функционального состояния белковых субъедилений в олигомеры.

Наш метод полезен для изучения белковой функции на целых клетках с помощью ЭМ, сохраняя при этом клетки в гидратированном состоянии. Легко можно исследовать ряд клеток. Другие типы клеток и белков могут быть изучены, а также. Если маркировка белка не нужна, подмножество протокола может быть использовано для графенового покрытия широкого спектра биологических образцов. Способность изучать целые клетки актуальна в клеточных исследованиях для понимания корреляций функции мембранного белка на молекулярном уровне.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Д.Б. Пеки за помощь в составлении протокола клеточной культуры, Ф. Вайнберга за рецензирование рукописи, Т. Трамперта за помощь в экспериментах и фигур, С. Смолку за помощь с цифрами и Э. Арца за поддержку через INM. Это исследование финансируется Else Крёнер-Фрезениус-Стифтунг.

Materials

Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 – 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 – 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 – 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400×150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 – 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. . The Transmission Electron Microscope. , (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. . Transmission electron microscopy: physics of image formation. , (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. . Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. . Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

Tags

GrapheneElectron MicroscopyMammalian CellsLiquid-phaseCell ImagingHER2Antibody MimeticPMMA GrapheneSodium PersulfateSodium Chloride

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image