Vi demonstrerar algtoxicitetstestning för svåra ämnen (t.ex. färgade ämnen eller nanomaterial) med hjälp av en uppställning upplyst vertikalt med en LED.
Ekotoxicitetsuppgifter är ett krav för förhands- och eftermarknadsregistrering av kemikalier genom europeiska och internationella bestämmelser (t.ex. Reach). Testet av algtoxicitet används ofta vid lagstiftningsriskbedömning av kemikalier. För att uppnå hög tillförlitlighet och reproducerbarhet utvecklingen av standardiserade riktlinjer är avgörande. För testning av algtoxicitet kräver riktlinjerna stabila och enhetliga förhållanden för parametrar som pH, temperatur, koldioxidnivåer och ljusintensitet. Nanomaterial och andra så kallade svåra ämnen kan störa ljus som orsakar en stor variation i erhållna resultat som hämmar deras regelacceptans. För att ta itu med dessa utmaningar har vi utvecklat LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). Uppställningen utnyttjar LED-belysningen underifrån som möjliggör en homogen ljusfördelning och temperaturkontroll samtidigt som den minimerar skuggning med hjälp av intraprov. Uppställningen optimerar provvolymen för biomassakvantifiering och säkerställer samtidigt ett tillräckligt inflöde av CO2 för att stödja exponentiell tillväxt av algerna. Dessutom kan materialet i testbehållarna skräddarsys för att minimera adsorption och tidspressning. Vid testning av färgade ämnen eller partikelupphängningar möjliggör användningen av LED-lampor också för att öka ljusintensiteten utan ytterligare värmegenerering. Den kompakta konstruktionen och de minimala utrustningskraven ökar möjligheterna för implementering av LEVITATT i ett brett spektrum av laboratorier. Medan de var förenliga med standardiserade ISO- och OECD-riktlinjer för testning av algtoxicitet, visade LEVITATT också en lägre interprovvariabilitet för två referensämnen (3,5-Dicholorofenol och K2Cr2O7) och tre nanomaterial (ZnO, CeO2, och BaSO4) jämfört med Erlenmeyerkolvar och mikrotiterplattor.
Testet av algtoxicitet är ett av endast tre obligatoriska tester som används för att generera de ekotoxicitetsdata som krävs för registrering av kemikalier före och efter marknaden genom europeiska och internationella bestämmelser (t.ex. Reach1 och TSCA (USA)). För detta ändamål har standardiserade riktlinjer för algtest tagits fram av internationella organisationer (t.ex. ISO och OECD). Dessa teststandarder och riktlinjer föreskriver idealiska testförhållanden vad gäller pH, temperatur, koldioxidnivåer och ljusintensitet. Att upprätthålla stabila testförhållanden under algtestning är dock i praktiken svårt och resultaten lider av problem med reproducerbarhet och tillförlitlighet för en rad kemiska ämnen och nanomaterial (ofta kallade “svåra ämnen”)2. De flesta av de befintliga uppställningarna för testning av algtoxicitet fungerar med relativt stora volymer (100–250 mL) som ligger på en orbitalskaktör inuti en inkubator. En sådan inställning begränsar antalet testkoncentrationer och replikat uppnåeliga och höga volymer algodling och testmaterial. Dessutom har dessa uppställningar sällan ett enhetligt ljusfält och tillförlitliga ljusförhållanden är dessutom svåra att få tag i i stora kolvar, dels som ljusintensiteten minskar exponentiellt ju längre ljuset färdas och delvis på grund av kolvens geometri. Alternativa uppställningar omfattar mikrotiterav plast 3 plattor som innehåller små provvolymer som inte möjliggör tillräckliga provtagningsvolymer för att mäta pH, ytterligare biomassamätningar, pigmentutdragning eller andra analyser som kräver destruktiv provtagning. En särskild utmaning med hjälp av befintliga uppställningar för algtoxicitet testning av nanomaterial och ämnen som bildar färgade suspensioner är störningar eller blockering av ljuset tillgängliga för algcellerna, ofta kallad “skuggning”4,5. Skuggning kan ske inom injektionsflaska genom testmaterialet och/eller interaktioner mellan testmaterialet och algcellerna, eller skuggning kan förekomma mellan injektionsflaska, på grund av deras positionering i förhållande till varandra och ljuskällan.
Metoden bygger på den småskaliga algtoxicitetstestinställningen som införts av Arensberg et al.6 och som möjliggör provning i överensstämmelse med standarder som OECD 2017, och ISO 86928. Metoden är ytterligare optimerad för att ta itu med de begränsningar som anges ovan genom att: 1) utnyttja LED-ljustekniken för att säkerställa enhetliga ljusförhållanden med minimal värmeutveckling, 2) som ger tillräcklig provvolym för kemisk/biologisk analys med bibehållen konstant pH, CO2-nivåer, och 3) som möjliggör användning av mångsidigt testbehållarematerial för testning av flyktiga ämnen eller ämnen med en hög sorptionspotential.
Växtplankton omvandlar solenergi och koldioxid till organiskt material och har därmed en central roll i det akvatiska ekosystemet. Av denna anledning ingår hämningstester av algtillväxthastighet som ett av tre obligatoriska akvatiska toxicitetstester som krävs för en regulatorisk riskbedömning av kemikalier. Förmågan att utföra en tillförlitlig och reproducerbara algtoxicitet test är nyckeln i detta avseende. Testuppställningar med hjälp av Erlenmeyerkolvar introducerar en rad variabilities och olägenhete…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning finansierades av PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 under Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogram.
Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |