Sår-induceret polyploidisering er en bevaret væv reparation strategi, hvor cellerne vokser i størrelse i stedet for at dividere for at kompensere for celletab. Her er en detaljeret protokol om, hvordan man bruger frugtfluen som model til at måle ploidy og dens genetiske regulering i epitelsår reparation.
Polyploidi er et hyppigt fænomen, hvis indvirkning på organisme sundhed og sygdom er stadig dårligt forstået. En celle defineres som polyploid, hvis den indeholder mere end den diploidkopi af dens kromosomer, hvilket er et resultat af endoreplet eller cellefusion. I væv reparation, sår-induceret polyploidization (WIP) har vist sig at være en bevaret helbredende strategi fra bananfluer til hvirveldyr. IGVA har flere fordele i forhold til celleprolifererende, herunder resistens over for onkogen vækst og genotoksisk stress. Udfordringen har været at identificere, hvorfor polyploide celler opstår, og hvordan disse unikke celler fungerer. Forudsat er en detaljeret protokol til undersøgelse af IGVA i voksent frugtfluepitel, hvor polyploide celler genereres inden for 2 dage efter et punkteringssår. Drage fordel af D. melanogaster omfattende genetiske værktøjskasse, de gener, der kræves for at indlede og regulere WIP, herunder Myc, er begyndt at blive identificeret. Fortsatte undersøgelser ved hjælp af denne metode kan afsløre, hvordan andre genetiske og fysiologiske variabler, herunder køn, kost, og alder regulere og påvirke WIP’s funktion.
Drosophila melanogaster er et attraktivt modelsystem til at studere de cellulære og molekylære mekanismer epitelsår reparation. Som hos pattedyr afhænger de anvendte vævsreparationsmekanismer af både vævet og dets udviklingsfase. Arløs sårheling sker i frugtflue embryo, hvor en actomyosin “pung streng” former på epitel forkant gør det muligt for såret atproblemfrit lukke 1,2. Post-embryonal sårheling i larver, pupper og voksne bananfluer resulterer i ekstracellulær matrix remodeling, melanin ardannelse og epitelcellevækst3,4,,5,6. Epitelcellerne stiger i størrelse efter cellefusion og endocytet, en ufuldstændig cellecyklus, der omgår mitose3,4,7,8. Som følge heraf kompenseres celletab af polyploid cellevækst i stedet for celledeling. Den voksne flyve hindgut, midgut, og follikulære epitel også stole på polyploid cellevækst for at kompensere for celletab eftervævsskader 9,10,11.
Polyploidi er et velkendt aspekt af organismeudvikling i planter og insekter, men i de sidste par år er det blevet mere tydeligt, at polyploidi er en bevaret væv reparation strategi i hvirveldyr12. Zebrafisk, som har kapacitet til at regenerere sit hjerte, er afhængig af polyploid cellevækst til at helbrede beskadiget epicardium13. Polyploidi bidrager også til leverregenerering af pattedyr og nyre tubulepitelepitel efter akut skade14,15. I disse eksempler genereres polyploide celler ved endorelikering via enten endocy- eller endomitose, hvilket resulterer i en binukleeret celle på grund af en blok i cytokinese12. Gåden er grunden til polyploide celler opstår under sårreparation, og hvordan polyploidi påvirker vævsfunktionen. Nylige undersøgelser har givet ny indsigt i spørgsmålet om, hvorvidt polyploidi giver en helbredende fordel eller ulempe. I zebrafisk epicardium, polyploidy forbedret hastigheden af sårheling13. I D. melanogaster hindgut og pattedyr lever, polyploidy blev anset for at være beskyttende mod onkogen vækst11,14. Hos voksne flyve epitel, Blev det for nylig konstateret, at polyploidi muliggør sår reparation i overværelse af genotoksisk stress16. Endorplication er resistent over for DNA-skader, så sårheling, når celleproliferation ellers ville blivekompromitteret 17. For kardiomyocytter i mus og zebrafisk hjerter, dog, polyploidy bremser healing, resulterer i øget ardannelse 18,19. Derfor, afhængigt af organ og / eller celletype, polyploidy kan være en gavnlig eller skadelig væv reparation strategi. Tilgængeligheden af D. melanogaster genetik kombineret med analyse af sår-induceret polyploidization (WIP) svar gør det til en ideel model system til at belyse de molekylære og cellulære mekanismer, der styrer denne sårheling strategi.
Her præsenterer vi en protokol til analyse af WIP i den voksne D. melanogaster epitel. Inkluderet er instruktioner til frugt flue skade, dissektion, immunstaining, montering, billeddannelse, og analyse af re-epitelisering, celle fusion, og endoreplication (ploidy). Billeddannelses- og ploidyanalysen kan også tilpasses andre modeller for at teste, om IGVA finder sted. Det skal bemærkes, at der med en stigning i det nukleare DNA-indhold ofte er en tilsvarende stigning i den nukleare størrelse. Der er imidlertid mange eksempler inden for biologi, hvor den nukleare størrelse ikke afspejler en tilsvarende ændring i ploidy20. Endnu mere forsigtighed bør tages, når man fortolker nukleare størrelse i forbindelse med et sår miljø, hvor cellerne ofte vil sprede sig eller strække til at dække sårstedet. Derfor er det eneste endelige bevis for ændring i ploidy at måle DNA-indhold ved denne metode (eller andre, såsom hele genom sekventering)21. Denne metode øger egnetheden af den voksne D. melanogaster abdominal epitel som en model til at studere den rolle og regulering af polyploidi i sårreparation.
Præsenteret er en detaljeret protokol om, hvordan man dissekere og bruge den voksne D. melanogaster abdominal epitel til at undersøge, hvordan gener regulere WIP ved at ændre re-epitelisering og endoreplication under sårreparation16. Ved hjælp af denne metode blev proto-oncogene Myc for nylig identificeret som en vigtig regulator af IGVA. Myc er nødvendig for epitelceller at endoreplicere post skade og er tilstrækkelig til quiescent epitelceller til endocycle både i voksne flyve epitel og tilbehør kirtler16,22. Det blev også konstateret, at skifte epitelceller til en mitotisk celle cyklus ved udtryk for stg, fzrRNAi er skadeligt for sår reparation. Fortsatte undersøgelser ved hjælp af denne metode vil identificere andre gener, der kræves for at regulere re-epitelisering og endoreplication under WIP, afslører både ligheder og forskelle til, hvordan polyploidy er reguleret og fungerer i en række forskellige væv.
Denne model og metode giver unikke fordele, herunder nem induktion af polyploidi med en mekanisk punktering og det faktum, at polyploide celler genereres inden fordag 4. Vævsdissektions- og præparatprotokollerne er baseret på larvedissektionsteknikker23, men den voksne flue maven er mere stiv og derfor let forstyrret. Som et resultat, denne protokol kræver praksis og præcision til at isolere en intakt væv til at studere WIP. Når dissekeret, men epitel er klart synlig og let afbildet, giver et øjebliksbillede af sårhelingsprocessen. Denne metode giver et væld af oplysninger om den voksne flyve epitel organisation, celle og syncytium størrelse, og ploidy af celler og individuelle kerner. Mens levende billeddannelse endnu ikke er muligt inden for den intakte frugtflue på grund af dens uigennemsigtige neglebånd, kan denne protokol tilpasses til at omfatte de nuværende tilgængelige ex vivo-dyringsbetingelser, der anvendes i D. melanogaster til at udføre kortvarige levende billeddannelsesundersøgelser24.
I fremtiden vil denne model være ideel til at studere celle-til-celle krydstale og andre celletypers bidrag til IGVA ved at regulere genekspression med Gal4/UAS-systemet i andre celletyper af interesse. Lignende spørgsmål kan også besvares ved hjælp af en række genetiske og mutant baggrunde. Den dissekerede voksne flyve maven indeholder en række celletyper, der let kan visualiseres ved hjælp af denne metode, herunder fedt krop og oenocytes, laterale muskelfibre, sensoriske neuroner, luftrør, og makrofag-lignende hæmocytter. Desuden vil denne model give forskerne mulighed for at undersøge, hvordan fysiologiske variabler påvirker WIP, herunder sex, kost, infektion, alder og miljømæssige stressfaktorer. Mens protokollen bruger den voksne kvindelige flyve på grund af sin større størrelse, WIP forekommer også i den mandlige frugtflue (Gjelsvik og Losick, ikke offentliggjort). Polyploide celler har vist sig at opstå under aldring og aldersrelaterede sygdom i pattedyrlever, hjerne, øje, og hjerte12. Frugtfluemodellen vil gøre det muligt for forskere at studere polyploidisering i fysiologiske og sygdomsmæssige sammenhænge, fordi menneskelige sygdomsrelaterede gener er stærkt bevaret.
The authors have nothing to disclose.
På Boston College, vil vi gerne takke Dr. Eric Folker for brug af hans lab kamera og stereoscope mikroskop setup til billedbehandling og Bret Judson på Boston College Imaging Core for infrastruktur og støtte. Vi vil også gerne takke flue samfund ressourcer: Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), Wien Drosophila Resource Center, og TRiP Center på Harvard Medical School (NIH / NIGMS R01-GM084947) for at give transgene bestande, der anvendes i denne undersøgelse. Musen FasIII antistof blev opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank støttet af NICHD af NIH og vedligeholdes på The University of Iowa, Institut for Biologi, Iowa City, IA. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award Nummer R35GM124691. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.
35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | For creating plates to dissect in |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparing staining reagents in |
AxioImager M2 with Apotome | Zeiss | NA | For imaging samples |
Blowgun mini | Genesee Scientific | 54-104M | For anethesizing D. melanogaster strains |
Bovine Serum Albumin, 30% | Sigma | A7284-500ML | For immuostaining |
Carbon dioxide tank | various distributors | N/A | For anethesizing D. melanogaster strains |
Click-iT EdU 594 Kit | Thermofisher | C10339 | For EdU assay |
Coverslips | Thermofisher | 3406 | For mounting |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | For immuostaining |
Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) | Ellsworth Adhesives | 184SIL | For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A21206 | For secondary immuostaining |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A10042 | For secondary immuostaining |
Drosophila tubing and fittings | Genesee Scientific | 59-124C, 59-123, 59-140 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | For dissecting |
epi-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793, b27392 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
Excel | Microsoft | For performing ploidy calculations | |
Fiji/ImageJ (image analysis software) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij | For image analysis |
Fly food | Archon Scientific | N/A | Corn Syrup/Soy food |
Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Glass dissecting dish | Fisher Scientific | 13-748B | For performing dissections in |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-518-104C | For mounting |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A11001 | For secondary immuostaining |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A11031 | For secondary immuostaining |
Grace's Insect Medium, unsupplemented | Thermofisher | 11595030 | For dissecting in |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | For wounding and pinning fly abdomens flat |
Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | For immunostaining epithelial cell-cell junctions |
Mouting media | Vector Laboratories | H-1000 | Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging |
Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing slides |
Ortibal shaker | Fisher Scientific | 02-217-988 | For immuostaining |
Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | For staining |
Pin holders | Fine Science Tools | 91606-07 | For wounding |
Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody | N/A | N/A | For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8) |
Rabbit anti-RFP Primary Antibody | MBL | PM005 | For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium |
Stereomicroscope | Olympus | SZ51 | For dissecting and mounting fly tissue |
Triton X-100 | Sigma | 10789704001 | For immuostaining |
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v108837, b6292 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v25550, b56562 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-Myc | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b9674 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-myc RNAi | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b36123 | Grendler et al. Development, 2019 |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | For dissecting |