Cultura delle Neurosfere Derivate dalle Nicchie Neurogeniche nelle Arvicole Della Prateria Adulta
Summary
Abbiamo stabilito le condizioni per coltura delle cellule progenitrici neurali dalla zona subventricolare e dentare il giro del cervello adulto delle arvicole della prateria, come studio complementare in vitro, per analizzare le differenze dipendenti dal sesso tra nicchie neurogeniche che potrebbero far parte dei cambiamenti plastici funzionali associati ai comportamenti sociali.
Abstract
Le neurosfere sono aggregati cellulari primari che comprendono cellule staminali neurali e cellule progenitrici. Queste strutture 3D sono uno strumento eccellente per determinare il potenziale di differenziazione e proliferazione delle cellule staminali neurali, nonché per generare linee cellulari di quanto possa essere analizzato nel tempo. Inoltre, le neurosfere possono creare una nicchia (in vitro) che consente la modellazione dell’ambiente dinamico che cambia, come diversi fattori di crescita, ormoni, neurotrasmettitori, tra gli altri. Microtus ochrogaster (prateria arvicola) è un modello unico per comprendere le basi neurobiologiche dei comportamenti socio-sessuali e della cognizione sociale. Tuttavia, i meccanismi cellulari coinvolti in questi comportamenti non sono ben noti. Il protocollo mira ad ottenere cellule progenitrici neurali dalle nicchie neurogeniche della prateria adulta, che sono coltivate in condizioni non aderenti, per generare neurosfere. Le dimensioni e il numero di neurosfere dipendono dalla regione (zona subventricolare o giro dentato) e dal sesso dell’arvicola della prateria. Questo metodo è uno strumento notevole per studiare le differenze dipendenti dal sesso nelle nicchie neurogeniche in vitro e i cambiamenti di neuroplasticità associati a comportamenti sociali come il legame tra coppie e la cura biparentale. Inoltre, potrebbero essere esaminate le condizioni cognitive che comportano deficit nelle interazioni sociali (disturbi dello spettro autistico e schizofrenia).
Introduction
La prateria(Microtus ochrogaster),un membro della famiglia Cricetidae, è un piccolo mammifero la cui strategia di vita si sviluppa come specie socialmente monogama e altamente socievole. Sia i maschi che le femmine stabiliscono un legame duraturo di coppia dopo l’accoppiamento o lunghi periodi di convivenza caratterizzati dalla condivisione del nido, dalla difesa del loro territorio e dall’esposizione di cure biparentali per la loro progenie1,2,3,4. Pertanto, l’arvicola della prateria è un modello prezioso per comprendere le basi neurobiologiche del comportamento socio-sessuale e delle menomazioni nella cognizione sociale5.
La neurogenesi adulta è uno dei processi più importanti della plasticità neurale che porta a cambiamenti comportamentali. Ad esempio, il nostro gruppo di ricerca ha riferito nelle arvicole maschili che la convivenza sociale con accoppiamento ha aumentato la proliferazione cellulare nella zona subventricolare (VZ) e nella zona subgranulare nel giro dentato (DG) dell’ippocampo, suggerendo che la neurogenesi adulta può svolgere un ruolo nella formazione del legame di coppia indotto dall’accoppiamento nelle arvicole della prateria (dati inediti). D’altra parte, sebbene le regioni cerebrali in cui vengono generati e integrati nuovi neuroni siano ben note, i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti in questi processi rimangono indeterminati a causa di inconvenienti tecnici nell’intero modellocerebrale 6. Ad esempio, le vie di segnalazione che controllano l’espressione genica e altre attività cellulari hanno un periodo di attivazione relativamente breve (rilevamento del fosfoproteoma)7. Un modello alternativo è le cellule staminali neurali adulte isolate e coltivate o le cellule progenitrici per chiarire i componenti molecolari coinvolti nella neurogenesi adulta.
Il primo approccio per mantenere i precursori neurali in vitro del cervello di mammiferi adulti (topo) è stato il test delle neurosfere, che sono aggregati cellulari che crescono in condizioni non aderenti che preservano il loro potenziale multipotente per generare neuroni, così come gli astrociti8,9,10. Durante il loro sviluppo, c’è un processo di selezione in cui solo i precursori risponderanno a mitogeni come il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) per proliferare e generare neurosfere8,9,10.
A nostra conoscenza, nessun protocollo è riportato in letteratura per ottenere progenitori neurali adulti dalle arvicole della prateria. Qui, abbiamo stabilito le condizioni di coltura per isolare i progenitori neuronali dalle nicchie neurogeniche e il loro mantenimento in vitro attraverso il test di formazione della neurosfera. Pertanto, gli esperimenti possono essere progettati per identificare i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nella proliferazione, migrazione, differenziazione e sopravvivenza delle cellule staminali neurali e dei progenitori, processi che sono ancora sconosciuti nell’arvicola della prateria. Inoltre, chiarire le differenze in vitro nelle proprietà delle cellule derivate dalla VZ e dalla DG potrebbe fornire informazioni sul ruolo delle nicchie neurogeniche nella plasticità neurale associate ai cambiamenti nel comportamento socio-sessuale e nei comportamenti cognitivi e ai deficit nelle interazioni sociali (disturbo dello spettro autistico e schizofrenia), che potrebbero anche dipendere dal sesso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno stadio per ottenere una coltura di cellule staminali neurali è il periodo di digestione con la soluzione enzimatica, che non dovrebbe superare i 30 minuti perché potrebbe diminuire la vitalità cellulare. Le neurosfere dovrebbero emergere a 8-10 giorni dopo la cultura iniziale; se non emergono entro il giorno 12, scartare la coltura e ripetere l’esperimento, riducendo il periodo di digestione. Un altro problema sono i vasi sanguigni che coprono il tessuto cerebrale. Dovrebbero essere completamente rimossi durante l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca fu sostenuta da sovvenzioni CONACYT 252756 e 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT NEL 202818 e NEL 203518; INPER 2018-1-163 e NIH P51OD11132. Ringraziamo Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris e Susana Castro per l’eccellente assistenza tecnica.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
Referências
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