Avancerade 3D-levermodeller för in vitro-genotoxicitytestning efter långvarig nanomaterialexponering

1.Odling av kryopreserverade HepG2-celler OBS: HepG2 celler, erhållna från American Type Culture Collection (ATCC) odlades i 1x Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 4,5 g/L D-glukos och L-glutamin kompletterat med 10% fostervint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin antibiotikum. Förvärmt DMEM-cellkulturmedium (inklusive kosttillskott) i ett 37 °C vattenbad i 30 min. Ta bort en flaska HepG2-celler från flytande kväve och tina i ett 37 °C vattenbad i 2-3 minuter, samtidigt som injektionsflaskan försiktigt virvlas bort för att möjliggöra enhetlig upptining av cellupphängningen. Var försiktig så att injektionsflaskan inte sänks ned ovanför O-ringen för att minska risken för kontaminering. När injektionsflaskan har tinats upp, ta bort injektionsflaskan från vattenbadet och spraya generöst med 70% etanol för att sanera injektionsflaskans yttre yta innan du placerar under en steril laminär vävnadskulturhuv av klass II. Pipett innehållet i kryovialen av HepG2-celler i ett centrifugrör som innehåller 9 ml förvärmt DMEM-cellkulturmedium (med kosttillskott). Använd en 10 ml strippette, överför 10 ml av cellfjädringen till en 25 cm2 engångscellkulturkolv och inkuberar kulturen i 3 dagar (från sådd) vid 5% CO2 och 37 °C tills ~80% konfluens uppnås innan den genomgår underkultur till en större 75 cm2 engångscellskulturkolv. När 80% confluency uppnås, subkulturceller under sterila förhållanden genom trypsinisering med 0,05% trypsin/ EDTA-lösning förvärmd i ett 37 °C vattenbad i 30 min. Cellerna får inte vid något tillfälle torka ut. När celler bildar ett vidhäftande monoskikt, ta bort mediet genom att tippa in i en desinfektionsavfallspott. Tvätta sedan omedelbart monoskiktet för att avlägsna alla spår av befintligt medium genom att skölja kolven två gånger med 3 ml steril 1x PBS-lösning som hålls vid rumstemperatur. Kassera också PBS i desinfektionsavfallsgrytan. När PBS-tvätten har tagits bort, tillsätt 5 ml förvärmd 0,05% trypsin-EDTA-lösning, se till att täcka hela cellytan och inkubera celler i 6-8 min vid 37 °C och 5% CO2. Knacka försiktigt på kolven för att lossa cellerna från kolvens botten och tillsätt sedan 5 ml DMEM-cellkulturmedium (med kosttillskott) för att neutralisera trypsinenzymet. Överför cellfjädringen till ett 50 ml centrifugeringsrör och pipett cellupphängningen upp och ner noggrant för att säkerställa att cellerna är helt disassocierade. Centrifugera den utspädda cellupphängningen vid 230 x g i 5 min. Kassera supernatanten i desinfektionsmedel och suspendera cellpellets i 25mL DMEM-cellkulturmedium (med kosttillskott). Överför cellupphängningen till en 75 cm2 engångscellskulturkolv och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i ytterligare 3 dagar innan den genomgår sfäroidpreparat. När HepG2s har haft tid att acklimatisera sig och återigen nå ~ 80% confluency, bestämma cellkoncentrationen som förberedelse för sfäroid sådd. 2. HepG2 sfäroid förberedelse Upprepa de steg för underkulturen som anges ovan, utom efter centrifugation, suspendera cellpelleten igen i 1 ml DMEM-odlingsmedium som förvärmts i ett vattenbad på 37 °C. Pipettcellsupphängning upp och ner noggrant. Poängcellens livskraft med trypan blue exclusion assay (se OSHA SOP 3.21 Reproduktiva toxiner, mutagener, teratogener och embryotoxiner – Procedurer för säker hantering och lagring (2019) för hälso- och säkerhetsvägledning)14 med ett 1:1-förhållande mellan cellfjädring och förfiltrerad 0,4% trypanblå lösning. Innan cellräkningen, ta 1 ml trypanblå lösning med en 1 ml spruta och filtrera med en filterenhet på 0,45 μm i ett sterilt 1 ml-rör. Överför 10 μL filtrerad trypanblå lösning till ett 0,2 ml-rör och tillsätt 10 μL cellfjädring. Återstående filtrerad trypanblå lösning kan lagras upp till 3 månader vid rumstemperatur för framtida användning. Spraya haemocytometern noggrant med 70% etanol och torka torrt med en steril pappershandduk innan du säkrar täcket på toppen med andningsånga. Att skjuta täcket över den fuktade ytan inducerar sammanhållna krafter genom att generera Newton-ringar. Pipetten trypanblå cellens fjädring upp och ner med en 1000 μL-pipett (för att minska ren stress) innan du lägger till 10 μL till haemocytometern. Se till att lösningen är spridd under täckspingen och täcker hela gallret utan luftbubblor. Figur 1: Räkna celler med hjälp av en haemocytometer. Diagrammatisk representation av en haemocytometer som belyser vilken kvadrant man ska räkna celler från. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Under mikroskopet, räkna de levande (osedda) och döda (färgade blå) cellerna som finns i de fyra stora hörnrutorna (figur 1). Exkludera celler som befunnits överlappa eller sitta på de inre två kanterna på de stora hörnrutorna (dvs. på linjerna) i räkningen. Beräkna det genomsnittliga antalet levande, livskraftiga celler (obeklivade) som finns i provet med hjälp av följande beräkning:Totalt antal celler/ml = Antal levande celler x x 10 000där utspädning avser hur många gånger stamlösningen späddes ut i trypanblått (2x i detta fall) och # antal räknade rutor avser de fyra stora hörnrutorna på den haemocytometer som räknas Baserat på det livskraftiga antalet HepG2-celler och med hjälp av följande formel:C1V1=C2V2där C1 = koncentrationen av livskraftiga celler för närvarande.V1 = volymen av cellfjädring för närvarande,C2 = koncentrationen av cellsuspension önskas,V2 = volymen av cellfjädring önskas Förbered en 10 ml stamlösning av HepG2-cellupphängning med DMEM-cellkulturmedium vid en koncentration av 2,0 x 105 celler/ml för att uppnå 4000 HepG2-celler per 20 μL hängande droppe. Blanda cellfjädringen noggrant genom att försiktigt leda upp och ner med en 1000 μL-pipett för att säkerställa att alla celler är helt upphängda i mediet. Till brunnarna på en 96-brunns cellkulturplatta, tillsätt 100 μL steril, rumstemperatur PBS för att förhindra att de hängande dropparna torkar ut under inkubation. Ta locket på en vanlig platt botten 96-brunns cellkulturplatta, vänd den och försiktigt pipett 20 μL droppar cellfjädring i mitten av varje brunnsspår på locket, som visas i figur 2. Använd en flerkanalspipett men tillsätt endast 2 – 4 droppar samtidigt eftersom flera sådd kan påverka droppens noggrannhet och placering. Centrera dropparna i spåren på brunnarna som läggs ut på locket; Annars kommer de inte att hänga i mitten av brunnarna när locket på plattan vänds och riskerar att falla av i plattan. Vänd försiktigt locket på 96-brunnsplattan, så dropparna hänger nu och placera försiktigt ovanpå 96-brunnsplattan. Placera hela 96 brunnsplattan försiktigt med lock i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 i 3 dagar före sfäroidöverföring till agarosa.OBS: Extra försiktighet måste vidtas inte bara vid transport av plattorna till/från inkubatorerna, utan när inkubatorn öppnas och stängs i allmänhet eftersom överdriven rörelse kan leda till att plattorna skiftar och sfäroiderna antingen faller eller bildas felaktigt. Bild 2: 3D HepG2 in vitro-sfäroidmodellberedning. (A) HepG2-cellerna som sås i 20 μL droppar på locket på en 96-brunnsplatta. B)HepG2-cellerna efter sådd i hängande droppmodell för att möjliggöra sfäroidbildning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. 3. HepG2 sfäroid överföring från hängande droppe till agarose suspension OBS: På dag 3 efter sådd i hängande droppar överförs sfäroiderna till brunnarna på samma 96-brunnsplatta som alla tidigare har belagts med ett fint lager av 1,5% agarose gel. Förbered agarosageler och autoklav (dvs. dag 2 efter sådd) före dagen för plåtbeläggning (dvs. dag 3 efter sådd). För att förbereda en 1,5% agarose gel, väg 0,30 g agarose i en ren glasflaska och tillsätt sedan 20 ml fenolrött DMEM-medium. Autoklav agarosen i 1 timme vid 230 °C för sterilisering. Agarose beläggningen förhindrar HepG2 sfäroider från att följa basen av brunnar och bilda en cellulär monolayer istället för att behålla sin 3D sfäroid struktur. På dag 3 efter sådd, ta bort 96-brunnsplattan som innehåller HepG2 hängande droppe sfäroider ur inkubatorn och vänd försiktigt locket så att sfäroiderna inte längre hänger. Använd en flerkanalspipett och ta bort de 100 μL PBS som tidigare lagts till basen på 96-brunnsplattan. Låt plattorna luftas i 2-3 minuter medan du värmer agarosen som förberedelse för beläggning.VARNING: Detta förfarande resulterar i mycket varm, flytande agarose som, om den spills på huden, kan brinna och orsaka skada. Dessutom måste försiktighet vidtas vid hantering av glasflaskan som innehåller den flytande agarosen eftersom även denna kan vara mycket varm. Använd de 1,5% agarose geler som tidigare förberetts, värm glasflaskan som innehåller 20 mL agarose gel för 30 s i en mikrovågsugn vid maximal watt (dvs. 900 W). För att täcka två 96-brunnsplattor bör en 20 ml flaska förberedda 1,5% agarose gel vara tillräcklig. När den har smält, snurra försiktigt agarosen genom att rotera glasflaskan för att ta bort eventuella bubblor och tillsätt sedan 50 μL agarose i basen av varje brunn.OBS: När du lägger till agarose, se till att inte vinkla plattan >45° eftersom agarosen sätter snabbt och inte bildar ett platt, jämnt lager som kan störa sfäroidtillväxten. Det är viktigt att arbeta effektivt i detta skede för att förhindra att agarosen stelnar innan plattan är helt belagd. Låt plattan stå i 2 minuter vid rumstemperatur innan du lägger till 100 μL förvärmt DMEM-cellkulturmedium (med kosttillskott) ovanpå det fasta agarosaskiktet i varje brunn. Vänd på locket på 96-brunnsplattan och placera tillbaka ovanpå 96-brunnsplattan så att sfäroiderna nu hänger igen. Centrifugera plattan i 3 min vid 200 x g för att överföra sfäroiderna från den hängande droppen till de enskilda brunnarna på 96-brunnsplattan. Efter överföringen bör HepG2-sfäroiderna nu suspenderas i cellkulturmediet. Låt dem nöja sig med 24 timmar i inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2. Exponera HepG2-sfäroider av denna storlek för antingen kemiska eller ENM-behandlingar på dag 4 efter sådd (dvs. 24 timmar efter överföring till agarosabelagda plattor). För att bibehålla cellens livskraft under längre odlingsperioder, uppdatera cellkulturmediet var tredje dag. För att göra detta, aspirera försiktigt 50 μL av cellkulturmediet från brunnens yta och ersätt med en frisk 50 μL DMEM-cellkulturmedium. Var försiktig så att du inte tar bort eller stör sfäroiden när du utför en medelstor förändring. 4. Nanomaterial/kemisk exponering OBS: HepG2 lever sfäroid modell kan stödja både ENM och kemiskt baserade exponering regimer, men det primära fokuset för detta protokoll är ENM exponeringar. Före exponeringen skall testet ENM vara lämpligt spridda. Detta kan utföras enligt nanogenotoxspridningsprotokollet (bidragsavtal nr 20092101, 2018)15. Efter spridning enligt NanoGenoTox Dispersion Protocol, späd enm suspension från startkoncentrationen av 2,56 mg/mL till den slutliga önskade koncentrationen i förvärmda DMEM cell kultur medium (inklusive kosttillskott). En total volym på 5 ml krävs för att dosera en 96 brunnsplatta. För att utsätta HepG2-sfäroiden för antingen en kemikalie eller ENM, med hjälp av en 200 μL-pipett, aspirera 50 μL cellkulturmedium från ytan av varje brunn (lämna 50 μL i brunnen för att inte störa sfäroiderna) och ersätta med 50 μL medium som innehåller testtoxiska medel vid önskad dos. När testmaterialet har applicerats, inkubera plattorna under önskad exponeringstid vid 37 °C och 5 % CO2. Om ett långsiktigt (≥24 h) exponeringssystem utförs, skörda sfäroiderna för mikrokärnors endpointanalys omedelbart efter det att den önskade exponeringstiden har gått ut, enligt beskrivningen nedan i steg 6.1– 6.4. Med akuta exponeringssystem (t.ex. ≤24 h) skördar, poolar och lagrar 50 μL supernatant från varje brunn i 96 brunnsplattan vid -80 °C för ytterligare biokemisk analys senare. Ersätt cellkulturmediet med 50 μL färskt medium som innehåller 6 μg/ml Cytochalasin B och låt inkubera i 1 – 1,5 cellcykler (dvs. 24 – 26 h för HepG2) som förberedelse för cytokinesblockets mikronukleustestskörd.OBS: För akuta (≤24 h) exponeringsregimer kan cytokinesblockets mikrokärnaanalys med Cytochalasin B tillämpas, men för långsiktiga (≥24 h) exponeringsregimer måste den mononukleära versionen (utan Cytochalasin B) av analysen användas enligt beskrivningen nedan i figur 4. 5. HepG2 sfäroid skörd OBS: Efter antingen kemiska eller ENM-exponeringsbehandlingar kan både cellkulturell medium eller sfäroidvävnad skördas för analys av flera effektmått. Beroende på slutpunktsanalysen kan sfäroider antingen skördas individuellt (t.ex. för bildanalys) eller poolas tillsammans (t.ex. för cytokinesblock micronucleus-analys). Ta bort 96-brunnsplattan från inkubatorn. Använd en 200 μL-pipett, aspirera 100 μL cellkulturmedium inklusive sfäroidvävnaden från varje brunn och samla i ett sterilt 15 ml centrifugerör. Var noga med att undvika kontakt med agarosen. När centrifugera sfäroidupphängningen vid 230 x g i 5 min. Ta bort supernaten och förvara vid -80 °C för ytterligare endpointanalys (t.ex. leverfunktionstester) senare. Suspendera pelleten av sfäroider i 1 ml steril, rumstemperatur PBS (1x). När den har tvättats, centrifugera sfäroidupphängningen igen vid 230 x g i 3 min. Kassera supernatanten, suspendera igen i 500 μL 0,05% trypsin-EDTA-lösning och inkubera i 6-8 min vid 37 °C och 5% CO2. Efter inkubation, försiktigt pipettera de trypsiniserade cellerna upp och ner för att helt avassociera och suspendera HepG2-cellerna innan de neutraliseras med 1 ml DMEM-cellkulturmedium. Centrifugera den utspädda cellupphängningen vid 230 x g i 5 min. Kassera supernatanten i desinfektionsmedel och suspendera cellpellet i 2mL rumstemperatur PBS (1x). Centrifugera cellupphängningen vid 230 x g i 5 min. Kassera supernatmedlet i desinfektionsmedel och suspendera sedan cellpelleten igen i 2 ml kall PBS (1x). Se till att cellerna är väl spridda för att förhindra att klumpar av celler skymtar synfältet när de monteras på mikroskopbilder. 6. Mikrokärnaanalys och poängsättning För den manuella metoden för mikrokärnaanalysen krävs en cytocentrifuge för att producera en cytodot (en definierad, koncentrerad cellregion) i mitten av mikroskopbilden. Denna process stöder effektivare poängsättning av bilden eftersom det gör det möjligt för målskytten att enkelt hitta de celler av intresse, i motsats till att utvärdera en hel bild där cellerna kan spridas i stor utsträckning. Doppa frostade mikroskopr (tre per dos) i 70% etanol följt av ddH2O och låt lufttorka i 5 min. Placera förberedda mikroskopglas i cuvettetratt enligt figur 3A, där glasglaset (iii) placeras i metallstödet (iv) med ett filterkort (ii) och cuvettetratt (i) fastsatt ovanpå. Ordna cuvettetrattar i cytocentrifugen med tratten uppåt, så att 100 μL cellfjädring kan tillsättas direkt i var och en. Cytospin i 5 min vid 500 x g för att säkerställa att cellerna fördelas jämnt på bildens yta. Figur 3: Cytospininställning för att förbereda behandlade celler på mikroskopbilder. (A) Visar de enskilda komponenterna, (i) cuvette tratt, (ii) filterkort, iii) glasmikroskopsutschbana och (iv) metallstöd som krävs för att cytospina HepG2-celler på mikroskopbilder. B)Den sista cuvettetratten. C)Korrekt placering av cuvettetratten i cytocentrifugen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Låt rutschkanorna lufttorka innan fixeringen i iskall, 90% metanol i 10 min. När bilderna är fasta, låt rutschkanorna lufttorka över natten vid rumstemperatur innan de förvaras vid -20 °C i upp till 6 månader. Vid behov, ta bort de förberedda mikroskoprutschbanorna från -20 °C frys och låt värma till rumstemperatur innan giemsafärgning.VARNING: Enligt förordning (EG) nr 1272/2008 [CLP] är Giemsa färglösning en mycket brandfarlig vätska som kan vara giftig vid förtäring och orsaka skador vid kontakt med ögon, hud eller vid inandning. Se tillhörande SDS-blad för detaljerad lagring, hantering och hälso- och säkerhetsråd om denna kemikalie före användning. Medan diabilderna tinar, förbered en 20% Giemsa färgningslösning (25 ml krävs för att färga ~ 30 bilder) utspädd i fosfatasbuffert (pH 6,8). Blanda noggrant genom att försiktigt virvla runt lösningen innan du filtrerar med vikt filterpapper placerat i en tratt. Använd en Pasteur-pipett, tillsätt 3 – 5 droppar filtrerad Giemsa-lösning till cytodoten på varje bild och låt den vara i 8 – 10 min. Tvätta diabilder i två på varandra följande fosfatasbuffert tvättar innan du kort sköljer under kallt vatten för att ta bort eventuella överflödiga fläckar kvar. Låt rutschkanorna lufttorka. När de är torra, i en rökhuv, doppa målade diabilder i xylen i 10 s innan du lägger till en droppe monteringsmedium i mitten av cytodoten och en plats ett glaslock ovanpå. Låt mikroskopet glida i rökhuven över natten för att torka innan manuell poängsättning; De kan förvaras på obestämd tid i rumstemperatur. 7. Dataanalys Enligt OECD:s testriktlinjer 487 (2014)11, för att bedöma och kvantifiera DNA-skador som framkallats till följd av exponering för ett enm- eller kemiskt agens, använd ett lätt mikroskop (100x mål med nedsänkningsolja) 2000 mononukleerade eller 1000 binukleära celler per biologisk replikat för att poäng för förekomst av mikrokärnor, enligt figur 4. Figur 4: Micronucleus assay poäng bedömning beslut träd. Schematiskt beslutsträd för att belysa behovet av olika bedömningsförfaranden för poängsättning och cytotoxicitet vid användning av mikrokärnansanalysen med 3D-modeller efter akuta eller långsiktiga exponeringssystem. Akuta (≤24 h) exponeringar tillåter användning av cytokinesen blockerad mikrokärnaanalys, medan långsiktiga (≥24 h) exponeringar kräver den mononukleära versionen av analysen. båda beskrivs i OECD:s testriktlinje 487. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Beräkna en procentandel genotoxicityvärde baserat på andelen mikrokärnor per antal mononukleära eller binucleated celler. För att bedöma de observerade DNA-skadorna är inte ett resultat av cellskräp som orsakas av en hög andel apoptotiska celler, ta ett mått av cytotoxicitet vid sidan av. I detta fall, beroende på förekomsten av Cytochalasin B, använd antingen CPBI eller RVCC beräkning (enligt beskrivningen i figur 4). Genotoxicity får endast utvärderas i prover där cytotoxiciteten är mindre än 55 % ± 5 % enligt definitionen i OECD:s testriktlinje 48711.