Kultur av neurosfärer som härrör från neurogena nischer i Adult Prairie Voles
Summary
Vi etablerade villkoren för att odla neurala stamceller från subventricular zonen och dentate gyrus av den vuxna hjärnan av präriesorkar, som en kompletterande in vitro-studie, att analysera de könsberoende skillnaderna mellan neurogena nischer som skulle kunna vara en del av funktionella plast förändringar i samband med sociala beteenden.
Abstract
Neurosfärer är primära cellaggregat som omfattar neurala stamceller och stamceller. Dessa 3D-strukturer är ett utmärkt verktyg för att bestämma differentiering och spridning potential neurala stamceller, samt att generera cellinjer än vad som kan analyseras över tiden. Också, neurospheres kan skapa en nisch (in vitro) som gör att modellering av den dynamiska föränderliga miljön, såsom varierande tillväxtfaktorer, hormoner, signalsubstanser, bland annat. Microtus ochrogaster (präriesork) är en unik modell för att förstå den neurobiologiska grunden för socio-sexuella beteenden och social kognition. Men de cellulära mekanismer som är inblandade i dessa beteenden är inte väl kända. Protokollet syftar till att få neurala stamceller från de neurogena nischerna hos den vuxna präriensork, som odlas under icke-vidhäftande tillstånd, för att generera neurosfärer. Storleken och antalet neurosfärer beror på regionen (subventricular zon eller dentate gyrus) och kön av prärien sork. Denna metod är ett anmärkningsvärt verktyg för att studera könsberoende skillnader i neurogena nischer in vitro och de neuroplasticitetsförändringar som är associerade med sociala beteenden som parbindning och biparental vård. Också, kognitiva tillstånd som medför underskott i sociala interaktioner (autismspektrumstörningar och schizofreni) skulle kunna undersökas.
Introduction
Präriesork (Microtus ochrogaster), en medlem av familjen Cricetidae, är ett litet däggdjur vars livsstrategi utvecklas som en socialt monogam och mycket sällskaplig art. Både hanar och honor etablera en varaktig par band efter parning eller långa perioder av samlevnad kännetecknas av att dela boet, försvara sitt territorium, och visar biparental vård för sin avkomma1,2,3,4. Således är prärien sork en värdefull modell för att förstå den neurobiologiska grunden för socio-sexuellt beteende och funktionsnedsättningar i social kognition5.
Vuxen neurogenes är en av de mest paramount bearbetar av neural plasticity som leder till beteendeförändringar. Till exempel rapporterade vår forskargrupp i manliga sorkar att social samlevnad med parning ökad cellproliferation i subventricular zonen (VZ) och subgranular zon i dentate gyrus (DG) av hippocampus, vilket tyder på att vuxna neurogenes kan spela en roll i bildandet av par bindning framkallas genom parning i präriesorkar (opublicerade data). Å andra sidan, även om hjärnan regioner där nya nervceller genereras och integreras är väl kända, de molekylära och cellulära mekanismer som deltar i dessa processer förblir obestämd på grund av tekniska nackdelar i hela hjärnan modell6. Till exempel, signalvägarna som styr genuttryck och andra cellulära aktiviteter har en relativt kort aktiveringsperiod (detektion av fosphoproteome)7. En alternativ modell är isolerade och odlade vuxna neurala stamceller eller stamceller för att klarlägga molekylära komponenter som är involverade i vuxna neurogenes.
Den första metoden för att upprätthålla in vitro neurala prekursorer från vuxna däggdjur (mus) hjärnan var analysen av neurosfärer, som är cellulära aggregat växer under icke-anhängare villkor som bevarar deras multipotenta potential att generera nervceller, samt astrocyter8,9,10. Under deras utveckling finns det en urvalsprocess där endast prekursorerna kommer att svara på mitogener som Epidermal Growth Factor (EGF) och Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) för att föröka och generera neurosfärer8,9,10.
Vår kunskap, är inget protokoll rapporteras i litteraturen för att erhålla vuxna neurala stamceller från prärien sorkar. Här etablerade vi kultur villkor för att isolera neuronal progenitors från neurogenic nischer och deras in vitro-underhåll genom neurosfären bildandet assay. Således kan experiment utformas för att identifiera de molekylära och cellulära mekanismer som är involverade i proliferation, migration, differentiering och överlevnad av de neurala stamceller och progenitors, processer som fortfarande är okända i prärien sork. Dessutom kan belysa in vitro-skillnader i egenskaperna hos de celler som härrör från VZ och GD ge information om den roll som neurogena nischer i neural plasticitet i samband med förändringar i socio-sexuellt beteende och kognitiva beteenden, och underskott i sociala interaktioner (autismspektrumstörning och schizofreni), som också kan vara sexberoende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett stadium för att få en neural stamcellskultur är matsmältningsperioden med den enzymatiska lösningen, som inte bör överstiga mer än 30 min eftersom det kan minska cellens livskraft. Neurosfärerna bör dyka upp vid 8-10 dagar efter den inledande kulturen; om de inte dyker upp dag 12, kasserar du kulturen och upprepar experimentet, vilket minskar rötningsperioden. En annan fråga är blodkärlen som täcker hjärnvävnaden. De bör avlägsnas helt under dissekering eftersom överskottet av erytrocyter kan stö…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av bidrag CONACYT 252756 och 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 och IN203518; INPER 2018-1-163, och NIH P51OD11132. Vi tackar Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris och Susana Castro för deras utmärkta tekniska bistånd.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
Referências
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
