Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.
Devido ao rápido desenvolvimento e implementação de uma variedade diversificada de nanomateriais projetados (ENM), a exposição ao ENM é inevitável e o desenvolvimento de sistemas de teste in vitro robustos e preditivos é essencial. A toxicologia hepática é fundamental quando se considera a exposição ao ENM, pois o fígado serve a um papel vital na homeostase metabólica e na desintoxicação, além de ser um dos principais locais de acumulação de ENM após a exposição. Com base nisso e no entendimento aceito de que os modelos de hepatócitos 2D não imitam com precisão as complexidades das interações multicelulares intrincadas e da atividade metabólica observada in vivo, há um maior foco no desenvolvimento de modelos hepáticos 3D fisiologicamente relevantes sob medida para fins de avaliação de riscos ENM in vitro. De acordo com os princípios dos 3Rs para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal, foi desenvolvido um modelo hepático baseado em células 3D HepG2, que é um sistema fácil de usar e econômico que pode suportar regimes de exposição enm estendidos e repetidos (≤14 dias). Esses modelos esferoides (≥500 μm de diâmetro) mantêm sua capacidade proliferativa (ou seja, modelos celulares divisórias) permitindo que eles sejam acoplado ao ensaio de micronucleo ‘padrão ouro’ para avaliar efetivamente a genotoxicidade in vitro. Sua capacidade de relatar uma gama de pontos finais toxicológicos (por exemplo, função hepática, (pro-)resposta inflamatória, citotoxicidade e genotoxicidade) tem sido caracterizada usando vários ENMs em regimes de exposição agudos (24 h) e de longo prazo (120 h). Este modelo hepático in vitro 3D tem a capacidade de ser utilizado para avaliar exposições enm mais realistas, fornecendo assim uma futura abordagem in vitro para melhor suportar a avaliação de riscos ENM de forma rotineira e de fácil acesso.
Devido ao rápido desenvolvimento e implementação de uma variedade diversificada de nanomateriais projetados (ENM) em uma infinidade de aplicações de base humana (por exemplo, alimentos, cosméticos, vestuário, equipamentos esportivos, eletrônicos, transporte e medicina), é inevitável que os seres humanos sejam expostos ao ENM regularmente. Com isso, há preocupações crescentes de que o novo, tamanho de características fisio-químicas específicas que considerem esses materiais vantajosos em inúmeras aplicações, possa causar efeitos adversos sobre a saúde humana e o meio ambiente concomitantemente. Atualmente, muitas atividades internacionais estão em vigor para refletir ativamente exposições mais fisiologicamente relevantes a esses ENM e avaliar a toxicidade potencial desses materiais em cenários de exposição aguda, de longo prazo e repetidos de baixa dose.
Toxicologia hepática é fundamental quando se considera a exposição ao ENM, pois é amplamente conhecido que o fígado é um dos principais locais de acumulação de ENM pós exposição1,2. Além disso, o fígado é o sistema de órgãos primários para metabolismo e desintoxicação de substâncias que entram em circulação sistêmica3. Com base no entendimento aceito de que modelos hepatócitos 2D não imitam com precisão as complexidades de interações multicelulares intrincadas ou representam adequadamente a atividade metabólica observada in vivo, um maior foco no desenvolvimento de modelos hepáticos in vitro 3D robustos e fisiologicamente relevantes para tecnologias substitutas in vivo foi estabelecido4,5. A utilização de tecnologias avançadas de cultura 3D melhora a longevidade de modelos hepáticos in vitro, permitindo que regimes de exposição repetidas e de longo prazo sejam investigados. Além disso, esse formato de cultura avançada promove a formação de características fisiológicas e organotípicas aprimoradas, como bile canaliculi, processos de transporte ativo e capacidades de metabolização de medicamentos CYP450 aprimorados, melhorando assim a previsibilidade dos modelos6. Modelos hepáticos in vitro atuais 3D constituídos por monoculturas (somente hepatócitos) ou co-culturas (hepatócitos com células não equilíquicas) existem em vários formatos, desde microtissues ou esferoides em placas de aderência ultralow, esferoides de gota suspensa, células embutidas em matrizes e/ou andaimes e plataformas de cultura celular microfluida, todos os quais são considerados modelos avançados in vitro eficazes para avaliação de toxicidade hepática6,7. No entanto, a maioria desses sistemas de modelos são de alta manutenção, exigem equipamentos especializados e são caros. Além disso, esses modelos são frequentemente estáticos (ou seja, modelos de células nãondividing) que impedem seu uso na avaliação de pontos finais de perigo, como testes de genotoxicidade utilizando métodos que quantificam danos consertos de DNA. A genotoxicidade é um pré-requisito central na toxicologia regulatória, e é um componente vital da avaliação de risco de qualquer toxicante8. Não há um único ensaio que possa ser aplicado para quantificar todas as formas de dano de DNA que possam surgir após a exposição a um agente exógeno. No entanto, um componente central da bateria de teste de genotoxicidade in vitro é o ensaio de micronucleus, que é uma técnica confiável e multifacetada que mede danos cromossômicos brutos9. É uma técnica padrão-ouro descrita pela Diretriz de Teste da OCDE 487, para avaliação de danos in vitro de DNA e genotoxicidade e faz parte do requisito da bateria de teste para avaliação de risco regulatório10,11.
A linha celular hepatocelular humana, HepG2, é amplamente utilizada para a triagem inicial de avaliação de riscos, pois as células estão prontamente disponíveis, relativamente baratas à fonte, simples à cultura e amenáveis à triagem de alto rendimento12,13. Quando cultivadas em estruturas esféricas 3D, elas têm sido demonstradas para recapitular bem o microambiente hepático e oferecer um modelo hepático com capacidades proliferativas suficientes para suportar o ensaio de micronucleus3. Foi estabelecido mais desenvolvimento dos modelos esferoides HepG2 para melhorar a longevidade e a funcionalidade hepática do modelo, a fim de apoiar a avaliação de risco genotoxicidade em regimes de exposição repetidas a longo prazo (≤14 dias). Assim, em consonância com os princípios dos 3Rs para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal, o presente protocolo foi estabelecido para fornecer um modelo hepático in vitro avançado 3D capaz de avaliar de forma confiável múltiplos pontos finais toxicológicos (por exemplo, funcionalidade hepática, (pro-)marcadores inflamatórios, citotoxicidade e genotoxicidade) seguindo exposições químicas agudas, de longo prazo e repetidas e ENM em uma rotina e de forma facilmente acessível.
Aqui, apresentamos um método para estabelecer uma linha de células hepatócitos 3D fisiologicamente relevante baseada em sistema de modelo in vitro para avaliação de risco de genotoxicidade após exposições agudas ou de longo prazo do ENM. O protocolo pode ser dividido em 6 estágios-chave: acultura de células HepG2 criopreservadas; Preparação de sferóide hepG2; Transferência de spheróide hepG2 de queda de suspensão para suspensão de agarose; Colheita de sferóides hepG2; ensaio micronucleus e pontuação; e análise de dados.
As aplicações para modelos hepáticos 3D variam consideravelmente dependendo do ponto final bioquímico específico ou da via de desfecho adverso que está sendo alvo. Cada modelo tem seus benefícios e limitações, desde a variação interdonor nos modelos primários de hepatócito humano (PHH) até a redução da atividade citocromática p450 em modelos baseados em linha celular, mas todos são valiosos por si só6,12,18,19. Ao avaliar a genotoxicidade, há limitações na compatibilidade dos modelos com pontos finais aprovados pela regulamentação, como o ensaio de micronuclear in vitro, pois a proliferação ativa é necessária. Isso é necessário, pois a avaliação da genotoxicidade requer a quantificação de danos fixos de DNA a serem avaliados na divisão pós-celular quando há oportunidade de reparação de DNA para corrigir lesões transitórias. Infelizmente, hepatocitos altamente diferenciados (ou seja, esferoides baseados em HepaRG) ou microtissues PHH, que são considerados como apresentar as características hepáticas mais fisiologicamente relevantes formam modelos estáticos (não proliferativos)12,19,20. Como resultado, o modelo esferoide HepG2 3D apresentado aqui fornece um modelo adequado e alternativo capaz de suportar testes de genotoxicidade. Os esferoides baseados em linha celular HepG2 têm células divisórias suficientes na superfície externa dos esferoides, mantendo características básicas semelhantes ao fígado, como a produção de albumina e ureia e alguma atividade CYP4505,12,19. Principalmente este modelo hepático in vitro foi desenvolvido para complementar o ensaio micronucleus, pois este é um dos dois ensaios in vitro recomendados na bateria para testes de genotoxicidade8,10,11,21. No entanto, o modelo pode ser facilmente aplicado às tecnologias de análise de sequenciamento de DNA e expressão genética (RNA), enquanto tem o potencial de ser ainda mais adaptado e utilizado para outros pontos finais de dano de DNA, como o ensaio do cometa. No entanto, é importante considerar o papel que a interferência do ENM desempenha em algumas análises de ponto final. Por exemplo, análises baseadas em citometria de fluxo podem não ser adequadas para avaliação de genotoxicidade enm especificamente devido à interferência de partículas22.
Um fator limitante dos modelos esferoides que se submetem ativamente à divisão celular é o seu tamanho. A otimização da densidade de semeadura é fundamental, pois é preciso haver células suficientes que permitam que o modelo continue a proliferar; mas não muito alto um número de células, o que resulta no esferoide se tornando excessivamente compacto, levando a um núcleo necrosado aumentado. Acredita-se que a causa dessa necrose seja a restrição de oxigênio e difusão de nutrientes, já que o limite dessa difusão é de aproximadamente 100 – 150 μm de tecido23,24. No entanto, isso depende do tipo celular, número celular, interações de andaimes e condições de cultura25. Desde então, foi demonstrado que aproximadamente 700 μm de diâmetro é o limite para evitar o início prematuro da necrose no centro de esferoides C3A, semeando 4000 células HepG2 por esferoide garante que o diâmetro do modelo no momento da exposição seja ≤500 μm26. Além disso, Shah et al. estabeleceram que as células HepG2 semeadas acima de 5000 células por esferoide apresentaram uma redução de 25% na viabilidade após 7 dias de cultura, o que poderia pertencer ao diâmetro médio de 680 μm e disponibilidade limitada de nutrientes em uma queda de 20 μL de suspensão5. Para superar isso, o modelo concebido no presente protocolo passa por um passo crítico onde a queda de enforcamento é transferida para poços revestidos de agarose após a formação inicial do esferoide. Isso garante um maior volume de cultura média está presente para sustentar o número crescente de células dentro dos esferoides. Como resultado, o modelo esferoide HepG2 permanece mais de 70% viável após 10 dias de cultura e pode ser utilizado para avaliação de risco de longo prazo in vitro.
Embora o modelo esferoide HepG2 possa suportar regimes de exposição aguda e de longo prazo, o meio de cultura celular refrescante durante períodos de cultura prolongado é restrito para este modelo, pois a substituição completa do meio não é aconselhada devido à perda potencial dos esferoides. Presume-se que, com as exposições enm, a tendência de dispersões homogêneas de ENM para aglomeração e sedimentos é alta. No entanto, é notável que a taxa em que um sedimento ENM pode variar dependendo dos parâmetros de partículas (por exemplo, tamanho, forma e densidade) e pode ser determinada teoricamente usando o modelo de sedimentação in vitro, difusão e dosimetria (ISDD), ou seus derivados recentes, muitas vezes referidos quando se aproxima da exposição ENM (suspensão) se aproxima27,28. Com isso é mente, supõe-se que se apenas 50% do meio de cultura celular for cuidadosamente removido da superfície da cultura celular, a interrupção e posterior remoção da dose ENM deve, em teoria, ser mínima. No entanto, com a moção browniana em jogo, isso pode não ser estritamente o caso e mais trabalhos na deposição e sedimentação de cada ENM em particular a ser testado devem ser realizados para garantir que a dosimetria correta seja mantida ao longo dos regimes de exposição a longo prazo27. Principalmente, esta é uma limitação potencial a ser considerada ao realizar regimes repetidos de dosagem, pois isso poderia ser fundamental para a concentração final e acumulada. Exposições baseadas em produtos químicos, por outro lado, embora não sem suas próprias limitações a considerar, oferecem uma abordagem mais simplista na forma de que as substâncias químicas tendem a permanecer em solução e, portanto, uma substituição direta da concentração química original, além da concentração recém-adicionada, garante que qualquer produto químico perdido durante o refresco da mídia seja substituído emconformidade com 29. Aplicações futuras incluiriam avaliar a adequação do modelo para regimes de exposição repetida em períodos de cultura de longo prazo, uma vez que estratégias de dosagem repetidas são crucialmente importantes para avaliar a capacidade de um determinado sistema de órgãos de amenizar ou superar os efeitos adversos, se houver, induzidos pela bioaccumulação de substância abiótica.
Em conclusão, este modelo hepático in vitro 3D tem a capacidade de ser utilizado para avaliar uma série de cenários de exposição realista, proporcionando assim uma futura abordagem in vitro para melhor suportar tanto a AVALIAÇÃO DE ENM quanto a avaliação de riscos químicos de forma rotineira e de fácil acesso.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer que esta pesquisa recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia para o projeto PATROLS, sob o acordo de subvenção nº 760813
Aflotoxin B1 | Sigma Aldrich, UK | A6636-5MG | |
Agarose | Sigma Aldrich, UK | A9539-50G | |
Autoclave Tape | |||
BCG Albumin Assay | Sigma Aldrich, UK | MAK124 | |
Bovine Serum Albumin Powder | Sigma Aldrich, UK | A9418 | |
Cell Freezing Aid | Thermo Fisher Scientific, UK | 5100-0001 – Mr Frosty | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Cytochalasin B | Merck, UK | 250233 | |
Cytology Metal Clips | |||
Cytospin 4 Centrifuge | ThermoFisher Scientific, UK | CM00730202 | |
DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine | GIBCO, Paisley, UK | 41965-039 | |
DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes | GIBCO, Paisley, UK | 21063-029 | |
DPX Mounting Medium | FisherScientific, UK | D/5330/05 | |
Ethanol | FisherScientific, UK | 10048291 | |
FBS | GIBCO, Paisley, UK | 10270-106 | |
Filter Cards for Shandon Cytospin | FisherScientific, UK | 15995742 | |
Frosted Glass Slides | ThermoFisher Scientific, UK | ||
Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr | VWR Chemicals, UK | MFCD00081642 | |
Glass Coverslips (24 x 60) | Deckglaser, VWR | ECN631-1575 | |
Haemocytometer and Coverslip | |||
Immersion Oil for Microscope | Zeiss, UK | 518F, ISO8034 | |
Laminar Class II Tissue Culture Hood | Scanlaf Mars | ||
Light Microscope | Zeiss, UK | Axiovert 40C | |
Liquid Nitrogen | |||
Methanol | FisherScientific, UK | 10284580 | |
Microwave | |||
Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips | Greiner-Bio-One, UK | ||
NuncMicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific, Denmark | 167008 | |
P1000 and P200 micropipettes | |||
P300 and P50 multi-channel pipettes | |||
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free | GIBCO, Paisley, UK | 14190-094 | |
Pen/Strep | GIBCO, Paisley, UK | 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml | |
Phosphatase Buffer Tablets | GIBCO, Paisley, UK | 10582-013 | |
Pipette Boy | |||
Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges | FisherScientific, UK | 11690581 | |
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe | Branson, USA | 101-063-971R | |
T-25 and T-75 Tissue Culture Flask | Greiner-Bio-One, UK | T-25 (690175) and T-75 (660175) | |
Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich, UK | T8154-100mL | |
Urea Assay Kit | Sigma Aldrich, UK | MAK006 | |
Virkon Disinfectant | DuPont, UK | Rely+On Virkon | |
Water Bath (37˚C) | Grant JBNova 18 | ||
Weighing Balance | |||
Xylene | FisherScientific, UK | 10588070 | |
0.05% Trypsin-EDTA | GIBCO, Paisley, UK | 5300-054 | |
0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
0.45µm Filter Unit | Millex HA, MF-Millipore, UK | SLHA033SS | |
1.0mL Syringe | BD Plastipak, FisherScientific, UK | 300185 | |
20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps | DWK Life Sciences GmbH, Germany | WHEA986581 | |
37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator | NUAIRE DHD Autoflow | ||
3mL Pasteur Pipette | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL Conical Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL or 100mL Glass Bottles | |||
50mL Skirted Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
5mL, 10mL and 25mL Pipettes | Greiner-Bio-One, UK | ||
9.4cm Square, Petri Dish | Greiner-Bio-One, UK | 688161 |