Summary

En småskalig inställning för Algtoxicitet testning av nanomaterial och andra svåra ämnen

Published: October 10, 2020
doi:

Summary

Vi demonstrerar algtoxicitetstestning för svåra ämnen (t.ex. färgade ämnen eller nanomaterial) med hjälp av en uppställning upplyst vertikalt med en LED.

Abstract

Ekotoxicitetsuppgifter är ett krav för förhands- och eftermarknadsregistrering av kemikalier genom europeiska och internationella bestämmelser (t.ex. Reach). Testet av algtoxicitet används ofta vid lagstiftningsriskbedömning av kemikalier. För att uppnå hög tillförlitlighet och reproducerbarhet utvecklingen av standardiserade riktlinjer är avgörande. För testning av algtoxicitet kräver riktlinjerna stabila och enhetliga förhållanden för parametrar som pH, temperatur, koldioxidnivåer och ljusintensitet. Nanomaterial och andra så kallade svåra ämnen kan störa ljus som orsakar en stor variation i erhållna resultat som hämmar deras regelacceptans. För att ta itu med dessa utmaningar har vi utvecklat LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). Uppställningen utnyttjar LED-belysningen underifrån som möjliggör en homogen ljusfördelning och temperaturkontroll samtidigt som den minimerar skuggning med hjälp av intraprov. Uppställningen optimerar provvolymen för biomassakvantifiering och säkerställer samtidigt ett tillräckligt inflöde av CO2 för att stödja exponentiell tillväxt av algerna. Dessutom kan materialet i testbehållarna skräddarsys för att minimera adsorption och tidspressning. Vid testning av färgade ämnen eller partikelupphängningar möjliggör användningen av LED-lampor också för att öka ljusintensiteten utan ytterligare värmegenerering. Den kompakta konstruktionen och de minimala utrustningskraven ökar möjligheterna för implementering av LEVITATT i ett brett spektrum av laboratorier. Medan de var förenliga med standardiserade ISO- och OECD-riktlinjer för testning av algtoxicitet, visade LEVITATT också en lägre interprovvariabilitet för två referensämnen (3,5-Dicholorofenol och K2Cr2O7) och tre nanomaterial (ZnO, CeO2, och BaSO4) jämfört med Erlenmeyerkolvar och mikrotiterplattor.

Introduction

Testet av algtoxicitet är ett av endast tre obligatoriska tester som används för att generera de ekotoxicitetsdata som krävs för registrering av kemikalier före och efter marknaden genom europeiska och internationella bestämmelser (t.ex. Reach1 och TSCA (USA)). För detta ändamål har standardiserade riktlinjer för algtest tagits fram av internationella organisationer (t.ex. ISO och OECD). Dessa teststandarder och riktlinjer föreskriver idealiska testförhållanden vad gäller pH, temperatur, koldioxidnivåer och ljusintensitet. Att upprätthålla stabila testförhållanden under algtestning är dock i praktiken svårt och resultaten lider av problem med reproducerbarhet och tillförlitlighet för en rad kemiska ämnen och nanomaterial (ofta kallade “svåra ämnen”)2. De flesta av de befintliga uppställningarna för testning av algtoxicitet fungerar med relativt stora volymer (100–250 mL) som ligger på en orbitalskaktör inuti en inkubator. En sådan inställning begränsar antalet testkoncentrationer och replikat uppnåeliga och höga volymer algodling och testmaterial. Dessutom har dessa uppställningar sällan ett enhetligt ljusfält och tillförlitliga ljusförhållanden är dessutom svåra att få tag i i stora kolvar, dels som ljusintensiteten minskar exponentiellt ju längre ljuset färdas och delvis på grund av kolvens geometri. Alternativa uppställningar omfattar mikrotiterav plast 3 plattor som innehåller små provvolymer som inte möjliggör tillräckliga provtagningsvolymer för att mäta pH, ytterligare biomassamätningar, pigmentutdragning eller andra analyser som kräver destruktiv provtagning. En särskild utmaning med hjälp av befintliga uppställningar för algtoxicitet testning av nanomaterial och ämnen som bildar färgade suspensioner är störningar eller blockering av ljuset tillgängliga för algcellerna, ofta kallad “skuggning”4,5. Skuggning kan ske inom injektionsflaska genom testmaterialet och/eller interaktioner mellan testmaterialet och algcellerna, eller skuggning kan förekomma mellan injektionsflaska, på grund av deras positionering i förhållande till varandra och ljuskällan.

Metoden bygger på den småskaliga algtoxicitetstestinställningen som införts av Arensberg et al.6 och som möjliggör provning i överensstämmelse med standarder som OECD 2017, och ISO 86928. Metoden är ytterligare optimerad för att ta itu med de begränsningar som anges ovan genom att: 1) utnyttja LED-ljustekniken för att säkerställa enhetliga ljusförhållanden med minimal värmeutveckling, 2) som ger tillräcklig provvolym för kemisk/biologisk analys med bibehållen konstant pH, CO2-nivåer, och 3) som möjliggör användning av mångsidigt testbehållarematerial för testning av flyktiga ämnen eller ämnen med en hög sorptionspotential.

Protocol

1. Beskrivning av LEVITATT-uppställningen Använd 20 mL scintillation glasflaskor (Figur 1, infoga 1) tillåter ljusgenomföring. Alternativt kan lätta peneerbara plastflaskor användas. Kvantifiera ljusintensiteten med hjälp av en fotometer. Använd minst en 4 mL testfjädring i början av testet för att möjliggöra kvantifiering av biomassa och för karakterisering/kvantifiering av nanomaterial under och efter inkubation (figur 1, skä…

Representative Results

Ett inledande test med referensämne utförs för att bestämma algstammens känslighet. Referensämnen som regelbundet används för R. subkapitalitata är kaliumdikromat och 3,5-Dichlorphenol7,8. Figur 3 och tabell 2 visar ett representativt resultat av ett algtest inklusive kurvpassning och statistiska utdata när Drc-paketet i R tillämpas på tillväxthastigheterna. <p class="jove_content" fo:keep-t…

Discussion

Växtplankton omvandlar solenergi och koldioxid till organiskt material och har därmed en central roll i det akvatiska ekosystemet. Av denna anledning ingår hämningstester av algtillväxthastighet som ett av tre obligatoriska akvatiska toxicitetstester som krävs för en regulatorisk riskbedömning av kemikalier. Förmågan att utföra en tillförlitlig och reproducerbara algtoxicitet test är nyckeln i detta avseende. Testuppställningar med hjälp av Erlenmeyerkolvar introducerar en rad variabilities och olägenhete…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning finansierades av PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 under Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogram.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich V179124
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134
BlueCap bottles (1L) Buch & Holm A/S  9072335
Boric acid Sigma-Aldrich B0394
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 208290
Clear acrylic sheet (40×40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 255599
Copper(II) chloride dihydrate Sigma-Aldrich 307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich  E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000 Hitachi
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 236489
LED light source Helmholt Elektronik A/S H35161 Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 221279
Orbital shaker IKA 2980200
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662
Raphidocelis subcapitata NORCCA NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL) Fisherscientific 11526325
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413
Sodium molybdate dihydrate Sigma-Aldrich 331058 
Spring clamp Frederiksen Scientific A/S 472002
Thermostatic cabinet VWR WTWA208450 Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm) Silvan 22605630165
Volumetric flasks (25 mL) DWK Life Sciences 246781455
Zinc chloride Sigma-Aldrich 208086

Referências

  1. European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , (2016).
  2. Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
  3. Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
  4. Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
  5. Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
  6. Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
  7. Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
  8. International Organization for Standardization (ISO). Water Quality – Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
  9. Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
  10. Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
  11. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
  12. Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
  13. Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals – toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
  14. Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
  15. Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O’Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
  16. Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum–capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
  17. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
  18. Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
  19. Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
  20. Neale, P. A., Jaemting, A. K., O’Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
  21. Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
  22. Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
  23. Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
  24. Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
check_url/pt/61209?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Skjolding, L. M., Kruse, S., Sørensen, S. N., Hjorth, R., Baun, A. A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances. J. Vis. Exp. (164), e61209, doi:10.3791/61209 (2020).

View Video