Эта процедура была создана для использования для разработки передовых 3D печеночным культур in vitro, которые могут обеспечить более физиологически релевантную оценку генотоксических опасностей, связанных с наноматериальным воздействием как на острые, так и долгосрочные, повторяющиеся режимы дозы.
В связи с быстрым развитием и внедрением широкого спектра инженерных наноматериалов (ENM), воздействие ENM неизбежно и разработка надежных, прогностический in vitro тестовых систем имеет важное значение. Гепатическая токсикология является ключевым при рассмотрении воздействия ЭНМ, так как печень играет жизненно важную роль в метаболическом гомеостазе и детоксикации, а также является основным местом накопления ЭНМ после воздействия. Основываясь на этом и общепринятом понимании того, что 2D-модели гепатоцитов не точно имитируют сложности сложных многоклеточных взаимодействий и метаболической активности, наблюдаемой in vivo, больше внимания уделяется разработке физиологически релевантных 3D моделей печени, адаптированных для целей оценки опасности ENM in vitro. В соответствии с принципами 3Rs для замены, сокращения и уточнения экспериментов на животных, 3D HepG2 клеточной линии на основе модели печени была разработана, которая является удобной, экономически эффективной системой, которая может поддерживать как расширенные, так и повторяющиеся режимы воздействия ENM (≤14 дней). Эти модели сфероидов (≥500 мкм в диаметре) сохраняют свою пролиферативную способность (т.е. деление клеточных моделей), позволяя им быть в сочетании с микронуклейным анализом «золотого стандарта» для эффективной оценки генотоксичности в пробирке. Их способность сообщать о ряде токсикологических конечных точек (например, функции печени, (про-) воспалительные реакции, цитотоксия и генотоксичность) характеризовалась использованием нескольких ЭНМ как в острых (24 ч), так и в долгосрочных (120 ч) режимах воздействия. Эта 3D-печеночная печеночная модель может быть использована для оценки более реалистичного воздействия ENM, обеспечивая тем самым будущий подход in vitro для лучшей поддержки оценки опасности ENM в обычном и легко доступном виде.
В связи с быстрым развитием и внедрением широкого спектра инженерных наноматериалов (ENM) в изобилии человеческих приложений (например, продуктов питания, косметики, одежды, спортивного оборудования, электроники, транспорта и медицины), неизбежно, что люди будут подвергаться воздействию ЕМ на регулярной основе. При этом, Есть повышенная озабоченность тем, что роман, размер конкретных физио-химических характеристик, которые считают эти материалы выгодными в многочисленных приложениях может вызвать неблагоприятные последствия для здоровья человека и окружающей среды сопутствующих. В настоящее время проводятся многочисленные международные мероприятия, с тем чтобы активно отражать более физиологически релевантное воздействие этих ЭНМ и оценивать потенциальную токсичность этих материалов в течение острых, долгосрочных и повторяющихся сценариев воздействия низких доз.
Гепатическая токсикология является ключевым при рассмотрении воздействия ENM, так как широко известно, что печень является основным местом накопления ENMпосле воздействия 1,2. Кроме того, печень является основной системой органа для метаболизма и детоксикации веществ, которые входят в системное кровообращение3. Основываясь на общепринятом понимании того, что 2D модели гепатоцитов не точно имитируют сложности сложных многоклеточных взаимодействий или надлежащим образом представляют метаболическую активность наблюдается in vivo, больший акцент на разработку надежных и физиологически актуальных моделей в пробирке 3D печени для in vivo заменитьтехнологии была создана 4,5. Использование передовых технологий 3D-культуры улучшает долговечность печеночными моделями in vitro, что позволяет исследовало долгосрочные, повторяющиеся режимы воздействия. Кроме того, этот передовой формат культуры способствует формированию расширенных физиологических, органотипических функций, таких как желчные каналикулы, активные процессы транспортировки и улучшенные возможности метаболизма препарата CYP450, тем самым улучшая прогностику моделей6. Современные 3D-печеночные модели, состоящие из монокультур (только гепатоцитов) или со-культур (гепатоциты с непаренхимальными клетками) существуют в нескольких форматах, начиная от микротыссов или сфероидов в ультранизких адгезионых пластинах, висячих капли сфероидов, клеток, встроенных в матрицы и / или леса и микрофлюидных клеточных культур платформ, все из которых считаются эффективными передовыми моделями in vitro для оценкипеченочной токсичности 6,7. Тем не менее, большинство из этих модельных систем высокого технического обслуживания, требуют специального оборудования и стоят дорого. Кроме того, эти модели часто являются статичными (т.е. моделями неразделимых клеток), что препятствует их использованию при оценке конечных точек опасности, таких как тестирование генотоксичности с использованием методов количественной оценки фиксированного повреждения ДНК. Генотоксичность является основным условием в регулятивной токсикологии, и это жизненно важный компонент оценки риска любого токсиканта8. Существует не один анализ, который может быть применен для количественной оценки всех форм повреждения ДНК, которые могут возникнуть после воздействия экзогенного агента. Тем не менее, основным компонентом in vitro генотоксичность тестирования батареи микронуклид анализа, который является надежным и многогранным методом, который измеряет валовой хромосомныйущерб 9. Это золотой стандарт техники, описанной ВЭСР Тест Руководство 487, для оценки повреждения ДНК in vitro и генотоксичность и является частью требования испытательной батареи длянормативной оценки опасности 10,11.
Линия клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека, HepG2, широко используется для первоначального скрининга оценки опасности, поскольку клетки легко доступны, относительно недороги для источника, просты в культуре и податливы к высокой пропускнойспособности скрининга 12,13. При культуре в 3D сферических структур, они были показаны, чтобы резюмировать микропролезион печени хорошо и предлагают печеночную модель с достаточными возможностями пролиферации для поддержки микронуклидаанализа 3. Для улучшения долговечности и функции модели, подобной печени, была создана дальнейшая разработка шифроидных моделей HepG2 в целях поддержки оценки опасности генотоксичности в течение долгосрочных режимов повторного воздействия (≤14 дней). Таким образом, в соответствии с принципами 3Rs для замены, сокращения и уточнения экспериментов на животных, настоящий протокол был создан, чтобы обеспечить передовые 3D in vitro печеночной модели, способной надежно оценить несколько токсикологических конечных точек (например, функциональность печени, (про-) воспалительные маркеры, цитотоксиситу и генотоксичность) после острой, долгосрочной и повторной химической и ENM воздействия в обычном порядке и легко доступны.
Здесь мы представляем метод создания физиологически релевантной 3D-линии клеток гепатоцитов на основе модельной системы in vitro для оценки опасности генотоксичности после острого или долгосрочного, повторного воздействия ЭНМ. Протокол может быть разбит на 6 ключевых этапов: культивирование криоконсервированных клеток HepG2; Подготовка сфероидов HepG2; HepG2 сфероид передачи от висячих капли к агарозной подвеске; Урожай сфероидов HepG2; микронуклид анализа и скоринга; и анализ данных.
Приложения для 3D печеночными моделями значительно различаются в зависимости от конкретной биохимической конечной точки или неблагоприятного исхода пути мишенью. Каждая модель имеет свои преимущества и ограничения, от междонорных вариаций в первичных человеческих гепатоцитов (PHH) моделей для снижения активности цитохрома p450 в клеточной линии на основе моделей, но всеони являются ценными сами по себе 6,12,18,19. При оценке генотоксичности в моделях существуют ограничения совместимости с утвержденными нормативными конечными точками, такими как анализ микронуклидов in vitro, так как требуется активное распространение. Это необходимо, так как оценка генотоксичности требует количественной оценки фиксированного повреждения ДНК, которая будет оцениваться после клеточного деления, когда есть возможность для восстановления ДНК, чтобы исправить переходные поражения. К сожалению, высокодифференцированные гепатоциты (т.е. HepaRG) на основе сфероидов или микротыссов PHH, которые считаются экспонатом наиболее физиологически релевантных печеночных характеристик, образуют статические(нераспространенные) модели 12,19,20. В результате представленная здесь модель сфероидов 3D HepG2 обеспечивает подходящую альтернативную модель, способную поддерживать тестирование генотоксичности. Сфероиды на основе клеточной линии HepG2 имеют достаточно активное деление клеток на внешней поверхности сфероидов, сохраняя при этом основные функции печени, такие как производство альбумин и мочевины, а также некоторые виды активности CYP4505,12,19. Главным образом эта модель печени in vitro была разработана в дополнение к анализу микронуклидов, так как это один из двух анализов in vitro, рекомендованных в батарее для тестирования генотоксичности8,10,11,21. Тем не менее, модель может быть легко применена к анализу секвенирования ДНК и экспрессии генов (РНК) технологий, в то время как она имеет потенциал для дальнейшей адаптации и использования для других конечных точек повреждения ДНК, таких как анализ кометы. Тем не менее важно учитывать роль, которую играет вмешательство в ЕММ в некоторых анализах конечных точек. Например, анализы на основе цитометрии потока могут не подходить для оценки генотоксичности ENM конкретно из-за вмешательства частиц22.
Одним из ограничивающих факторов сфероидных моделей, которые активно проходят деление клеток, является их размер. Оптимизация плотности посева имеет решающее значение, поскольку должно быть достаточно клеток, которые позволяют модели продолжать размножаться; но не слишком высокое количество клеток, что приводит к слишком компактному сфероиду, что приводит к увеличению некротического ядра. Причиной этого некроза, как полагают, ограничено распространение кислорода и питательных веществ, так как предел этой диффузии, как полагают, составляет примерно 100 – 150мкм ткани 23,24. Тем не менее, это зависит от типа клетки, номер ячейки, эшафот взаимодействий и культурныхусловий 25. С тех пор было показано, что примерно 700 мкм диаметром является пределом для избежания преждевременного начала некроза в центре сфероидов C3A, посев 4000 клеток HepG2 на сфероид обеспечивает диаметр модели на момент экспозиции составляет ≤500мкм 26. Кроме того, Шах и др. установили, что клетки HepG2, посеянные выше 5000 клеток на сфероид, продемонстрировали 25% снижение жизнеспособности после 7 дней в культуре, что может относиться к среднему диаметру 680 мкм и ограниченной доступности питательных веществ в 20 йл, висящейпадение 5. Чтобы преодолеть это, модель, разработанная в настоящем протоколе, проходит критический шаг, когда висячие капли передаются в агарозные скважины с покрытием после первоначального образования сфероида. Это обеспечивает больший объем среды культуры присутствует для поддержания постоянно растущего числа клеток в сфероидов. В результате, модель сфероида HepG2 остается более чем на 70% жизнеспособной после 10 дней в культуре и может быть использована для долгосрочной оценки опасности invitro.
В то время как модель сфероида HepG2 может поддерживать как острые, так и долгосрочные режимы воздействия, освежающий клеточный культурный средний период в течение длительных периодов культуры ограничен для этой модели, поскольку полная замена среды не рекомендуется из-за потенциальной потери сфероидов. Предполагается, что при воздействии ЭНМ наблюдается высокая тенденция к однородным дисперсиям ЭНМ на агломерат и осадочные отложения. Тем не менее, примечательно, что скорость, с которой отложения ENM могут варьироваться в зависимости от параметров частиц (например, размер, форма и плотность) и может быть определена теоретически с помощью модели осадочных отложений in vitro, диффузии и дозиметрии (ISDD), или ее последних производных, о которых часто говорят, когда в отношении ENM (подвеска) экспозицияприближается к 27,28. При этом ум, предполагается, что если только 50% клеточной культуры среды тщательно удалены с поверхности клеточной культуры, нарушение и последующее удаление дозы ЕММ теоретически должно быть минимальным. Тем не менее, с броурианского движения в игре, это не может быть строго так и дальнейшей работы в осаждения и осаждения каждого конкретного ЕМ для тестирования должны быть предприняты для обеспечения правильной дозиметрии сохраняется на протяжении долгосрочных режимоввоздействия 27. Главным образом это потенциальное ограничение, чтобы рассмотреть при выполнении повторных режимов досирования, поскольку это может иметь решающее значение для окончательной, накопленной концентрации. Химические воздействия, с другой стороны, в то время как не без своих собственных ограничений, чтобы рассмотреть, предлагают более упрощенный подход в том, что химические вещества, как правило, остаются в растворе и, таким образом, прямая замена первоначальной химической концентрации в дополнение к вновь добавленной концентрации гарантирует, что любое химическое вещество, потерянное во время освежения средств массовой информациизаменяется соответственно 29. Будущие применения будут включать оценку пригодности модели для режимов повторного воздействия в течение долгосрочных периодов культуры, поскольку неоднократные стратегии досирования имеют решающее значение для оценки способности конкретной органной системы к улучшению или преодолению неблагоприятных последствий, если таковые имеются, вызванных биоаккумуляцией ксенобиотического вещества.
В заключение я хотел бы сказать, что эта 3D-печеночная печеночная модель может быть использована для оценки целого ряда реалистичных сценариев воздействия, обеспечивая тем самым будущий подход in vitro для более эффективной поддержки как ENM, так и оценки химической опасности в обычном и легкодоступном виде.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить, что это исследование получило финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 для проекта PATROLS в соответствии с грантовое соглашение No760813
Aflotoxin B1 | Sigma Aldrich, UK | A6636-5MG | |
Agarose | Sigma Aldrich, UK | A9539-50G | |
Autoclave Tape | |||
BCG Albumin Assay | Sigma Aldrich, UK | MAK124 | |
Bovine Serum Albumin Powder | Sigma Aldrich, UK | A9418 | |
Cell Freezing Aid | Thermo Fisher Scientific, UK | 5100-0001 – Mr Frosty | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Cytochalasin B | Merck, UK | 250233 | |
Cytology Metal Clips | |||
Cytospin 4 Centrifuge | ThermoFisher Scientific, UK | CM00730202 | |
DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine | GIBCO, Paisley, UK | 41965-039 | |
DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes | GIBCO, Paisley, UK | 21063-029 | |
DPX Mounting Medium | FisherScientific, UK | D/5330/05 | |
Ethanol | FisherScientific, UK | 10048291 | |
FBS | GIBCO, Paisley, UK | 10270-106 | |
Filter Cards for Shandon Cytospin | FisherScientific, UK | 15995742 | |
Frosted Glass Slides | ThermoFisher Scientific, UK | ||
Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr | VWR Chemicals, UK | MFCD00081642 | |
Glass Coverslips (24 x 60) | Deckglaser, VWR | ECN631-1575 | |
Haemocytometer and Coverslip | |||
Immersion Oil for Microscope | Zeiss, UK | 518F, ISO8034 | |
Laminar Class II Tissue Culture Hood | Scanlaf Mars | ||
Light Microscope | Zeiss, UK | Axiovert 40C | |
Liquid Nitrogen | |||
Methanol | FisherScientific, UK | 10284580 | |
Microwave | |||
Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips | Greiner-Bio-One, UK | ||
NuncMicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific, Denmark | 167008 | |
P1000 and P200 micropipettes | |||
P300 and P50 multi-channel pipettes | |||
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free | GIBCO, Paisley, UK | 14190-094 | |
Pen/Strep | GIBCO, Paisley, UK | 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml | |
Phosphatase Buffer Tablets | GIBCO, Paisley, UK | 10582-013 | |
Pipette Boy | |||
Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges | FisherScientific, UK | 11690581 | |
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe | Branson, USA | 101-063-971R | |
T-25 and T-75 Tissue Culture Flask | Greiner-Bio-One, UK | T-25 (690175) and T-75 (660175) | |
Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich, UK | T8154-100mL | |
Urea Assay Kit | Sigma Aldrich, UK | MAK006 | |
Virkon Disinfectant | DuPont, UK | Rely+On Virkon | |
Water Bath (37˚C) | Grant JBNova 18 | ||
Weighing Balance | |||
Xylene | FisherScientific, UK | 10588070 | |
0.05% Trypsin-EDTA | GIBCO, Paisley, UK | 5300-054 | |
0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
0.45µm Filter Unit | Millex HA, MF-Millipore, UK | SLHA033SS | |
1.0mL Syringe | BD Plastipak, FisherScientific, UK | 300185 | |
20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps | DWK Life Sciences GmbH, Germany | WHEA986581 | |
37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator | NUAIRE DHD Autoflow | ||
3mL Pasteur Pipette | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL Conical Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL or 100mL Glass Bottles | |||
50mL Skirted Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
5mL, 10mL and 25mL Pipettes | Greiner-Bio-One, UK | ||
9.4cm Square, Petri Dish | Greiner-Bio-One, UK | 688161 |