Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (<em>Lactuca sativa</em> L.) and Crop Wild Relatives (<em>Lactuca</em> spp.)

In&#233;s Medina-Lozano; Juan  Ram&#243;n Bertol&#237;n; Raquel Zufiaurre; Aurora D&#237;az

doi:10.3791/61440

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Bioquímica

Verbesserte UPLC-UV-Methode zur Quantifizierung von Vitamin C in Salatsorten(Lactuca sativa L.) und Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Published: June 30, 2020

doi:

10.3791/61440

Inés Medina-Lozano*^1,4, Juan Ramón Bertolín*^2,4, Raquel Zufiaurre³, Aurora Díaz^1,4

¹Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ²Unidad de Producción y Sanidad Animal,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ³Dpto Química Analítica,Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), ⁴Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

Summary

Wir präsentieren eine schnelle und zuverlässige Methode zur Quantifizierung von Vitamin C in Lactuca spp. mit UPLC-UV, die möglicherweise auf andere Pflanzen übertragbar ist. Die wichtigsten Schritte sind die Probenvorbereitung und Vitamin-C-Extraktion unter stabilen Bedingungen, die Reduktion von Dehydroascorbinsäure zu Ascorbinsäure und die Optimierung des chromatographischen Verfahrens.

Abstract

Vitamine, insbesondere Vitamin C, sind wichtige Mikronährstoffe, die in Obst und Gemüse zu finden sind. Vitamin C ist auch ein wichtiger Beitrag zu ihrer antioxidativen Kapazität. Salat ist eines der beliebtesten Gemüse unter den Verbrauchern weltweit. Ein genaues Protokoll zur Messung des Vitamin-C-Gehalts in Salat und anderen verwandten Arten ist von entscheidender Bedeutung. Wir beschreiben hier ein Verfahren mit der ultra-hochleistungsreichen Flüssigchromatographie-Ultraviolett-Ultraviolett-Technik (UPLC-UV), bei der Probenvorbereitung, Vitaminextraktion und Chromatographie optimiert wurden.

Proben wurden gesammelt, um die gesamte Pflanze darzustellen, gefroren bei -80 °C und lyophilisiert, um unerwünschte Oxidation zu verhindern und ihre Manipulation zu erleichtern. Die Extraktion von Vitamin C erfolgte in sauren Medien, was auch zu seiner Stabilität beitrug. Da Vitamin C in zwei verschiedenen interkonvertierbaren Formen vorliegen kann, Ascorbinsäure (AA) und Dehydroascorbinsäure (DHAA), sollten beide Verbindungen für eine genaue Quantifizierung gemessen werden. Die DHAA wurde indirekt nach ihrer Reduktion auf AA quantifiziert, da AA eine höhere Absorptivity als DHAA im UV-Bereich des Spektrums aufweist. Aus demselben Extrakt wurden zwei Messungen durchgeführt, eine vor und eine nach dieser Reduktionsreaktion. Im ersten Fall quantifizierten wir den AA-Gehalt, und im zweiten Quantifizierten wir die Summe von AA und DHAA (TAA: Gesamtascorbinsäure) in Form von AA. Dann wurde die DHAA-Menge indirekt durch Subtraktion von AA von der ersten Messung von TAA erhalten. Sie wurden von UPLC-UV bestimmt, indem sie einen kommerziellen AA-Standard nutzten, um eine Kalibrierkurve zu erstellen und das chromatographische Verfahren zu optimieren, um AA-Peaks zu erhalten, die in kurzer Zeit vollständig gelöst wurden. Dieses Protokoll kann leicht auf jedes andere Pflanzenmaterial mit leichten oder gar keinen Änderungen extrapoliert werden. Seine Genauigkeit zeigte statistisch signifikante Unterschiede, die sonst nicht wahrgenommen wurden. Weitere Stärken und Grenzen werden im Manuskript ausführlicher diskutiert.

Introduction

Kultivierter Salat (Lactuca sativa L.) ist eines der am häufigsten produzierten und konsumierten Blattgemüse weltweit, mit einer Gesamtproduktion von rund 27,3 Millionen Tonnen im Jahr 2018¹. Salat wird von den Verbrauchern als gesund empfunden. Die ernährungsphysiologischen Eigenschaften werden hauptsächlich auf die Quelle antioxidativer Verbindungen in der Kultur, wie Vitamin C, u.a. wie Polyphenole und Vitamin E^2,zurückgeführt. Vitamin C ist ein essentieller Mikronährstoff für den Menschen im Gegensatz zu vielen anderen Wirbeltieren, da wir nicht in der Lage sind, es aufgrund von Mutationen zu produzieren, die in der Genkodierung für das letzte Schrittenzym im biosynthetischen Signal³vorhanden sind. Es ist für einen normalen Zellstoffwechsel erforderlich und es spielt auch eine wichtige Rolle bei immunantworten vor allem aufgrund seiner antioxidativen Aktivität³^,⁴.

Das gesamte Vitamin C besteht aus Ascorbinsäure (AA) und Dehydroascorbinsäure (DHAA). AA ist die biologisch aktivste Form des Vitamins, aber DHAA (sein Oxidationsprodukt) zeigt auch biologische Aktivität und es kann leicht in AA im menschlichen Körper umgewandelt werden⁵. Daher ist die Quantifizierung beider Formen wichtig, um den Gesamtgehalt an Vitamin C bei jeder Gartenbaupflanze zu bestimmen, einschließlich Salat.

Zur Messung von Vitamin C in Gemüse wurden verschiedene Ansätze verwendet, die auf verschiedenen Analysetechniken basieren, wie z. B. enzymatische, spektrophotometrische und titrimetrische Methoden^6,⁷^,⁸. Obwohl diese Methoden einfach sind, sind sie nicht chemisch spezifisch für AA⁹. Daher werden chromatographische Verfahren bevorzugt, insbesondere die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Ultravioletttechnik (HPLC-UV), da sie eine höhere Genauigkeit^{aufweisen 10}. HPLC-UV wurde verwendet, um Vitamin C in einer großen Vielfalt von Kulturen zu bestimmen, wie Brokkoli, Spinat und Salat¹¹^,¹²^,¹³. Die gleichzeitige Quantifizierung von AA und DHAA ist jedoch aufgrund der geringen Absorptivity von DHAA im UV-Bereich des Spektrums kompliziert. Alternativ kann DHAA indirekt bestimmt werden, indem ein Reduktionsmittel verwendet wird, das DHAA in AA umwandelt, die gesamte Ascorbinsäure (TAA) misst und dann die Differenz zwischen TAA und AA berechnet. Aufgrund der Notwendigkeit einer Reduktionsreaktion wurde in einigen Studien nur AA¹⁴quantifiziert, was tatsächlich eine Unterschätzung der Vitamin-C-Aktivität darstellen könnte. Diese zusätzliche Reduktionsreaktion ist auch erforderlich, um DHAA indirekt zu bestimmen, auch wenn der letzte Fortschritt in der Flüssigchromatographie, die Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (UPLC), verwendet wird. Dieser Schritt profitiert auch von den Vorteilen, die UPLC im Vergleich zu HPLC bietet: höhere Effizienz und Auflösung, erhöhte Empfindlichkeit, kürzere Zeitanalyse und geringerer Lösungsmittelverbrauch¹⁵. In der Folge wurde die UPLC-UV-Technik zur Quantifizierung von Vitamin C in verschiedenen Kulturen verwendet¹⁶.

Darüber hinaus ist AA ein sehr labile Molekül; Daher ist es wichtig, ein Protokoll zu entwickeln, das seinen Abbau während der Salatlagerung und Der Vitamin-C-Analyse⁹verhindert. In diesem Zusammenhang bietet das folgende Protokoll eine schnelle und verbesserte Quantifizierung des Vitamin-C-Gehalts im Salat durch UPLC-UV sowie ein effizientes Extraktionsverfahren. Nicht nur Elite-Sorten wurden in die vorliegende Studie einbezogen, sondern auch traditionelle Landrassen und einige wilde Verwandte aufgrund ihres potenziellen Interesses an der Pflanzenzüchtung, insbesondere in der Verbesserung des Nährwerts von Salat.

Protocol

1. Pflanzenmaterialaufbereitung Probe mindestens zwei Blätter pro Pflanze in 50 ml Polypropylen-Röhren, eine äußere (ältere) und eine innere (jüngere), um die gesamte Pflanze genauer darzustellen. Sammeln Sie mindestens drei biologische Replikationen für jede Probe. Einfrieren Sie sie sofort mit flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei -80 °C bis zum Gebrauch. Stellen Sie sicher, dass der flüssige Stickstoff nicht in die Rohre gelangt; andernfalls könnten sie explodieren, wenn sie durch die Gasausdehnung während der Verdampfung entfernt werden.VORSICHT: Handschuhe und ein Gesichtsschutz sind aufgrund der potenziellen Gefahren im Zusammenhang mit der Verwendung von flüssigem Stickstoff erforderlich. Entfernen Sie die Kappen aus den Rohren und legen Sie sie auf die Schalen innerhalb der Gefriertrocknerkammer des Lyophilisators (Materialtabelle) programmiert wie folgt: -25 °C für 72 h, -10 °C für 10 h, 0 °C für 10 h und 20 °C für mindestens 4 h. Halten Sie die Kondensatortemperatur und das Vakuum während des Gefriertrocknungsprozesses bei -80,2 °C bzw. 112 mTorr konstant. Wenn das Material vollständig trocken ist (zwischen 4 und 7 Tagen je nach Pflanze und Verdichtungsgrad in das Rohr), bei 4 °C, -20 °C oder -80 °C für kurze (Tage bis Wochen), mittlere (Monate) bzw. lange (Jahre) Lagerung aufbewahren. Es wird empfohlen, Beutel, die Kieselgelperlen enthalten, in die probenhaltigen Röhrchen aufzunehmen. Legen Sie die lyophilisierten Proben in 20 ml Polypropylenrohre zusammen mit 10 mm Durchmesser Edelstahlkugeln und schleifen Sie sie mit einem Multiröhrenwirbel mit der Intensität und Zeit, die erforderlich ist, um einen Feinstaub zu erhalten.HINWEIS: Schützen Sie die Proben während des gesamten Prozesses vor direkter Lichteinwirkung. 2. Reagenz und Lösungsvorbereitung Bereiten Sie die Lösungsmittelextraktionslösung vor: 8% Essigsäure (v/v), 1% MPA (Metaphosphorsäure) (w/v), 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure). Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Lösungsmittels, das für die Verarbeitung des gesamten Probensatzes benötigt wird, wobei zu berücksichtigen ist, dass jedem 5 ml zugesetzt wird. Zur Zubereitung von 1 L der Lösung zu einem Kolben hinzufügen: 30 g MPA, 0,372 g EDTA-Dehydrat, 80 ml Essigsäure und 500 ml Reinstwasser (Skala Mengen und Mengen entsprechend). Versiegeln Sie den Kolbenmund mit Einer Kunststofffolie. Einmal mit Hilfe eines Magnetischen Rührers gelöst, verwenden Sie einen Volumetkolben, um 1 L genau zu messen, wobei das notwendige Reinstwasser hinzugefügt wird. Bereiten Sie den Reduktionsreaktionspuffer (0,5 M Tris (2-Amino-2-(Hydroxymethyl)-1,3-propandiol) pH 9,0) und die Reduktionslösung (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) mit 0,5 M Tris pH 9,0) vor. Berechnen Sie das Gesamtvolumen der reduzierten Lösung, die für die Verarbeitung des gesamten Satzes von Proben erforderlich ist, wobei zu berücksichtigen ist, dass jedem von ihnen 200 L hinzugefügt werden. Um 100 ml des Puffers vorzubereiten, fügen Sie zu einem Becher hinzu: 6.055 g Tris und 90 ml Reinstwasser (Skala Mengen und Mengen entsprechend). Versiegeln Sie den Bechermund mit Kunststofffolie. Nach der Auflösung mit Hilfe eines Magnetischen Rührers, stellen Sie die Lösung auf pH 9,0 durch Zugabe von 2 M HCl und verwenden Sie einen volumetrischen Kolben, um genau 100 ml messen, hinzufügen das notwendige Reinstwasser. Um 100 ml der Reduktionslösung vorzubereiten, fügen Sie ein Becher hinzu: 0,629 g DTT (Reinheit: 98%) und 90 ml des Puffers (0,5 M Tris pH 9,0) zuvor vorbereitet (2.2.1 bis 2.2.2). Skalieren Sie Mengen und Mengen entsprechend. Versiegeln Sie den Bechermund mit Kunststofffolie. Einmal mit Hilfe eines Magnetrührers gelöst, verwenden Sie einen volumetrischen Kolben, um 100 ml genau zu messen, wobei das erforderliche Puffervolumen 0,5 M Tris pH 9,0 hinzugefügt wird.HINWEIS: Die Reduktionslösung ist sehr instabil. Deshalb wird dringend eine frisch zubereitete Lösung empfohlen. Schwefelsäure (0,4 M H2SO4) Berechnen Sie das Gesamtvolumen von 0,4 M Schwefelsäure, das für die Verarbeitung des gesamten Probensatzes erforderlich ist, wobei zu berücksichtigen ist, dass jedem der Proben jeweils 200 l zugesetzt werden. Um 100 ml der Lösung vorzubereiten, zu einem Becher hinzufügen: 80 ml Reinstwasser und dann 2,22 mlH2SO4 (Reinheit: 96%, Dichte: 1,84 g ml-1). Verwenden Sie einen Volumetkolben, um 100 ml genau zu messen und das notwendige Reinstwasser hinzuzufügen.VORSICHT: Schwefelsäure ist sehr ätzend, daher muss sie mit Schutzausrüstung und unter der Haube behandelt werden. Darüber hinaus sollte die Säure zu Reinstwasser und nicht Zuserwasser zu Säure hinzugefügt werden, um Dämpfe zu reduzieren und Unfälle zu vermeiden. Salzsäure (2 M HCl). Um 100 ml 2 M Salzsäure zuzubereiten, zu einem Becher hinzufügen: 80 ml Reinstwasser und dann 6,13 ml HCl (Reinheit: 37%, Dichte: 1,19 g ml-1). Versiegeln Sie den Bechermund mit Kunststofffolie. Verwenden Sie einen Volumetkolben, um 100 ml genau zu messen und das notwendige Reinstwasser hinzuzufügen. Skalieren Sie Die Volumes entsprechend.VORSICHT: Salzsäure ist sehr ätzend, daher muss sie mit Schutzausrüstung und unter der Haube behandelt werden. Darüber hinaus sollte die Säure zu Reinstwasser und nicht Zuserwasser zu Säure hinzugefügt werden, um Dämpfe zu reduzieren und Unfälle zu vermeiden. AA-Standard (Bestand und Verdünnungen) Wiegen Sie genau 10 mg AA-Standard (Reinheit: 99%) mit einer Präzisionswaage und fügen Sie 90 ml mobile Phase (Ultrapure Wasser pH 2.0 mit Ameisensäure). Einmal mit Hilfe eines Magnetischen Rührers gelöst, verwenden Sie einen volumetrischen Kolben, um 100 ml genau zu messen, wobei Sie das notwendige Volumen an Reinstwasser pH 2.0 mit Ameisensäure hinzufügen.HINWEIS: Schützen Sie diese Lagerlösung vor der Lichteinwirkung. Bereiten Sie fünf Verdünnungen aus dem Bestand des AA-Standards vor, um eine Kalibrierkurve gemäß den Anweisungen in Tabelle 1 zu erhalten, und fahren Sie mit Schritt 5.2 fort. Standard [AA] (g mL-1) AA -100 -gmL-1) Lösung (l) Mobile Phase (L)a 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 a Reinstwasser pH 2,0 mit Ameisensäure versauert. Tabelle 1: Protokoll zur Vorbereitung von fünf AA-Normen (Ascorbinsäure). Volumen von Gelösten und Lösungsmitteln zur Herstellung jeder der verschiedenen Konzentrationen der Normen sind angegeben. 3. Extraktion von AA und DHAA HINWEIS: Es wird empfohlen, während der Extraktionsschritte unter Bedingungen niedriger Lichtintensität zu arbeiten. Zu einem 15 ml Polypropylen-Zentrifugenrohr 50 mg lyophilisierte Bodenprobe und 5 ml des Extraktionslösungsmittels (Schritt 2.1) hinzufügen. Schütteln Sie die Mischung mit einem Wirbel für 5 s und dann einen Orbital-Shaker für 10 min bei 2000 Rpm. Führen Sie das Rohr in einem Ultraschallbad für 10 min bei Raumtemperatur mit Ultraschall aktiviert. Zentrifuge bei 4.000 x g für 10 min bei 4 °C. Nehmen Sie den Überstand, durchqueren Sie ihn durch einen 0,22 m regenerierten Zellulosefilter und lagern Sie ihn in einer 5 ml Bernsteindurchstechflasche. Dies ist Extrakt 1, der AA und DHAA enthält.HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden, indem die Extrakte bei -80 °C eingefroren werden und sie vor Lichteinwirkung geschützt werden, da AA und DHAA sehr instabil sind und leicht in Gegenwart von Licht, bei hohen Temperaturen oder unter oxidierenden Atmosphären abbauen (Zusatzdatei 1). 4. DHAA-Reduktion auf AA zur Extraktion von TAA 200 l Extrakt 1 auf eine 2 ml Bernsteindurchstechflasche für die Flüssigchromatographie übertragen und 200 l der Reduktionslösung hinzufügen (Schritt 2.2). Schließen Sie die Durchstechflasche mit einem PTFE-Silikonstecker mit Voröffnung und schütteln Sie sie mit einem Wirbel für 5 s. Lassen Sie die Lösung 30 min bei Raumtemperatur stehen und vor Licht schützen. Fügen Sie 200 l von 0,4 M H2SO4 hinzu, um die Reaktion zu stoppen und AA in sauren pH zu stabilisieren. Die resultierende Lösung ist Extrakt 2, der nur AA enthält und tatsächlich TAA ist. 5. Bestimmung UPLC-UV-Präparation Bereiten Sie die in Tabelle 2beschriebenen Arbeitslösungen vor, die entsprechend durch 0,22 m Filter gefiltert, mindestens 10 min beschallt und in das UPLC-System eingebunden werden. Schalten Sie die drei UPLC-Module ein und warten Sie, bis der interne Kalibrierungsprozess abgeschlossen ist. Öffnen Sie die Software (z. B. Empower 3) und laden Sie das in Tabelle 2beschriebene Instrumentalprogramm : Empower 3 | Ausführen von Beispielen | Vitamin-C-Methode | UPLC_PDA | Verwenden Sie QuickStart. Sobald die Software mit dem richtigen Programm geladen ist, greifen Sie auf die UPLC-Verwaltungskonsole zu: Quaternary Solvent Manager | Klicken Sie mit der rechten Maustaste | Launch Console. Zur Vorbereitung und Stabilisierung des UPLC-Instruments: System | Steuerung | Startup. Alle UPLC-Leitungen für mindestens 5 min bereinigen: Prime Solvents | QSM | Überprüfen Sie A, B, C, D und Seal Wash | Dauer der Primzahl > 5 min. Spülen und reinigen Sie den Injektor: Prime Solvents | SM | Prüfe Waschlösungsmittel (> 45 s) und Prüfe Lösungsmittel (> 35 Zyklen). UpLC auf Methodenbedingungen ausdemaieren: Ausgleich zur Methode | QSM | Durchfluss (0,3 ml min-1) | Lösungsmittel A (2%) | Lösungsmittel B (0%) | Lösungsmittel C (98%) | Lösungsmittel D (0%); Ausgleich zur Methode | SM | Probe (5 °C) | Säule (30 °C) und Ausgleich zur Methode | Sonstige | Überprüfen Sie Lampe auf | Drücken Sie Start. Warten Sie mindestens 1 h (es wird sogar mehr Zeit empfohlen), bis sich das Gerät stabilisiert hat. Stabilität kann überprüft werden, wenn der Druck in der Spalte in der Launch Consoleüberprüft wird: System | Quaternary Solvent Manager | QSM Systemdruck. Stellen Sie sicher, dass es keine identifizierbaren Trends bei Druckänderungen (entweder erhöht oder verringert) und der Deltawert kleiner als 10 psi ist. Füllen Sie im QuickStart-Bildschirm die Matrix mit den Namen der zu analysierenden Standards und Beispiele aus. AA-Bestimmung in den Standards Übertragen Sie 1 ml der fünf zuvor hergestellten AA-Normen (Schritt 2.5.3) auf 2 ml Bernsteinfläschchen für die Flüssigchromatographie. Schließen Sie die Durchstechflasche mit einem PTFE-Silikonstecker mit Voröffnung und injizieren Sie 5 l in das UPLC-Instrument. Führen Sie die Chromatographie nach dem in Tabelle 2 beschriebenen Verfahren von der am meisten verdünnten bis zur konzentriertesten durchführen. AA-Bestimmung in den Proben Pipette 200 l Extrakt 1 in einer 2 ml Bernsteindurchstechflasche für die Flüssigchromatographie und 800 l Reinstwasser hinzufügen. Schließen Sie die Durchstechflasche mit einem PTFE-Silikonstecker mit Voröffnung und injizieren Sie 5 l in das UPLC-Instrument. Durchführung der Chromatographie nach dem in Tabelle 2beschriebenen Verfahren . TAA-Bestimmung in den Proben Fügen Sie 400 l Reinstwasser zu Extrahieren 2 hinzu. Schließen Sie die Durchstechflasche mit einem PTFE-Silikonstecker mit Voröffnung und injizieren Sie 5 l in das UPLC-Instrument. Durchführung der Chromatographie nach dem in Tabelle 2beschriebenen Verfahren . Komponenten und Parameter Beschreibung Instrument Acquity UPLC H-Klasse Detektor PDA e-Detektor-Abs für AA=245 nm Software Empower 3 Spalte Aufnahme usLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 m) Kanal A CH3OH Kanal B/Wash H2O:CH3OH (50:50 v:v) Kanal C Reinstwasser pH 2,0 mit Ameisensäureversauert Kanal D/Siegelwäsche Reinstwasser:Acetonitrile (90:10 v:v) Mobile Phase 0,3 ml min-1 von 2%A + 98%C (isokratischer Modus) Spaltentemperatur 30 °C Autosampler-Temperatur 5 °C Injektionsvolumen 5 l AA-Aufbewahrungszeit 1.874 Min. Laufzeit 3 Min. a Unbestimmtes Volumen der verwendeten Ameisensäure bis zur pH-Einstellung Tabelle 2: Chromatographischeverfahren optimiert, um AA (Ascorbinsäure) in Extrakten aus Salat und wilden Verwandten zu bestimmen. Beschreibung der eingesetzten Komponenten, Bedingungen und Lösungen. 6. Quantifizierung von AA und DHAA Statistische Auswertung Bestimmen Sie die analytischen Parameter der chromatographischen Methode, wie sie von Bertolin et al.18 (Tabelle 3) beschrieben werden.ANMERKUNG: Die Werte der in Tabelle 3 dargestellten Parameter müssen unter bestimmten experimentellen Bedingungen definiert werden. Analytische Parameter der Methode Werte Linearer Bereich (g mL-1) 0.5-25 Lineare Gleichung y=53,143.03x R2 0.99998 Nachweisgrenze (mg AA g-1 Trockenmasse) 0.013 Quantifizierungsgrenzwert (mg AA g-1 Trockenmasse) 0.045 Wiederholbarkeit (CV, %)a 1.75 Zwischenpräzision (CV, %)a 4.22 Erholung (Rec, %)b 95,6±2,4 a CV: Variationskoeffizient b Der Erholungstest wurde mit 10 Aliquots durchgeführt, die 50 mg der gleichen Probe, 5 Spiked mit 2 mg AA g-1 Trockenmasse und 5 nicht-spiked enthielten. %Rec=([AA]spiked sample-[AA]sample)/([AA]spiked)x100. Tabelle 3: Optimierte analytische Parameter für den Nachweis und die Quantifizierung von AA (Ascorbinsäure) und TAA (Gesamtascorbinsäure). Der lineare Bereich, die Gleichung und der Bestimmungskoeffizient der Kalibrierkurve (R2) sowie die Grenzen der Detektion und Quantifizierung von AA (das gleiche für TAA) und die Wiederholbarkeit, Zwischengenauigkeit und Rückgewinnung wurden mit einem Probeninjektionsvolumen von 5 l erreicht. Berechnen Sie die AA- und TAA-Konzentration. Öffnen Sie die Standard- und Musterchromatogramme: QuickStart | Projekt durchsuchen | Kanäle | “Name des Standards oder Beispiels” | PDA Ch1 245 nm@1.2 nm. Integrieren Sie den entsprechenden Peak (AA oder TAA) in die Standards und Samples, indem Sie auf den Startpunkt (ca. 1.790 min) klicken und ihn mit der Maus an den Endpunkt (ca. 1.910 min) ziehen. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve, die die chromatographisch ermittelten Absorptionswerte (Schritt 5.2.) gegen die Konzentration der fünf oben genannten AA-Normen darstellt (Tabelle 1). Interpolieren Sie die Absorptionswerte der in den Schritten 5.3 und 5.4 ermittelten Proben und erhalten Sie die AA- bzw. TAA-Konzentration mit folgender Formel:wobei y der integrierte Spitzenbereich ist, x die AA- oder TAA-Konzentration in ppm und m und n die Steigung bzw. die y-Abfanglinie der erhaltenen Regressionslinie sind. Wenden Sie für die Berechnung der DHAA-Konzentration die folgende Formel an:ANMERKUNG: Um die Gesamtkonzentrationen von DHAA, AA und TAA in mg g-1 des Trockengewichts zu erhalten, müssen die in der Kalibrierkurve direkt interpolierenden Werte mit dem Gesamtenextraktvolumen und dem angewendeten Verdünnungsfaktor multipliziert und dann durch das Gewicht der zur Extraktion verwendeten Probe dividiert werden.

Representative Results

Die Vitamin-C-Quantifizierung in Lactuca-Matrixen erfordert die Entwicklung eines chromatographischen Ansatzes, der zuverlässige Ergebnisse gewährleisten kann. Abbildung 1A zeigt ein Chromatogramm, das aus einem nicht optimierten Protokoll (Supplemental File 2) resultiert, das einen AA-Peak zusammen mit einer nicht identifizierten kleinen “Schulter” darstellt. Dennoch wurde nach der Verbesserung der Extraktions- und chromatographischen Bedingungen ein gelöster AA-Peak ohne Interferenzen unbekannter Verbindungen erreicht (Abbildung 1B). Darüber hinaus ermöglichte uns der Einsatz von UPLC-UV-Geräten anstelle von HPLC-UV, die Retentionszeit (RT) für AA zu reduzieren: 1.874 min in den optimierten Chromatogrammen gegenüber 2.980 min in den nicht optimierten (Abbildung 1), sowie die Laufzeiten, 3 und 7 Minuten für die optimierten bzw. nicht optimierten Protokolle. Abbildung 1: Chromatogramme von AA in derselben Salatprobe (kommerzielle Sorte ‘Begoa’). (A) HPLC-UV-Chromatogramm, das aus einem nicht optimierten Protokoll resultiert (Bedingungen, die in der ergänzenden Datei 2 beschrieben sind). (B) UPLC-UV-Chromatogramm mit dem optimierten Protokoll (in Tabelle 2 beschriebeneBedingungen ) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Interferenzen in AA-Peaks, wie sie in Abbildung 1Abeobachtet wurden, führten durchgängig zu einer Unterschätzung des Vitamin-C-Gehalts (AA, DHAA und TAA)aufgrundeiner unzureichenden Trennung während des chromatographischen Prozesses, da die überlappenden Spitzenbereiche durch einen vertikalen Tropfen an der tiefsten Stelle zwischen ihnen integriert wurden. Diese Verzerrung macht sich besonders bei den wildlebenden Pflanzenverwandten bemerkbar, insbesondere bei DHAA- und TAA-Inhalten (Abbildung 2). Abbildung 2: Verteilung des Vitamin-C-Gehalts. Split Geigenplots von DHAA, AA und TAA Gehalt (mg g-1 des Trockengewichts) in kommerziellen und traditionellen Salatsorten und einige wilde Verwandte mit nicht optimierten und optimierten Protokollen. Schwarze Linien zeigen die Mittelwerte an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Darüber hinaus verhinderte die Verwendung eines nicht optimierten Protokolls, dass wir aus den Ergebnissen keine nützliche Schlussfolgerung ziehen konnten, da sie alle Proben zeigten, beide Salatarten und die wilden Verwandten, die einen ähnlichen Vitamin-C-Gehalt hatten. Im Gegensatz dazu ermöglichte uns das optimierte Protokoll, statistisch signifikante Unterschiede zwischen ihnen für dHAA- und TAA-Gehalt zu erkennen (Tabelle 4), wobei die wildlebenden Arten am reichsten sind (Abbildung 2). Nicht optimiert Optimiert F-Verhältnis p-Wert F-Verhältnis p-Wert DHAA 0.460 0,637ns 5.613 0.009** Aa 0.070 0,932ns 1.020 0,374ns Taa 0.015 0,985ns 4.438 0.022* ns, * und ** zeigen bei p<0,05 bzw. 0,01 nicht signifikant und signifikant an. Tabelle 4: Veränderung des Vitamin-C-Gehalts. F-Verhältnisse (Quotienten von zwei Varianzen, die Varianz zwischen gruppen- und gruppengruppenvarianz) und Signifikanzwerte aus der einwegigen ANOVA unter Berücksichtigung der Art von Lactuca (kommerzielle Salatsorten, traditionelle Salatsorten und wilde Pflanzenverwandte) für DHAA-, AA- und TAA-Gehalt in nicht optimierten und optimierten Protokollen. Zusatzdatei 1: AA- und TAA-Stabilität bei 5 °C über 24 h. (A) AA- und TAA-Spitzengebiete in 24 h. (B) AA- und TAA-Gehalt (mg g-1 Destrockengewicht) über 24 h. Balken stellen die Standardabweichungen von zwei technischen Replikationen (n=2) dar, die im Autosampler bei 5 °C gehalten und vor Lichteinwirkung geschützt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 2: Hauptunterschiede zwischen dem optimierten und dem nicht optimierten Protokoll für TAA- und DHAA-Extraktion und -Quantifizierung. Die verwendeten Proben waren in beiden Fällen identisch. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Vitamin C ist ein sehr wichtiger Nährstoff, aber es ist auch eine sehr labile Verbindung, so dass seine UPLC-UV-Quantifizierung von mehreren Faktoren abhängt, wie Probenlagerung und -vorbereitung, Extraktionsmethode und chromatographische Bedingungen. Daher war ein schnelles und einfaches Verfahren erforderlich, um aA (mit antioxidativer Leistung) Oxidation zu DHAA (ohne antioxidative Eigenschaften) zu verhindern. Es war auch entscheidend, hohe pH- und Temperaturbedingungen sowie intensives Licht und eine oxidierende Atmosphäre während der Probenbehandlung zu vermeiden, um die Stabilität der Verbindung zu fördern.

Um die AA-Oxidation zu minimieren, wurden die folgenden Maßnahmen ergriffen. Zunächst wurden Proben als Ausgangsmaterial für beide Protokolle lyophilisiert, um eine genaue Quantifizierung des Vitamin-C-Gehalts zu gewährleisten und Proben leicht zu manipulieren. Diese Option wurde dem Feinschleifen vorgezogen, das häufig in der Literatur¹⁹zu finden ist, da der Staub sehr schnell auftaut, so dass das Wasser wieder verfügbar wird. Während des Extraktionsverfahrens wurde ein höheres Volumen einer saureren Lösung (8% Essigsäure und 1% MPA) als Extraktan im optimierten Protokoll (Supplemental File 2) verwendet, das auch als Stabilisator fungierte, indem aA-Abbau verhindert wurde. Diese Lösung enthielt auch EDTA als Chelatbildner zur Erhöhung der Stabilisierung¹⁶, im Gegensatz zum Extraktanim im nicht optimierten Protokoll (Supplemental File 2). Darüber hinaus haben wir getestet, ob das Extraktionsverfahren durch die Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Extraktionen mit 2,5 ml Extraktan anstelle eines einzigen mit 5 ml und unter einer_{N2-Atmosphäre} anstelle der üblichen atmosphärischen Bedingungen verbessert werden könnte. Die besten Ergebnisse wurden mit nur einer Extraktion unter einer unveränderten Atmosphäre erzielt, was das Protokoll durch unnötige zusätzliche Schritte vereinfachte (Daten nicht dargestellt). Weitere kleinere Änderungen wurden auch in das Protokoll eingeführt, um die Extraktion zu verbessern (d.h. Beschallung), einen klareren Extrakt (feinere Filtration) zu erhalten und die Protokolldauer zu reduzieren (Zusatzdatei 2). Hinsichtlich der chromatographischen Bedingungen wurde die Validierung des Verfahrens wie vor¹⁸berichtet durchgeführt, um gute analytische Parameter zu gewährleisten (Tabelle 3). Außerdem führte die Verwendung von Reinstwasser mit Ameisensäure (pH 2,0) und Methanol (98:2 v:v) mit einem 0,3 mL min^-1 Durchfluss anstelle von Monokaliumphosphat 30 mM (pH 3,0) bei 1 mL min^-1 als mobile Phase (Ergänzungsdatei 2) zu einer verbesserten Methode. Die wichtigste Weiterentwicklung war wahrscheinlich die Verwendung eines UPLC-Systems anstelle eines HPLC, das es uns ermöglichte, die Aufprallbedingungen (wie die Temperatur) besser zu kontrollieren und zu gelösten AA-Peaks ohne Interferenzen unbekannter Verbindungen in kürzerer Zeit und weniger Volumen des Extrakts zu führen (Supplemental File 2).

Dennoch gibt es zwei Haupteinschränkungen dieser Methode. Die erste ist, dass DHAA aufgrund seiner geringen Absorptivity im UV-Bereich des Spektrums nicht direkt mit einem UV-Detektor gemessen werden kann. Es ist wichtig, den DHAA-Gehalt zu quantifizieren, da er eine bestimmte biologische Aktivität darstellt und leicht in AA im menschlichen Körper umgewandelt werden kann⁵. Dazu ist eine zusätzliche Reaktion erforderlich, um DHAA auf AA zu reduzieren, zusammen mit einem zweiten chromatographischen Durchlauf, um TAA zu messen und dann DHAA indirekt zu bestimmen, indem AA-Gehalt von TAA subtrahiert wird (Abbildung 3). In diesem Sinne wurde der Reduktionsschritt optimiert, indem eine höhere Konzentration des Reduktionsmittels (DTT) verwendet, die Reaktionszeit von 5 auf 30 min erhöht und die Reaktion mit Schwefelsäure gestoppt wurde (Zusatzdatei 2). Die geringe Stabilität von AA stellt die zweite Einschränkung der Methode dar. Da AA beginnt, 4 h nach der Extraktion zu abbauen (Supplemental File 1), ist es notwendig, es in diesem Zeitintervall zu quantifizieren. Die Anzahl der zu extrahierenden Proben wird also durch das chromatographische Verfahren bedingt. Aus diesem Grund schlagen wir vor, sie bei diesem Schritt in diesem Protokoll einzufrieren, obwohl in diesem Fall nicht alle von ihnen in den UPLC-Autosampler aufgenommen werden könnten, um automatisch gemessen zu werden. Glücklicherweise ermöglichte uns der reduzierte RT für AA 3 min Chromatogramme zu erhalten, viel kürzer als die 7 min Chromatogramme, die mit HPLC (Supplemental File 2) erhalten wurden. Daher konnte der Vitamin-C-Gehalt in einer hohen Anzahl von Proben in einem 4-stunden-Fenster bestimmt werden.

Abbildung 3: Workflow der Quantifizierung von Vitamin C in Salat und einigen wilden Verwandten.
Schematische Darstellung des optimierten Protokolls, das zwei Zweige zur Bestimmung von nur AA oder AA + DHAA (TAA) zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Da Vitamin C ein essentieller Nährstoff für den Menschen ist und aufgrund seiner wichtigen gesundheitlichen Vorteile, Es ist das Objekt vieler Studien geworden. Daher wurde es in einer Vielzahl von Kulturen quantifiziert, einschließlich Salat, eines der am häufigsten konsumierten Gemüse weltweit. Einfache klassische Methoden wurden nach und nach durch flüssige Chromatographie-Techniken ersetzt, weil sie spezifischer und genauer sind¹⁰. Aufgrund der Notwendigkeit einer zusätzlichen Reaktion zur Quantifizierung von AA und DHAA über HPLC wurden in einigen Studien über Salat jedoch nur AA¹⁴ oder nur TAA¹¹ (ohne Quantifizierung von AA vor der Reduktion von DHAA in AA) gemessen. Darüber hinaus haben nur wenige Autoren AA und DHAA quantifiziert, trotz des Beitrags beider Moleküle zur vitamin-C-Antioxidansaktivität². Dennoch ist die UPLC-Technik in letzter Zeit aufgrund ihrer höheren Leistung bei der Messung von Vitamin C in mehreren Kulturen¹⁶an Bedeutung geworden. Vergleicht man die in dieser Studie erzielten Ergebnisse mit den beiden Methoden UPLC und HPLC, so wurden diese Vorteile bestätigt: Durch eine höhere Empfindlichkeit und in sehr kurzen Zeiten wurden klar definierte AA-Peaks erreicht, was auch weniger Ressourcenverbrauch impliziert. Trotz der UPLC-Effizienz haben nur Chen et al.²⁰ diese Technik angewendet, um den Vitamin-C-Gehalt im Salat zu messen, was immer noch zu einer Unterschätzung führte, da nur die AA-Form quantifiziert wurde.

Zusammenfassend stellt diese Arbeit den ersten erfolgreichen Versuch dar, den Gesamtenvitamin-C-Gehalt nicht nur in verschiedenen Salatsorten, sondern auch in einigen ihrer wilden Verwandten zu bestimmen. Vitamin-C-Quantifizierung ist auch wichtig, um Salate mit höherer antioxidativer Aktivität innerhalb von Zuchtprogrammen auszuwählen. In diesem Sinne, der erhöhte Gesamtvitamin-C-Gehalt in Salat wilde Verwandte hier gefunden und die erhöhte AA-Gehalt in früheren Studien berichtet¹⁴, sowie andere antioxidative Verbindungen²¹, erweitert die geeigneten Kandidaten, um den Nährwert von Salaten zu verbessern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es selbst mit einigen Einschränkungen, die der Natur von Vitamin C innewohnen, wie z. B. seinem allmählichen Abbau wenige Stunden nach der Extraktion oder die Notwendigkeit einer Reduktionsreaktion aufgrund der geringen DHAA-UV-Absorptivity, eine weniger arbeitsintensive und weniger zeitaufwändige Methode zur Messung des Vitamin-C-Gehalts bietet. Darüber hinaus ist es auch sehr robust und zeigt eine hohe Empfindlichkeit und Kraft der Auflösung. Darüber hinaus ist es leicht übertragbar, nicht nur auf andere pflanzliche Materialien mit leichten oder gar keinen Veränderungen, sondern auch auf verarbeitete Produkte, die die Nahrungsaufnahme von Vitamin C an den Menschen liefern, was zu einer Vielzahl zukünftiger Anwendungen im aufkommenden Testfeld für zuverlässige Lebensmittelqualität führt.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der Vegetable Germplasm Bank of Zaragoza (BGHZ-CITA, Spanien) und dem Centre for Genetic Resources (CNG, Wageningen, Niederlande) für die Lieferung der für diese Arbeiten benötigten Samen. Wir danken J. A. Aranjuelo, A. Castellanos und “laboratorio de valoracion nutritiva” von CITA für die technische Unterstützung und D. L. Goodchild für die Überprüfung der englischen Sprache. Diese Arbeit wurde durch die Projekte RTA2017-00093-00-00 des Nationalen Instituts für Agrar- und Lebensmittelforschung und -technologie (INIA) und LMP164_18 von der Regierung von Aragén finanziert; und durch das operationelle Programm FEDER Aragon 2014-2020 und den Europäischen Sozialfonds der Europäischen Union [Grupos Consolidados A12-17R: “Grupo de investigacién en fruticultura: caracterizacion, adaptacién y mejora genéica” und A14-17R: “Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles” (SAGAS)]. I.M.L. wurde durch einen Vordoktorandenvertrag für die Ausbildung von Ärzten des spanischen Ministeriums für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (MCIU) und der spanischen staatlichen Forschungsagentur (AEI) unterstützt.

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent)	Roche	10197777001
10 mm f stainless steel ball	Euro Aznar Supplies S.L.	20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge	DeltaLab	429946
2 mL HPLC amber vial	Agilent	5190-9063
2 mL syringe with needle	DeltaLab	JS2
20 mL polypropylene tubes	Dealtalab	202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration)	Roche	10708976001
50 mL polypropylene tube	DeltaLab	429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated)	Chem-lab	CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm)	Waters	186003540
Beaker 1 L, 200 mL	DeltaLab	191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH₂PO₄)	Panreac	766384	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mixer	Heidolph	na
Heidolph Reax top mixer	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector	Hewlett Packard	na	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent	Sigma-Aldrich	255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%	Sigma-Aldrich	239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture	Agilent	5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β	Thermo Scientific Corporation	na
Sulfuric acid (H₂SO₄) 95.0-98.0% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	258105
Ultrapure water	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector	Waters	na

Referências

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Citar este artigo

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).