Cuantificación De La Ingesta De Macronutrientes En Una Pantalla Neuronal Termogenética Usando Larvas De Drosophila

Todos los animales dependen de una dieta equilibrada para adquirir las cantidades necesarias de nutrientes para la supervivencia, el crecimiento y la reproducción^1. La elección de qué y cuánto comer está influenciada por una multitud de factores que interactúan relacionados con el estado interno del animal, como el nivel de saciedad, y las condiciones ambientales, como la calidad de los alimentos^2,3,4,5. Las proteínas y los carbohidratos son dos macronutrientes principales y su ingesta equilibrada es esencial para sostener los procesos fisiológicos de los animales. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos neuronales que controlan los comportamientos de alimentación y el mantenimiento de una ingesta equilibrada de estos macronutrientes es extremadamente relevante. Esto se debe a que los rasgos de la historia de vida como la esperanza de vida, la fecundidad y la salud metabólica se ven directamente afectados por los niveles de ingesta de proteínas^6,7,8,9,10.

El uso de organismos más simples y manejables que exhiben hábitos de alimentación conservados evolutivamente con animales complejos, incluidos mamíferos, es esencial para este tipo de estudios. Es importante destacar que estos modelos animales más simples proporcionan una buena oportunidad para diseccionar preguntas biológicas complejas en un contexto costoso, ética y técnicamente más efectivo. En las últimas décadas, Drosophila,con su potente conjunto de herramientas genéticas, su comportamiento intrincado y estereotipado y su arquitectura conservada de mecanismos periféricos y de detección de nutrientes con mamíferos, ha sido un modelo fructífero para los neurobiólogos conductuales^11. En última instancia, la esperanza es que al entender cómo se regula la ingesta de alimentos en este animal, con un sistema nervioso más simple, podamos comenzar a desenredar las disfunciones neuronales subyacentes a los trastornos de la alimentación humana.

El estudio de los sustratos neuronales para los comportamientos de alimentación depende profundamente de poder medir simultáneamente la ingesta de alimentos de los animales mientras se manipula su actividad neuronal. Debido a las cantidades mínimas de alimentos ingeridos, cuantificar la cantidad de alimentos ingeridos por las moscas es extremadamente difícil, y todos los métodos actualmente disponibles presentan limitaciones significativas. Por lo tanto, el patrón oro es utilizar una combinación de metodologías complementarias¹². Las moscas adultas han sido históricamente favorecidas como un modelo genético y conductual. Sin embargo, las larvas de Drosophila, también ofrecen oportunidades para investigar sustratos neuronales que codifican el comportamiento de alimentación. El sistema nervioso central (SNC) larval, con alrededor de 12.000 neuronas, es significativamente menos complejo que el del adulto, que contiene aproximadamente 150.000 neuronas. Esta menor complejidad no es solo numérica sino también funcional, ya que los comportamientos larvales dependen de funciones locomotoras y sistemas sensoriales más simples. A pesar de la aparente simplicidad de sus sistemas nerviosos, las larvas todavía exhiben comportamientos de alimentación completos, y se han descrito algunos métodos para cuantificar la ingestión de alimentos en larvas de Drosophila ^5,13,14,15. Al emparejarse con manipulaciones de la actividad neuronal, las larvas de Drosophila pueden constituir un modelo altamente manejable para comprender la regulación neuronal de la ingesta de alimentos.

Aquí se proporciona un protocolo detallado para cuantificar la ingesta de alimentos en larvas expuestas a dietas de diferente calidad de macronutrientes. Las dietas, las llamadas dietas de equilibrio de macronutrientes, diferían en el contenido de proteínas y carbohidratos, específicamente con respecto a las proporciones de proteína a carbohidrato (P:C): 1:1 (dieta rica en proteínas), 1:4 (dieta intermedia) y 1:16 (dieta pobre en proteínas), como se muestra en la Figura 1A. Brevemente, un análisis de alimentación cuantitativo de la ninguna-opción fue establecido usando estos tres isocalóricos de la sacarosa-levadura (SY) – dietas basadas teñidas con un tinte azul de la comida. Debido a que el extracto de levadura y la sacarosa se utilizaron como fuentes de proteínas y carbohidratos, y ambos contienen carbohidratos, la variación en las relaciones P:C se obtuvo cambiando el equilibrio de estos dos componentes, como se describió anteriormente¹⁶ y como se indica en la Figura 1B. Una visión general esquemática del protocolo, que muestra los principales pasos experimentales, está disponible en la Figura 2.

Este protocolo se estableció con el objetivo de investigar el papel de poblaciones neuronales específicas en la regulación de los niveles de alimentación larvaria en dietas de diferentes ratios P:C y en el contexto de una pantalla neuronal termogenética. Se utilizó una herramienta neurogenética bien caracterizada de la familia del potencial del receptor transitorio (TRP): canal de potencial del receptor transitorio de Drosophila (dTRPA1), que es un canal cationario de temperatura y voltaje bloqueado, que permite el disparo de potenciales de acción cuando las temperaturas ambiente se elevan por encima de 25 °C^17. Para expresar el transgén dTRPA1, aprovechamos las líneas Gal4 basadas en regiones cis-reguladoras del genoma de Drosophila, establecidas en el laboratorio Rubin, en el contexto del proyecto FlyLight en janelia Research Campus^18,19.

Aunque el protocolo, aquí descrito, se ha establecido en el contexto de una pantalla de activación, puede ser fácilmente adaptado por el experimentador a otras necesidades o intereses específicos, a saber, para realizar una pantalla de supresión utilizando el silenciador neuronal sensible a la temperatura ShibireTS^20,en alternativa a dTRPA1. Esta y otras adaptaciones se discuten en las secciones de protocolo y discusión.