Preparación de extractos de proteínas y co-inmunoprecipitación de Caenorhabditis elegans
Summary
Este método describe un protocolo para la preparación de extractos de proteína de alto rendimiento de caenorhabditis muestras de elegans y co-inmunoprecipitación posterior.
Abstract
Los métodos de inmunoprecipitación co-se utilizan con frecuencia para estudiar interacciones proteína-proteína. La confirmación de interacciones hipotizadas proteína-proteínas o la identificación de otras nuevas puede proporcionar información invaluable sobre la función de una proteína de interés. Algunos de los métodos tradicionales para la preparación de extractos con frecuencia requieren técnicas intensivas en mano de obra y que consumen mucho tiempo. Aquí, un protocolo de preparación de extractos modificados utilizando un homogeneizador de molino de cuentas y cuentas de metal se describe como una alternativa rápida a los métodos tradicionales de preparación de proteínas. Este método de preparación de extractos es compatible con estudios de co-inmunoprecipitación aguas abajo. Como ejemplo, el método se utilizó para co-inmunoprecipitar correctamente C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 y dos interactores conocidos alG-1: AIN-1 y HRPK-1. Este protocolo incluye descripciones de la recolección de muestras de animales, preparación de extractos, aclaración de extractos e inmunoprecipitación de proteínas. El protocolo descrito se puede adaptar para detectar interacciones entre dos o más proteínas C. elegans endógenas, etiquetadas endógenamente o sobreexpresadas en una variedad de orígenes genéticos.
Introduction
Identificar las interacciones macromoleculares de una proteína de interés puede ser clave para aprender más sobre su función. Los experimentos de inmunoprecipitación y co-inmunoprecipitación se pueden utilizar para identificar todo el interactoma de una proteína a través de enfoques proteómicos a gran escala1 o para probar específicamente la capacidad de una proteína para coprecipitar con un interactor hipotético. En C. elegans,ambos métodos se han empleado con éxito para aprender más sobre la actividad de una variedad de proteínas, incluidas las que funcionan estrechamente con microRNAs para regular la expresión génica2,3,4. Los experimentos de inmunoprecipitación co-tienen la ventaja de probar las interacciones proteína-proteína en su entorno celular nativo, pero la preparación de extractos puede ser desafiante y llevar mucho tiempo. Es necesaria una lisis eficiente de la muestra, pero se debe tener cuidado de minimizar la interrupción de las interacciones proteína-proteína. Métodos como la dotación5,sonicación6,homogeneización de Balch7,y zirconia cuentas-homogeneización8,9 se han utilizado para preparar con éxito C. elegans extractos de proteína total. Estos métodos, con la excepción de la homogeneización de cuentas zirconia, tienen limitaciones en términos del número de muestras que se pueden procesar simultáneamente. Presentado es un método alternativo que se puede escalar fácilmente para permitir la preparación de extractos proteicos rápidos de alto rendimiento a partir de muestras de C. elegans seguida de co-inmunoprecipitación. Específicamente, el método puede preparar hasta 24 muestras a la vez, reduciendo en gran medida el tiempo necesario para la preparación de extractos. Por el contrario, por ejemplo, el douncing normalmente permite una sola preparación de muestra a la vez. Este método de extracto se puede utilizar para preparar extractos de cualquier etapa de desarrollo de C. elegans.
Descrito es un procedimiento paso a paso para la recolección de muestras de animales, preparación de extractos, inmunoprecipitación y presentación de datos de distensión occidental para confirmar el cierre exitoso de proteínas y la detección de la proteína co-inmunoprecipitante de interés. Para demostrar la eficacia del protocolo, se realizaron dos experimentos de inmunoprecipitación compartida entre 1) microRNA Argonaute ALG-1 y AIN-1, un homolog GW182; y 2) ALG-1 y HRPK-1, un interactor ALG-1 recientemente identificado2. ALG-1 y AIN-1 son proteínas básicas que comprenden el complejo de silenciamiento inducido por microRNA (miRISC) y la interacción entre estas dos proteínas está bien establecida10,11. El protocolo de preparación de extractos fue eficaz en el experimento de coinprecipitación ALG-1-AIN-1. Este protocolo también confirmó con éxito la interacción entre ALG-1 y su interactor recién identificado, HRPK-12.
En resumen, el manuscrito describe un protocolo de preparación de extractos de C. elegans que se puede escalar hasta procesar simultáneamente 24 muestras junto con un protocolo de inmunoprecipitación que se puede utilizar para identificar interacciones nuevas o confirmar hipotestesizadas entre proteínas. El protocolo de preparación de extractos es compatible con una serie de experimentos posteriores, incluyendo inmunoprecipitación de proteínas2 y pulldowns de microRNA12. Además, el protocolo de inmunoprecipitación se puede adaptar para detectar interacciones entre dos o más proteínas C. elegans endógenas, etiquetadas endógenamente o sobreexpresadas en una variedad de orígenes genéticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans es un excelente modelo para estudiar cuestiones fundamentales en biología celular, molecular y de desarrollo19. Además de su poder como sistema de modelos genéticos, C. elegans es apto para enfoques bioquímicos, incluyendo, pero no limitado a, inmunoprecipitación de proteínas y co-inmunoprecipitación. Un obstáculo potencial a la hora de llevar a cabo experimentos de inmunoprecipitación es la falta de anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Si no hay anticuerpo disponible, se pueden generar anticuerpos policlonales o monoclonales personalizados. Sin embargo, las innovaciones recientes en la tecnología de edición del genoma han permitido a los investigadores introducir rápidamente mutaciones o etiquetar genes C. elegans endógenos 20,21, facilitando estudios que desentrañan las interacciones genéticas, funcionales y físicas entre los genes y las proteínas codificadas. En concreto, el etiquetado mediado por CRISPR/Cas9 de los genes C. elegans en el loci endógeno ha reducido la dependencia de los experimentos de inmunoprecipitación en la disponibilidad de anticuerpos, haciendo que los experimentos de inmunoprecipitación sean mucho más factibles. Los genes C. elegans se pueden etiquetar con una variedad de etiquetas que van desde etiquetas fluorescentes como GFP o mCherry hasta pequeñas etiquetas como FLAG y HA. Los anticuerpos que reconocen estas etiquetas están disponibles comercialmente, facilitando los estudios de interacciones proteína-proteína a través de enfoques de inmunoprecipitación.
El protocolo presentado, descrito en la Figura 1,se puede realizar para un pequeño número de muestras o escalar verticalmente, lo que permite hasta 24 preparaciones de muestras a la vez. Mientras que las caracterizaciones iniciales de las interacciones proteína-proteína a través de la inmunoprecipitación se realizan típicamente en fondos de tipo salvaje en condiciones normales de cultivo, los estudios de seguimiento con frecuencia requieren probar las interacciones proteína-proteína en una variedad de orígenes genéticos o en diferentes condiciones de crecimiento. La capacidad de preparar simultáneamente múltiples extractos ahorra tiempo y, lo que es más importante, asegura la consistencia de preparación de extractos entre las diferentes muestras. Siempre se requiere un control negativo, siendo el control ideal una mutación nula en la codificación genética de la proteína inmunoprecipitada de interés (Ver Figura 3 y Figura 4 como ejemplos).
Este protocolo de extracto permite la preparación rápida de extractos de proteínas de muestras de C. elegans y es comparable a la homogeneización basada en abalorios de circonio8. La homogeneización de cuentas en general se puede escalar hasta múltiples preparaciones simultáneas de muestras utilizando una variedad de homogeneizadores de molinos de cuentas o equipos similares. Sin embargo, algunos homogeneizadores de molinos de cuentas más económicos pueden reducir el número de muestras que se pueden procesar simultáneamente. Alternativamente, el protocolo de extracto presentado es compatible con la preparación de extractos a base de dounce, que representa una alternativa económica. Mientras que diferentes homogeneizadores de molino de cuentas no fueron probados, la mayoría es probable que sean compatibles con este protocolo de extracto de proteínas, siempre y cuando se logre la interrupción completa de las muestras de C. elegans.
Como se presenta, este protocolo de preparación de extractos es compatible con múltiples experimentos posteriores, incluyendo inmunoprecipitación de proteínas2 y microRNA pull-down12 y permite la recolección aguas abajo de componentes de proteínas y ARN. También extrae eficientemente proteínas nucleares y citoplasmáticas(Figura 2, Figura 3y Figura 4). Del mismo modo, el protocolo de inmunoprecipitación presentado permite el aislamiento del ARN de los inmunoprecipitatos asociados a proteínas. Mientras que el protocolo de inmunoprecipitación fue desarrollado originalmente para identificar interactores proteicos ALG-1, el método se puede adaptar para probar las interacciones entre cualquier proteína de interés. De hecho, las condiciones de inmunoprecipitación utilizadas funcionaron igualmente bien para la inmunoprecipitación de ALG-1 (Figura 3) y HRPK-1 (Figura 4). Este protocolo es un excelente punto de partida para la inmunoproficación de proteínas que unen ARN. Sin embargo, cabe señalar que algunos cambios en la composición del buffer pueden ser necesarios para otras proteínas de interés. Los cambios pueden depender de las propiedades físicas y bioquímicas de la proteína de interés y deben implementarse caso por caso.
Una vez que la proteína objetivo (aquí, ALG-1 o HRPK-1) está inmunoprecipitada, la hinchazón occidental se puede utilizar para probar el co-inmunoprecipitado para interactores proteicos específicos.
Alternativamente, el inmunoprecipitato copurificado puede someterse a análisis de espectrometría de masas para identificar todas las proteínas que interactúan con el putativo. Las interacciones confirmadas de inmunoprecipitación conjunta pueden examinarse en una variedad de antecedentes genéticos o condiciones para identificar la regulación potencial de la interacción específica. Por ejemplo, para determinar si hrpk-1 desempeña un papel en el ensamblado MIRISC ALG-1/AIN-1, se evaluó la coprecipitación ALG-1-AIN-1 tanto en un fondo de tipo salvaje como en ausencia de HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 se encontró que era prescindible para la interacción ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Además, la tecnología de edición del genoma CRISPR/Cas9 se puede emplear para generar mutaciones de eliminación de un solo punto o dominio en las proteínas de interés. Volver a probar la capacidad de los mutantes generados para coprecipitar con sus interactores proteicos puede revelar qué dominios o residuos median en la interacción física. Estos estudios futuros pueden producir información inestimable sobre el mecanismo de función y regulación de las proteínas. Estos enfoques, combinados con el poder de la genética C. elegans, pueden proporcionar información importante sobre los procesos moleculares fundamentales que rigen el desarrollo animal y la función celular.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por Kansas INBRE, P20GM103418 a Li y Zinovyeva y R35GM124828 a Zinovyeva. Agradecemos a Min Han por compartir generosamente el anticuerpo anti-AIN-1. Algunas de las cepas utilizadas en el transcurso de este trabajo fueron proporcionadas por el Centro de Genética caenorhabditis (CGC), financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
Referências
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