온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

1. 커버 슬립 준비 참고: 이 단계는 멸균 조직 배양 후드에서 이루어져야 합니다. 10 가지 요리를 준비하기 위해 수량이 제공됩니다. 오토클레이브 30mm 붕규산 커버 유리 슬립 10개를 처리되지 않은 멸균 접시 10개에 개별적으로 넣고 멸균 증류수 2mL로 한 번 헹굽니다. 1% w/v 폴리-L-라이신 용액 0.1mL를 멸균된 증류수에 총 부피 10mL(최종 농도 0.01% w/v)로 희석합니다. 잘 섞은 다음 각 커버 슬립에 1mL를 피펫으로 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 폴리-L-라이신을 흡인하고 최소 2mL의 멸균 증류수로 각 커버 슬립을 두 번 세척합니다. 완전히 마를 때까지, 즉 최소 3시간 동안 그대로 두십시오. 2. HEK-293T 세포 파종 참고: 이러한 단계는 조직 배양 후드에서 이루어져야 합니다. HEK-293T 세포는 낮은 전류 배경과 배양 중 성장 용이성 때문에 선택되었습니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형에 적응될 수 있다. HEK-293T 세포의 80-90% 융합 T75 플라스크를 12mL 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 헹구고 2mL 트립신과 함께 2-5분 동안 배양하거나 세포가 완전히 분리되고 거의 완전히 해리될 때까지 헹굽니다. 10% 소 태아 혈청, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 10mL Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)을 추가하여 세포를 재현탁합니다. 플라스크 바닥에 부드럽게 피펫을 넣어 남아 있는 세포 덩어리를 부숴냅니다. 코팅된 커버 슬립이 포함된 원하는 수의 35mm 접시에 보충된 DMEM 2mL를 추가합니다. 각 접시에 100μL의 재현탁 세포를 추가합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다. 3. 형질주입 참고: 이러한 단계는 조직 배양 후드에서 이루어져야 합니다. 수량은 10 개의 접시의 형질 감염을 위해 제공됩니다. 부위 특이적 ANAP 결합의 경우, 표지를 위한 위치의 DNA 코돈은 황색(TAG) 정지 코돈으로 대체되어야 한다. 이 구축물은 2개의 플라스미드: pANAP 및 peRF1-E55D12,15로 공동-형질감염된다. pANAP는 ANAP 특이적 tRNA/tRNA 합성효소 쌍의 여러 사본을 암호화합니다. ANAP의 존재 하에서, 이 플라스미드의 형질감염은 호박색 정지 코돈을 인식하는 ANAP로 하전된 tRNA를 생성한다. peRF1-E55D는 전장 ANAP 태그 단백질의 수율을 증가시키는 우세한 음성 리보솜 방출 인자를 암호화합니다. ANAP로 표지하기 위한 구성물을 위해 10μg pANAP, 10μg peRF1-E55D 및 DNA가 포함된 1.5mL 튜브를 준비합니다. 보충되지 않은 DMEM으로 최종 부피 500 μL까지 가져옵니다. 별도의 튜브에서 각 1 μg의 DNA에 대해 3 μL의 지질 기반 형질주입 시약( 재료 표 참조)을 준비하고 보충되지 않은 DMEM으로 500 μL의 최종 부피가 되도록 합니다. DNA 및 형질주입 시약 혼합물을 단일 튜브에 결합하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 400 μL의 1 mM ANAP 스톡(30 mM NaOH 중 트리플루오로아세테이트 염)을 20 mL 보충된 DMEM에 첨가하여 최종 농도 20 μM ANAP를 갖는다. 도말된 셀의 오래된 배지를 접시당 2mL의 ANAP 함유 배지로 교체합니다. DNA 형질주입 혼합물의 10%를 각 접시에 피펫팅합니다. 실험 전에 33°C에서 2-4일 동안 배양합니다. 33°C에서 배양하면 세포 분열이 느려지고 세포 당 단백질 수율이 증가한다16. 4. 지붕이 없는 멤브레인 실험 한 쌍의 집게를 사용하여 형질감염된 세포가 있는 커버 슬립을 더 작은 조각으로 부수십시오. 아래 절차 중 하나에 따라 셀의 지붕을 풉니다.미리 코팅된 커버 슬립을 사용하는 경우 PBS로 조각을 헹구고 2mL PBS가 들어 있는 35mm 접시 바닥에 놓습니다. 샘플 위 3-5mm에 위치한 프로브 초음파 처리기(50W, 20%-40% 진폭, 3mm 프로브)를 사용하여 간단히 초음파 처리하여 세포의 지붕을 풀고 부착된 원형질막 조각을 남깁니다(그림 2A, C).참고: 샘플 위의 초음파 처리기 전력, 지속 시간 및 프로브 높이는 모두 커버 슬립을 완전히 훼손하지 않고 지붕이 없는 멤브레인의 높은 수율을 얻기 위해 다양할 수 있습니다. 사전 코팅된 커버 슬립을 사용하지 않는 경우 커버 슬립 조각을 PBS로 헹구고 ~30초 동안 0.1% w/v 폴리-L-라이신이 포함된 튜브에 담근 다음 간단히 초음파 처리(4.2.1단계에서와 같이)하여 지붕을 벗기고 지붕이 없는/부분적으로 지붕이 없는 원형질막 조각을 남깁니다(그림 2A,C,D). 폴리-L-라이신에 대한 짧은 노출은 커버슬립에 대한 접착력을 향상시키는 것으로 입증되었다13. 초음파 처리 된 조각을 2mL 목욕 용액이 들어있는 커버 유리 바닥 35mm 접시에 넣고 높은 NA, 60x 침수 대물렌즈가 장착 된 도립 현미경에 장착합니다. 현미경의 카메라 포트는 고감도 CCD 카메라와 직렬로 분광기에 연결됩니다. 연동 펌프를 사용하여 완충액으로 욕조 챔버(0.5 – 1mL/분)를 관류합니다. 완충액의 조성은 연구 중인 단백질에 따라 달라집니다.알림: 사용자가 작동 거리가 긴 대물렌즈에 접근할 수 없는 경우 커버 슬립의 추가 높이로 인해 지붕이 없는 멤브레인 조각에 초점을 맞추지 못할 수 있습니다. 대안은 폴리-L-라이신 유리 바닥이 있는 접시에 세포를 직접 시드하는 것입니다(예를 들어 재료 표 참조). 이렇게 하면 두 개의 유리를 통해 초점을 맞추는 것과 관련된 이미지의 잠재적인 수차도 줄어듭니다. 이러한 수차는 획득된 스펙트럼의 모양에 영향을 미치지 않습니다. 채널 형광을 찾아 ANAP 표지 채널을 발현하는 지붕이 없는 멤브레인 조각을 식별합니다(그림 2C,D).참고: 관심 단백질이 포함된 지붕이 없는 막을 식별하는 데 도움이 되도록 추가 형광 라벨(방출 스펙트럼이 ANAP 방출 스펙트럼과 구별되는 경우)을 사용하는 것이 좋습니다. 그림 2C,D 의 실험은 C-말단 형광 단백질 태그가 있는 ANAP 표지 채널에서 수행되었습니다. 현미경의 카메라 포트와 분광기 사이에 분광계 마스크를 부분적으로 맞춥니다(~10% 올림). 마스크의 그림자가 카메라 이미지에 나타납니다. 현미경 s를 조정하여 지붕이 없는 멤브레인을 분광계 마스크에 맞춥니다.tage. 지붕이 없는 멤브레인의 명시야 및 형광 이미지를 획득합니다. 분석을 위해 관심 영역을 선택하는 데 사용됩니다. 마이크로볼륨 관류 시스템의 끝을 지붕이 없는 멤브레인에 가까이 가져옵니다.참고: 배경 형광을 줄이기 위해 관류 시스템의 유출을 붕규산 유리로 만든 맞춤형 팁으로 교체했습니다. 형광 스펙트럼을 이미지화하려면 390/18nm 대역 통과 여기 필터와 416nm 에지 이색성을 통해 385nm LED로 멤브레인을 여기시킵니다. 400nm 롱패스 방출 필터를 통해 방출된 빛을 수집합니다(그림 2B). 분광계 마스크를 끼우고 방출된 빛이 통과하는지 확인합니다. 분광계 격자(300홈/mm)를 맞춥니다. 격자가 제자리에 있으면 분광계에 의해 회절된 빛이 CCD 카메라의 칩에 투사되어 스펙트럼 이미지를 생성합니다(그림 3A). 이러한 이미지는 y 차원의 공간 정보를 유지합니다. x 차원은 파장으로 대체됩니다. 선택적으로, 관심 단백질이 형광 단백질로 태그되는 경우, 적절한 필터 세트를 사용하여 형광 단백질의 스펙트럼 이미지를 획득합니다. 뉴클레오티드가 없는 완충 용액을 관류하는 동안 실험 시작 시 0.1-10초 이상 노출됩니다. 이는 실험의 나머지 부분에서 데이터를 수정하고 정규화하는 데 사용됩니다(아래 섹션 5 참조).알림: 노출 시간의 선택은 달성된 발현 수준, 형광단의 밝기 및 광학 장치에 따라 달라집니다. 신호를 최대화하고 관찰된 표백 속도를 최소화하려면 노출 시간을 선택해야 합니다. 4.10에 주어진 노출 시간 범위는 평형 결합 측정에 적합하지만, 느린 운동 변화를 측정하는 데는 유용할 수 있다(10). 짧은 노출 시간을 사용하여 더 빠른 동역학을 추적하는 기능은 하드웨어가 아닌 단백질 발현 수준과 광표백에 의해 제한됩니다. 농도-반응 곡선을 설정하기 위해 다양한 농도의 TNP-ATP(일반적으로 수조액에서 준비됨)를 적용합니다. 각 용액을 최소 1분 동안 관류하여 정상 상태에 도달하도록 하고 최소 1분 동안 수조 용액으로 각 농도를 씻어냅니다.참고: 관류 시스템이 빠르게 평형에 도달하고(그림 2E) TNP-ATP의 정확한 국소 농도를 달성할 수 있도록 하는 것이 중요합니다(그림 2F). 각 농도와 각 세척이 끝날 때 노출(4.10단계에서 사용한 것과 동일한 기간)을 취합니다. 5. 스펙트럼 분석 참고: 이 지침은 GitHub에서 찾을 수 있는 분석 코드 “pcf.m”과 함께 사용하도록 작성되었습니다. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. 추가 및 대체 코드는 https://github.com/smusher/KATP_paper_201911에서 찾을 수 있습니다. 사용자가 자신의 코드를 만들거나 데이터를 수동으로 분석하도록 선택할 수 있도록 여기에서 소프트웨어가 수행하는 작업을 설명했습니다. 명령행에 프로그램 이름(“pcf”)을 입력하여 분석 프로그램을 시작하십시오. “Select files for ROI(ROI에 사용할 파일 선택)”라는 메시지와 함께 파일/폴더 열기 대화 상자가 열리면 지붕이 없는 멤브레인의 명시야 및 형광 이미지와 관련된 파일 이름을 선택합니다. 명령줄에 출력 파일의 이름을 입력하라는 프롬프트가 나타납니다. 파일 이름을 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 소프트웨어가 명시야 및 형광 이미지를 표시할 때 소프트웨어 프롬프트에 따라 지붕이 없는 멤브레인 조각 또는 절제된 패치(섹션 6 참조)의 위치에 해당하는 스펙트럼 이미지에서 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 멤브레인이 부착되지 않은 커버 슬립 또는 접시 섹션에 해당하는 동일한 스펙트럼 이미지(ROI와 동일한 파장 범위를 나타냄)에서 배경 영역을 선택합니다(그림 3A). 소프트웨어는 ROI의 상단을 클릭하고 Enter 키를 누르고, ROI의 하단을 클릭하고, Enter 키를 누른 다음 배경 영역에 대해 이 프로세스를 반복하라는 메시지를 표시합니다. “Select File for FP Spectrum(FP 스펙트럼용 파일 선택)” 프롬프트와 함께 파일/폴더 열기 대화 상자가 열리면 형광 단백질(FP) 스펙트럼과 관련된 파일 이름을 선택합니다(4.9단계 선택 사항). FP 스펙트럼을 획득하지 못한 경우 다른 스펙트럼 파일을 선택합니다. FP 스펙트럼은 태그가 부착된 단백질과 배경 형광을 구별하기 위한 품질 관리 역할을 합니다. “Select Files for Analyis”라는 메시지와 함께 열린 파일/폴더 대화 상자가 열리면 표백제 보정에 필요한 파일을 포함하여 ANAP 스펙트럼에 해당하는 모든 파일(4.10-4.12단계)을 선택합니다. 프롬프트와 함께 파일/폴더 열기 대화 상자가 열리면 “표백 수집을 위한 파일 선택”, 실험 시작 시 뉴클레오티드가 없는 용액에서 획득한 초기 스펙트럼 또는 뉴클레오티드가 없는 용액에서 세척하는 동안 획득한 스펙트럼에 해당하는 5.6단계의 파일 하위 집합을 선택하여 보정에 사용합니다(단계 4.10에서 4.12까지). 스펙트럼을 생성하기 위해 각 이미지를 라인 평균화, 즉 각 파장에서 ROI 또는 배경 영역의 y 차원에 있는 모든 픽셀의 강도를 평균화합니다. (그림 3B). ROI에서 획득한 평균 스펙트럼에서 결과 평균 배경 스펙트럼을 빼서 결합되지 않은 TNP-ATP에서 배경 형광 및 형광을 제거합니다(그림 3C). 이러한 단계는 소프트웨어에 의해 자동으로 수행됩니다. 뺄셈된 스펙트럼의 ANAP 피크를 중심으로 한 5nm 창의 강도를 평균화하여 각 노출에 대한 ANAP 강도를 결정합니다(일반적으로 ~470nm이지만 ANAP 잔류물의 국소 미세 환경에 따라 다를 수 있음).참고: 그림 3D 는 ANAP 태그가 지정된 채널을 발현하는 지붕이 없는 막 조각의 연속 10초 노출에서 얻은 6개의 스펙트럼을 보여줍니다. 삽입물은 각 스펙트럼 피크의 평균 강도를 보여줍니다. 소프트웨어는 획득한 첫 번째 스펙트럼에서 피크 파장을 자동으로 찾고 이 값을 전체적으로 사용합니다. 강도는 소프트웨어에 의해 자동으로 계산됩니다. 주어진 노출의 ANAP 강도(F)를 시계열의 첫 번째 노출의 ANAP 강도로 나누어 각 실험에 대한 ANAP 강도를 정규화하고, 이는 4.10단계(Fmax)에서 취했습니다. 다시 말하지만, 소프트웨어는 이러한 계산을 자동으로 수행합니다. 아래 단계를 수행하여 데이터를 가져옵니다.ANAP 광표백을 보정하려면 먼저 단일 지수 붕괴(F/Fmax) = A*exp(-t/τ)+(1-A)를 피팅합니다. 여기서 t는 누적 노출 시간, τ는 시간 상수, A는 진폭)을 TNP-ATP 적용 사이의 중간 세척 단계 또는 TNP-ATP에서 세척하기 전에 수행한 다중 초기 노출에 맞춥니다(그림 3D, 삽입).알림: 소프트웨어는 이 적합을 표시하고 수락 또는 거부하라는 메시지를 표시합니다. 피팅이 거부되면 표백 보정을 위해 파일을 선택할 수 있는 또 다른 기회가 제공됩니다. 정규화된(단계 5.10에서) ANAP 스펙트럼을 각 시점에서 단계 5.11.1로부터의 지수 피팅의 예측값으로 나눕니다(도 3E).참고: 표시된 예의 경우 50초에서 관찰된 정규화된 피크 형광은 0.65이고 지수 적합치에서 예측된 형광은 0.64입니다. 표백을 수정하려면 관찰 값(0.65, 그림 3E 삽입, 빈 원)을 예측 값(0.64, 그림 3E 삽입, 점선)으로 나누어 수정된 값(~1, 그림 3E 삽입, 컬러 원)을 생성합니다. 표백 보정이 적절한 경우 뉴클레오티드가 없는 상태에서 획득한 모든 노출의 ANAP 강도는 거의 같아야 합니다(그림 3E). 이러한 계산은 소프트웨어에 의해 자동으로 수행됩니다. 추가 분석을 수행할 수 있도록 원시 스펙트럼, 빼기 스펙트럼, 광표백을 위해 보정된 스펙트럼 및 각 파일에 대한 피크 데이터가 포함된 데이터 및 탭 스프레드시트를 플로팅하는 이미지로 출력을 얻습니다. 6. 패치 클램프 형광 측정 실험 피펫 용액으로 채워졌을 때 두꺼운 벽의 붕규산 유리 모세관에서 패치 피펫을 1.5MΩ에서 2.5MΩ의 저항으로 당깁니다. 피펫 용액의 조성은 연구 중인 단백질에 따라 달라집니다. transfection된 세포가 있는 커버 슬립을 2mL 수조 용액이 들어 있는 커버 유리 바닥 35mm 접시에 옮기고 높은 NA, 60x 침수 대물렌즈가 장착된 도립 현미경에 장착합니다. 연동 펌프를 사용하여 수조 용액으로 수조 챔버(0.5 – 1mL/분)를 관류합니다. 피펫 용액의 경우, 목욕 용액은 연구중인 단백질에 따라 달라질 것이다. 세포막에서 형광을 찾아 ANAP 표지 채널을 발현하는 세포를 식별합니다. 패치 피펫에 피펫 용액을 채웁니다. 피펫에 부드러운 양압을 가하고 욕조 챔버에 넣습니다. 피펫을 셀의 멤브레인에 대고 부드럽게 흡입하여 GΩ 밀봉을 달성합니다(그림 4A). 피펫 홀더를 셀에서 빠르게 이동하여 패치를 절제합니다(그림 4A).참고: 이러한 방식으로 패치를 절제하면 단백질의 세포질 도메인이 관류 시스템에 노출되어 내부 외부 패치가 형성되어야 합니다. 연구 중인 뉴클레오티드 결합 부위의 위치가 세포질이 아닌 경우 PCF 실험을 수행하기 위해 외부 패치 또는 전체 세포 기록을 사용해야 합니다. 패치 피펫의 끝을 관류 시스템의 끝 부분에 가까이 가져와서 패치가 분광계 마스크의 슬릿 내에 있는지 확인합니다(그림 4A). 4.10-4.12단계에서와 같이 TNP-ATP와 이미지 스펙트럼을 적용하면서 동시에 뉴클레오티드 적용에 대한 이온 전류 반응을 기록합니다.참고: 피펫 유리는 획득한 이미지에 공간적 수차와 반사를 유발할 수 있습니다. 그러나 이러한 수차는 획득된 스펙트럼의 모양에 영향을 미치지 않으며 반사된 여기광은 분광기 또는 장역 통과 방출 필터를 사용하여 형광에서 쉽게 분리됩니다. 스펙트럼을 분석합니다. 절제된 패치에서 이미지화된 스펙트럼은 패치 피펫의 유리에서 TNP-ATP가 제외되어 결합되지 않은 TNP-ATP 형광의 과도한 감산을 나타낼 수 있습니다(그림 4CE). 이 과잉 감산은 ANAP 방출 스펙트럼에 영향을 미치지 않으므로 무시할 수 있습니다.참고: 절제된 패치의 형광 신호는 지붕이 없는 멤브레인보다 낮기 때문에 ANAP를 너무 빠르게 표백하지 않으면서 충분히 높은 신호 대 잡음비를 제공하는 노출 시간을 사용하는 것이 중요합니다.