Minimiser l’hypoxie dans les tranches hippocampales des souris adultes et vieillissantes

L’avènement des préparations aiguës de tranches cérébrales des mammifères a facilité des expériences au niveau cellulaire et synaptique qui n’étaient auparavant possibles que dans les préparations d’invertébrés comme l’Aplysia^1. Le développement de tranches hippocampales aiguës était d’une importance particulière, car il s’agit d’une structure responsable de la mémoire de travail et de la formation de contexte, et dispose d’un circuit tri-synaptique spécialisé qui est susceptible de manipulation physiologique facile. Cependant, la grande majorité des tranches cérébrales aiguës sont encore préparées à partir de souris et de rats relativement jeunes, car il est plus facile de préserver les neurones et les circuits sains, et les tranches restent viables pendant de plus longues périodes de temps^2,3,4. Ici, nous introduisons des modifications aux protocoles de tranchage standard qui se traduisent par une viabilité accrue des tranches hippocampales aiguës des souris adultes et vieillissantes.

Le principal obstacle à la viabilité ex vivo à long terme du parenchyme cérébral des mammifères est les dommages hypoxiques initiaux qui se produisent rapidement une fois que le flux sanguin vers le cerveau cesse après la décapitation. La perte d’oxygène entraîne une consommation métabolique rapide de ressources énergétiques importantes dans le cerveau avec la perte de phospho-créatine (P-créatine) étant la plus rapide, suivie par le glucose, l’adénosine triphosphate (ATP), et le glycogène⁴. La préservation de l’ATP est d’une importance particulière pour la santé à long terme des tranches de cerveau, comme ATP est nécessaire pour maintenir le potentiel de la membrane via le Na-K ATPase, et par conséquent l’activité neuronale^5,6. Le niveau d’ATP dans le cerveau adulte de rongeur est ~2.5 mM, et il tombe précipitamment dans 20 s de décapitation pour atteindre un état stable basal (~0.5 mM) à environ 1 min post-décapitation^4,7,8. Chez les jeunes animaux, il faut plus de temps pour observer la même baisse de l’ATP (~2 min); avec anesthésie phénobarbitale, il est encore ralenti à 4 min⁴. Ces considérations montrent que la prévention de la perte d’ATP et d’autres ressources énergétiques est une stratégie nécessaire pour prévenir les dommages hypoxiques au cerveau et à son tour pour maintenir la santé des tranches de cerveau sur de plus longues périodes de temps, en particulier chez les animaux adultes.

Les basses températures ralentissent le métabolisme. Par conséquent, il a été démontré que l’hypothermie modeste protège les réserves d’énergie du cerveau: chez les jeunes animaux, abaissant la température corporelle de six degrés, de 37 °C à 31 °C, préserve les niveaux d’ATP à environ 80% des niveaux normaux de plus de 4 h d’hypoxie contrôlée⁹. Les niveaux de p-créatine sont également préservés, ainsi que le potentiel global de phosphorylation⁹. Ceci suggère que l’abaissement de la température du corps avant la décapitation pourrait être neuroprotecteur, car des niveaux presque normaux d’ATP pourraient être maintenus par les périodes de découpage et de récupération de tranche.

Dans la mesure où une baisse d’ATP ne peut pas être complètement empêchée lors de la décapitation, on s’attend à une fonction partiellement altérée de l’ATPase Na-K, suivie d’une dépolarisation par l’afflux passif de sodium. Comme l’afflux passif de sodium est suivi par l’entrée de l’eau dans les cellules, il provoque l’œdème cytotoxique et éventuellement la pyknose. Chez les rats adultes, le remplacement des ions Na+ par du saccharose dans des solutions de coupe de tranches a été une stratégie réussie pour alléger le fardeau de l’œdème cytotoxique^10,11. Plus récemment, les cations organiques méthylées qui diminuent la perméabilité des canaux de sodium¹² ont montré qu’elles offrent une protection plus efficace que le saccharose, en particulier dans les tranches de souris adultes, le N-méthyl-D-glucamine (NMDG) étant le plus largement applicable à différents âges et régions du cerveau^13,14,15,16.

De nombreux protocoles de coupe du cerveau impliquent l’utilisation de températures froides seulement pendant l’étape de coupe de tranches, parfois en combinaison avec la stratégie de remplacement de Na⁺ ion^16,17. Chez les jeunes animaux, ces protocoles semblent offrir une neuroprotection suffisante puisque les cerveaux peuvent être extraits rapidement après la décapitation parce que le crâne est encore mince et facile à enlever³. Cependant, cette stratégie ne produit pas de tranches saines d’animaux adultes. Au fil du temps, un certain nombre de laboratoires d’étude des rongeurs adultes ont introduit la perfusion transcardique avec une solution glacée pour diminuer la température corporelle de l’animal, et donc des dommages hypoxiques au cerveau, avant la décapitation. Cette procédure a été appliquée avec succès pour produire des tranches de cérebelaire¹⁸, tranches de midbrain¹⁹, tranches néocorticales^11,20, cortex périrhinal²¹, hippocampe rat^10,22,23, ampoule olfactive²⁴, striatum ventral²⁵, cortex visuel²⁶.

En dépit des avantages offerts par la perfusion transcardique et le remplacement de Na⁺ ion dans la préparation des tranches de rat et dans certaines régions du cerveau chez la souris, l’hippocampe souris reste l’un des domaines les plus difficiles à protéger de l’hypoxie^13,20. À ce jour, l’une des approches les plus courantes pour trancher l’hippocampe à partir de souris vieillissantes et de modèles de souris de neurodégénérescence implique le tranchage rapide classique de l’hippocampe isolé²⁷. Dans le protocole décrit ici, nous minimisons la perte d’ATP dans le cerveau adulte en introduisant l’hypothermie avant la décapitation par transcardially perfuser l’animal avec^na+ glacé – fluide céphalo-rachidien artificiel à base de NMDG libre (NMDG-aCSF). Les tranches sont ensuite coupées en Na⁺-free NMDG-aCSF. Avec ce protocole amélioré, nous obtenons des tranches hippocampales aiguës de souris adultes et vieillissantes qui sont en bonne santé jusqu’à 10 h après le tranchage et sont appropriés pour les enregistrements de terrain à long terme et les études de patch-clamt.