Macro-reologie Karakterisering van Gill Raker Mucus in de Zilverkarper, Hypophthalmichthys molitrix

De zilverkarper, Hypophthalmichthys molitrix, is een planktivische filtervoeder en een invasieve soort die verschillende natuurlijke waterwegen in de Verenigde Staten heeft geïnfiltreerd. Deze soort werd aanvankelijk geïntroduceerd in het stroomgebied van de bovenloop van de Mississippi om algenbloei^1,2,3te beheersen. De zilverkarper is een uiterst efficiënte feeder. Doorgaans variëren de deeltjesgroottes van verbruiksvoedsel van 4 tot 20 μm tot groter zoöplankton dat ongeveer 80 μm^3,4,5is. Deze soort heeft andere inheemse vissen weggeconcurreerd en kan mogelijk enorme schade toebrengen aan inheemse waterwegen door de beschikbare hulpbronnen te beperken^1,2,6. Filtervoedende vissen zoals de zilverkarper en de grootkopkarper vormen dus een grote bedreiging voor de Grote Meren^1,2,6,7,8.

Filtervoedende vissen bezitten speciale organen die de kieuwharken (GR’s) worden genoemd met een dunne laag slijm op hun oppervlak. Deze organen verbeteren de efficiëntie van filtratie en aggregatie van kleine deeltjes uit de binnenkomende vloeistof. Het doel van het hierin gepresenteerde protocol is om de niet-Newtoniaanse, afschuifverdunnende materiaaleigenschap en opbrengstspanning van het GR-slijm verkregen van het binnenoppervlak van de kieuwharken in de zilverkarper te karakteriseren. De waarde van de vloeigrens van het GR-slijm, vastgesteld met behulp van een rotatiereometer, is van belang in dit onderzoek. De gemeten vloeigrens, ook wel de “schijnbare vloeigrens” genoemd, is afhankelijk van de testmethoden zoals steady shear rate- of dynamische oscillerende^{spanningstype 9,10.} De afschuifverdunnende, ‘opbrengst-stressvloeistof’, ondergaat een overgang van vast naar vloeistofachtig gedrag bij een kritische toegepaste spanning^9,11. De schijnbare vloeigrens is de minimale schuifspanning die nodig is om de stroom op gang te brengen of die waarbij onomkeerbare plastische vervorming voor het eerst wordt waargenomen wanneer het slijm overgaat van een gelachtig materiaal naar een vloeistofachtig materiaal. Dit gedrag kan worden waargenomen in gestructureerde visco-elastische materialen. De overgang van gelachtig naar vloeistofachtig gedrag van het GR-slijm omvat twee functies, d.w.z. een kleefrol om voedseldeeltjes te verzamelen en een transportvoertuigrol om te helpen bij het deeltjesafgifte- en filtratieproces. De uitgebreide functie van het slijm omvat het creëren van diffusiebarrières in ziekteresistentie en ademhaling, het bieden van gecontroleerde afgifte van voedingsfactoren, toxische componenten en uitscheiding, het creëren van metabole routes voor voeding en nestelen, helpen bij roofdierbescherming en het produceren van grenslaagmodificaties die de voortbeweging en voortstuwingsefficiëntie verbeteren^12,13,14.

In tegenstelling tot eenvoudige vloeistoffen bezitten complexe vloeistoffen zoals het slijm eigenschappen die variëren met de stroomomstandigheden en vereisen aanvullende meetparameters om hun fysieke gedrag op bulkschaal te definiëren. Om de viscositeit en vloeigrens van GR-slijm te bewaken, worden reologische metingen uitgevoerd met behulp van een rotatiereometer. De rotatiereometer past een constante of oscillerende schuifspanning of spanning toe door middel van een roterende schijf in contact met het vloeistofmonster en meet de respons ervan. De redenering achter het gebruik van dit instrument en deze techniek is dat de rheometer een reeks metingen kan leveren om de materiaaleigenschappen van het GR-slijm van de zilverkarper te beschrijven, die niet alleen door viscositeit kunnen worden gedefinieerd.

Het slijm is een visco-elastisch materiaal en de mechanische reactie op een opgelegde vervorming ligt tussen die van een zuivere vaste stof (beheerst door de elasticiteitswet van Hooke) en die van een zuivere vloeistof (beheerst door de viscositeitswet van Newton)^15,16. Het complexe macromoleculaire netwerk in het slijm kan zich uitrekken en heroriënteren als reactie op externe krachten of vervorming. Een rotatiereometer bestaat uit een kegelgeometrie en een Peltierplaat zoals weergegeven in figuur 1 pt figuur 2 (zie tabel 1 voor instrumentatiespecificaties). Het doel van deze studie was om een protocol te ontwikkelen om de reologische eigenschappen van het GR-slijm te bepalen. Een voordeel van de rotatiereometer ten opzichte van een viscometer is de mogelijkheid om dynamische metingen uit te voeren met behulp van kleine monstervolumes. Het GR-slijmmonstervolume in deze studie was ongeveer 1,4 ml. De viscometer daarentegen is beperkt tot constante afschuifsnelheden en vereist grote monstervolumes.

De reologische eigenschappen van het slijm zullen naar verwachting sterk variëren binnen de anatomie van de zilverkarper. De eigenschappen van het slijm dat zich op de GR-oppervlakken bevindt, kunnen bijvoorbeeld verschillen van het epibranchiale orgaan. Om rekening te houden met de potentiële variabiliteit van slijmeigenschappen in verschillende regio’s van de vis, werd het verkregen GR-slijmmonster verdund en werden oplossingen van drie concentraties gemaakt en getest met behulp van de rotatiereometer. De gegevens en resultaten met betrekking tot slijmreologie die na het uitvoeren van het protocol werden gerapporteerd, toonden de werkzaamheid van de meettechniek aan. De illustratieve gegevens die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn niet bedoeld om te worden gegeneraliseerd over de hele zilverkarperpopulatie. Het protocol dat hierin wordt gepresenteerd, kan worden uitgebreid om slijmreologie te onderzoeken over grotere steekproefsets om andere hypothesen te testen.

Het doel van deze studie is om de variatie van reologische eigenschappen van GR-slijmreologie aan te tonen met drie verschillende slijmconcentraties (400 mg / ml, 200 mg / ml en 100 mg / ml). De concentratie van 400 mg / ml vertegenwoordigt het ruwe slijmmonster dat is geoogst van de vis-GRs. Gedeioniseerd water (DI) werd gebruikt om het ruwe slijmmonster te verdunnen tot concentraties van 200 mg / ml en 100 mg / ml. Het verdunnen van de slijmmonsters maakte de evaluatie mogelijk van de mate van afschuifverdunning en schijnbare opbrengststress als functie van de concentratie en de bepaling van de concentratie waarbij het GR-slijm overgaat in niet-Newtoniaans gedrag. Een shaker werd gebruikt om grote klonten slijm in de monsters af te breken om fouten in de reologische gegevens als gevolg van inhomogeniteit te verminderen.

Bij de meeste gewervelde dieren, inclusief vissen, zijn de overheersende slijmvormende macromoleculen glycoproteïnen (mucines) die de neiging hebben om in water op te zwellen door verstrengelingen of chemische cross-linking en een gelachtig materiaal te creëren^{12,13,17,18,19,20}. De hoogmoleculaire, gelvormende macromoleculen en het hoge watergehalte weerspiegelen de gladheid in het slijm¹³. Een hoge mate van inter-macromoleculaire interacties leidt tot gelvorming, terwijl lagere niveaus van inter-macromoleculaire interacties of verbroken bindingen resulteren in vloeistoffen met een hoge viscositeit²¹.

De processen van voedseldeeltjesfiltratie in filtervoedende vissen worden geholpen door GR-slijmgerelateerde eigenschappen zoals cohesie en viscositeit die het potentieel voor hechting en kleefkracht bepalen²². De sterkte van op slijm gebaseerde adhesie hangt af van specifieke intermoleculaire, elektrostatische of hydrofobe interacties²³. Sanderson et al.²⁴ voerden een suspensievoedingsstudie uit bij zwartvissen waarin ze het bewijs vonden voor op slijm gebaseerde adhesie. Ze verklaarden dat de hechting van gesuspendeerde voedseldeeltjes met een slijmvliesoppervlak wordt gevolgd door het transport van geaggregeerde klonten deeltjes die samen met slijm zijn gebonden door gerichte waterstroom die erop inwerkt²⁴. Het slijm dat wordt blootgesteld aan schuifspanningen die worden gegenereerd door waterstroom vergemakkelijkt de levering van voedseldeeltjes aan spijsverteringsorganen. Endoscopische technieken werden gebruikt om gefilterde deeltjes te observeren²⁴.

Literatuur over het bereik van schuifsnelheden en praktische limieten bij het reologisch testen van GR-slijm is schaars. Daarom werd begeleiding gezocht bij reologische studies over maag-, neus-, cervix- en longslijm, zalmhuidslijm, hagfish-slijm en botgewricht oppervlaktesmeermiddel waarin de reologische karakterisering en niet-Newtoniaanse kenmerken werden bestudeerd^{11,12,25,26,27,28,29,30,31}. Meer recent is het effect van vishuidslijm op de voortbeweging en de stuwende efficiëntie bestudeerd met behulp van viscometrie met constante schuifsnelheid. Huidslijmreologiestudies (zonder enige verdunning of homogenisatie) met betrekking tot zeebrasem, zeebaars en mager vertoonden niet-Newtoniaans gedrag bij typisch lage afschuifsnelheden¹⁴.  In een andere gerelateerde studie bleken de ruwe huidslijmmonsters van dorsale en ventrale zijden van de Senegalese tong niet-Newtoniaans gedrag te vertonen, wat wijst op een hogere viscositeit van het ventrale slijm bij alle afschuifsnelheden die als³²worden beschouwd . Andere reologische protocollen met betrekking tot de ontwikkeling van de hydrogelsteiger en voor sterk geconcentreerde suspensies met behulp van een viscometer met constante schuifsnelheid zijn ook gemeld in de literatuur^33,34.

In deze studie werden de GR-slijmeigenschappen onderzocht met behulp van een spanningssnelheidsgecontroleerde, rotatiereometer die op grote schaal is gebruikt in reologie-experimenten op complexe biologische vloeistoffen²⁵. Voor Newtoniaanse vloeistoffen blijft de schijnbare viscositeit constant, is de afschuifsnelheid onafhankelijk en variëren de schuifspanningen lineair met de afschuifspanningssnelheden (Figuur 3A, B). Voor niet-Newtoniaanse vloeistoffen (zoals afschuifverdunnende vloeistoffen) is de viscositeit afhankelijk van de afschuifsnelheid of van vervormingsgeschiedenis afhankelijk(figuur 3A,B). De verliesmodulus (G”) vertegenwoordigt de mate waarin het materiaal bestand is tegen de neiging om te stromen en is representatief voor de viscositeit van de vloeistof(figuur 4). De opslagmodulus (G’) vertegenwoordigt de neiging van het materiaal om zijn oorspronkelijke vorm te herstellen na door spanning veroorzaakte vervorming en is gelijk aan elasticiteit (figuur 4). De fasehoek (δ) of verliestangenswaarde wordt berekend uit de inverse raaklijn van G”/G’. Het vertegenwoordigt de balans tussen energieverlies en -opslag en is ook een veel voorkomende parameter voor het karakteriseren van visco-elastische materialen (δ = 0° voor een Hookean-vaste stof; δ = 90° voor een viskeuze vloeistof; δ 45° voor een visco-elastische vloeistof) (Figuur 4)²⁵. De schijnbare vloeigrens (σ_y) in gestructureerde vloeistoffen vertegenwoordigt een verandering van toestand die kan worden waargenomen in reologische gegevens van steady state sweep en dynamische stress-strain sweeps¹⁰. Als de externe uitgeoefende spanning minder is dan de schijnbare vloeigrens, zal het materiaal elastisch vervormen. Wanneer de spanning de schijnbare vloeigrens overschrijdt (gemarkeerd als “gemiddelde spanning” in figuur 3B),zal het materiaal overgaan van elastische naar plastische vervorming en beginnen te stromen in zijn vloeibare toestand³⁵. Het meten van de opslagmodulus (G’) en verliesmodulus (G”) in het slijmmonster onder oscillerende spanning (of spanning) omstandigheden kwantificeert de verandering in de materiaaltoestand van gelachtig naar visco-elastisch vloeistofachtig gedrag.

De soorten reometertests die worden uitgevoerd om gegevens met betrekking tot opslagmodulus (G), verliesmodulus (G”) en schijnbare viscositeit (η) te bewaken, worden hier beschreven. De dynamische oscillatietests (rekvegen en frequentievegen) bewaakten G’ en G” onder gecontroleerde oscillatie van kegelgeometrie. De dynamische spanningsvegens bepaalden het lineaire visco-elastische gebied (LVR) van het slijm door de intrinsieke materiaalrespons te monitoren(figuur 4). Rekvegen werden gebruikt om het vloeigedrag bij constante oscillatiefrequentie en temperatuur te bepalen. De dynamische frequentieveegtests bewaakten de materiaalrespons op toenemende frequentie (vervormingssnelheid) bij een constante amplitude (spanning of spanning) en temperatuur. De spanning werd gehandhaafd in het lineaire visco-elastische gebied (LVR) voor de dynamische frequentieveegtests. De steady-state shear rate tests bewaakten de schijnbare viscositeit (η) onder constante rotatie van de kegelgeometrie. Het GR-slijm werd onderworpen aan incrementele spanningsstappen en de schijnbare viscositeit (η, Pa.s) werd gecontroleerd op variërende afschuifsnelheid (ý, 1/s).

Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, behandelt het GR-slijm als een complex gestructureerd materiaal van onbekende visco-elasticiteit met een bepaald lineair visco-elastisch responsbereik. Het visslijm werd gewonnen uit de GRs van de zilverkarper tijdens een visexpeditie op de Hart Creek-locatie in de Missouri-rivier door professor L. Patricia Hernandez (Department of Biological Sciences, The George Washington University) ^1,2,36.  Een reeks GRs in de mond van een zilverkarper wordt weergegeven in figuur 5A en een schematische tekening wordt weergegeven in figuur 5B. Een weggesneden GR is weergegeven in figuur 5C.  De extractie van slijm uit GR’s van de zilverkarper wordt als voorbeeld gepresenteerd in de schematische tekeningen, Figuur 5D, E. Alle reometertests werden uitgevoerd bij een constante, gecontroleerde temperatuur van 22 ± 0,002 °C, de temperatuur geregistreerd op de visplaats^1,2,36.  Elk slijmmonster werd drie keer getest met de reometer en de gemiddelde resultaten worden samen met de statistische foutbalken gepresenteerd.