Aquí se describe un protocolo que permite la cuantificación colorimétrica de la cantidad de alimentos ingeridos dentro de un intervalo de tiempo definido por las larvas de Drosophila melanogaster expuestas a dietas de diferente calidad de macronutrientes. Estos ensayos se llevan a cabo en el contexto de una pantalla termogenética neuronal.
Los comportamientos de forrajeo y alimentación permiten a los animales acceder a fuentes de energía y nutrientes esenciales para su desarrollo, salud y condición física. La investigación de la regulación neuronal de estos comportamientos es esencial para la comprensión de los mecanismos fisiológicos y moleculares que subyacen a la homeostasis nutricional. El uso de modelos animales genéticamente manejables como gusanos, moscas y peces facilita en gran medida este tipo de estudios. En la última década, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster ha sido utilizada como un poderoso modelo animal por los neurobiólogos que investigan el control neuronal de la alimentación y los comportamientos de forrajeo. Aunque indudablemente valioso, la mayoría de los estudios examinan las moscas adultas. Aquí, describimos un protocolo que se aprovecha del sistema nervioso larval más simple para investigar los sustratos neuronales que controlan los comportamientos de alimentación cuando las larvas se exponen a dietas que difieren en su contenido de proteínas y carbohidratos. Nuestros métodos se basan en un ensayo cuantitativo de alimentación colorimétrica sin elección, realizado en el contexto de una pantalla de activación termogenética neuronal. Como lectura, la cantidad de comida consumida por las larvas durante un intervalo de 1 h fue utilizada cuando estaba expuesta a una de las tres dietas tinte-etiquetadas que diferencian en su proteína a los ratios de los carbohidratos (P: C). La eficacia de este protocolo se demuestra en el contexto de un cribado neurogenético en larvas de Drosophila,mediante la identificación de poblaciones neuronales candidatas que regulan la cantidad de alimentos ingeridos en dietas de diferente calidad macronutrientes. También pudimos clasificar y agrupar los genotipos probados en clases fenotípicas. Además de una breve revisión de los métodos actualmente disponibles en la literatura, las ventajas y las limitaciones de estos métodos se discuten y, también, algunas sugerencias se proporcionan sobre cómo este protocolo se pudo adaptar a otros experimentos específicos.
Todos los animales dependen de una dieta equilibrada para adquirir las cantidades necesarias de nutrientes para la supervivencia, el crecimiento y la reproducción1. La elección de qué y cuánto comer está influenciada por una multitud de factores que interactúan relacionados con el estado interno del animal, como el nivel de saciedad, y las condiciones ambientales, como la calidad de los alimentos2,3,4,5. Las proteínas y los carbohidratos son dos macronutrientes principales y su ingesta equilibrada es esencial para sostener los procesos fisiológicos de los animales. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos neuronales que controlan los comportamientos de alimentación y el mantenimiento de una ingesta equilibrada de estos macronutrientes es extremadamente relevante. Esto se debe a que los rasgos de la historia de vida como la esperanza de vida, la fecundidad y la salud metabólica se ven directamente afectados por los niveles de ingesta de proteínas6,7,8,9,10.
El uso de organismos más simples y manejables que exhiben hábitos de alimentación conservados evolutivamente con animales complejos, incluidos mamíferos, es esencial para este tipo de estudios. Es importante destacar que estos modelos animales más simples proporcionan una buena oportunidad para diseccionar preguntas biológicas complejas en un contexto costoso, ética y técnicamente más efectivo. En las últimas décadas, Drosophila,con su potente conjunto de herramientas genéticas, su comportamiento intrincado y estereotipado y su arquitectura conservada de mecanismos periféricos y de detección de nutrientes con mamíferos, ha sido un modelo fructífero para los neurobiólogos conductuales11. En última instancia, la esperanza es que al entender cómo se regula la ingesta de alimentos en este animal, con un sistema nervioso más simple, podamos comenzar a desenredar las disfunciones neuronales subyacentes a los trastornos de la alimentación humana.
El estudio de los sustratos neuronales para los comportamientos de alimentación depende profundamente de poder medir simultáneamente la ingesta de alimentos de los animales mientras se manipula su actividad neuronal. Debido a las cantidades mínimas de alimentos ingeridos, cuantificar la cantidad de alimentos ingeridos por las moscas es extremadamente difícil, y todos los métodos actualmente disponibles presentan limitaciones significativas. Por lo tanto, el patrón oro es utilizar una combinación de metodologías complementarias12. Las moscas adultas han sido históricamente favorecidas como un modelo genético y conductual. Sin embargo, las larvas de Drosophila, también ofrecen oportunidades para investigar sustratos neuronales que codifican el comportamiento de alimentación. El sistema nervioso central (SNC) larval, con alrededor de 12.000 neuronas, es significativamente menos complejo que el del adulto, que contiene aproximadamente 150.000 neuronas. Esta menor complejidad no es solo numérica sino también funcional, ya que los comportamientos larvales dependen de funciones locomotoras y sistemas sensoriales más simples. A pesar de la aparente simplicidad de sus sistemas nerviosos, las larvas todavía exhiben comportamientos de alimentación completos, y se han descrito algunos métodos para cuantificar la ingestión de alimentos en larvas de Drosophila 5,13,14,15. Al emparejarse con manipulaciones de la actividad neuronal, las larvas de Drosophila pueden constituir un modelo altamente manejable para comprender la regulación neuronal de la ingesta de alimentos.
Aquí se proporciona un protocolo detallado para cuantificar la ingesta de alimentos en larvas expuestas a dietas de diferente calidad de macronutrientes. Las dietas, las llamadas dietas de equilibrio de macronutrientes, diferían en el contenido de proteínas y carbohidratos, específicamente con respecto a las proporciones de proteína a carbohidrato (P:C): 1:1 (dieta rica en proteínas), 1:4 (dieta intermedia) y 1:16 (dieta pobre en proteínas), como se muestra en la Figura 1A. Brevemente, un análisis de alimentación cuantitativo de la ninguna-opción fue establecido usando estos tres isocalóricos de la sacarosa-levadura (SY) – dietas basadas teñidas con un tinte azul de la comida. Debido a que el extracto de levadura y la sacarosa se utilizaron como fuentes de proteínas y carbohidratos, y ambos contienen carbohidratos, la variación en las relaciones P:C se obtuvo cambiando el equilibrio de estos dos componentes, como se describió anteriormente16 y como se indica en la Figura 1B. Una visión general esquemática del protocolo, que muestra los principales pasos experimentales, está disponible en la Figura 2.
Este protocolo se estableció con el objetivo de investigar el papel de poblaciones neuronales específicas en la regulación de los niveles de alimentación larvaria en dietas de diferentes ratios P:C y en el contexto de una pantalla neuronal termogenética. Se utilizó una herramienta neurogenética bien caracterizada de la familia del potencial del receptor transitorio (TRP): canal de potencial del receptor transitorio de Drosophila (dTRPA1), que es un canal cationario de temperatura y voltaje bloqueado, que permite el disparo de potenciales de acción cuando las temperaturas ambiente se elevan por encima de 25 °C17. Para expresar el transgén dTRPA1, aprovechamos las líneas Gal4 basadas en regiones cis-reguladoras del genoma de Drosophila, establecidas en el laboratorio Rubin, en el contexto del proyecto FlyLight en janelia Research Campus18,19.
Aunque el protocolo, aquí descrito, se ha establecido en el contexto de una pantalla de activación, puede ser fácilmente adaptado por el experimentador a otras necesidades o intereses específicos, a saber, para realizar una pantalla de supresión utilizando el silenciador neuronal sensible a la temperatura ShibireTS20,en alternativa a dTRPA1. Esta y otras adaptaciones se discuten en las secciones de protocolo y discusión.
Con este protocolo, se podría probar la capacidad de las larvas bajo activación termogenética de poblaciones neuronales específicas para regular los niveles de ingesta de proteínas y carbohidratos, dos macronutrientes principales, cuando se exponen a dietas de diferente composición P:C. Este método se probó en el contexto de un cribado preliminar larvario con el objetivo de identificar poblaciones neuronales asociadas con el control de la ingesta de alimentos a través de dietas de diferente calidad de macronutri…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias al Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC) por proporcionarnos acceso a parte de los equipos experimentales descritos en este protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Portuguesa para la Ciencia y la Tecnología (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 y La Caixa HR17-00595 a PMD y por una beca del Australian Research Council Future (FT170100259) a CKM.
1.5 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.690.001 | |
10xPBS | Nytech | MB18201 | |
2.0 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.695.500 | |
60 mm petri dishes | Greiner Bio-one, Austria | 628161 | |
96 well microplates | Santa Cruz Biotechnology | SC-204453 | |
Agar | Pró-vida, Portugal | ||
Bench cooler | Nalgene, USA | Labtop Cooler 5115-0032 | |
Blue food dye | Rayner, Billingshurst, UK | ||
Cell disruption media | Scientific Industries, Inc. | 888-850-6208 | (0.5 mm glass beads) |
Dish weight boats | Santa Cruz Biotechnology | SC-201606 | |
Embryo collection cage for 60 mm petri dishes | Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK | FLY1212 (59-100) | |
Featherweight forceps | BioQuip Products, USA | 4750 | |
Fly food for stocks maintenance | 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid | ||
Forceps #5 | Dumont | 0108-5-PS | Standard tips, INOX, 11cm |
Incubator | LMS Ltd, UK | Series 2, Model 230 | For thermogenetic feeding assay (30∘C) |
Incubator | Percival Scientific, USA | DR36NL | To stage larvae (19∘C) |
Janelia lines | Janelia Research Campus | Detailed information in Table 2 | |
Macronutrient balancing diets | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
Methanol | VWR | CAS number: 67-56-1 | |
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
Nitrile gloves | VWR, USA | ||
Refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | 5804 R / Serial number: 5805CI364293 | |
Rubin Gal4 ines | Janelia Research Campus | Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center | |
ShibireTS UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 66600 | Provided by Carlos Ribeiro Group |
Soft brushes | For sorting anaesthetised fruit flies | ||
Spectrophotometer plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 51119300 | |
Stereo microscope | Nikon | 1016625 | |
Sucrose | Sidul, Portugal | ||
Third-instar larvae (L3) rearing diet | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
Timer | |||
Tissue lyzer / bead beater | MP Biomedicals, USA | FastPrep-24 6004500 | |
TRPA1 UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 26264 | Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C |
Water bath | Sheldon Manufacturing Inc., USA | W20M-2 / 03068308 / 9021195 | |
Yeast extract | Pró-vida, Portugal | 51% Protein, 15% Carbohydrate |