Denne prosedyren ble etablert for å brukes til å utvikle avanserte 3D leverkulturer in vitro, som kan gi en mer fysiologisk relevant vurdering av gentoksiske farer forbundet med nanomaterial eksponering over både akutte eller langsiktige, gjentatte doseregimer.
På grunn av den raske utviklingen og implementeringen av et mangfoldig utvalg av konstruerte nanomaterialer (ENM), er eksponering for ENM uunngåelig, og utviklingen av robuste, prediktive in vitro-testsystemer er avgjørende. Levertoksikologi er nøkkelen når man vurderer ENM-eksponering, da leveren tjener en viktig rolle i metabolsk homeostase og avgiftning, samt å være et viktig sted for ENM-akkumulering etter eksponering. Basert på dette og den aksepterte forståelsen av at 2D-hepatocyttmodeller ikke nøyaktig etterligner kompleksiteten i intrikate multi-cellulære interaksjoner og metabolsk aktivitet observert in vivo, er det større fokus på utvikling av fysiologisk relevante 3D-levermodeller skreddersydd for ENM-farevurderingsformål in vitro. I tråd med prinsippene til 3R-ene for å erstatte, redusere og foredle dyreforsøk, er det utviklet en 3D HepG2 cellelinjebasert levermodell, som er et brukervennlig, kostnadseffektivt system som kan støtte både utvidede og gjentatte ENM-eksponeringsregimer (≤ 14 dager). Disse sfæroidmodellene (≥500 μm i diameter) beholder sin proliferative kapasitet (dvs. delecellemodeller) slik at de kan kobles sammen med “gullstandarden” mikronukleusanalyse for effektivt å vurdere gentoksisitet i vitro. Deres evne til å rapportere om en rekke toksikologiske endepunkter (f.eks. leverfunksjon, (pro-)inflammatorisk respons, cytotoksisitet og gentoksisitet) har blitt karakterisert ved hjelp av flere ENMs på tvers av både akutte (24 timer) og langsiktige (120 h) eksponeringsregimer. Denne 3D in vitro levermodellen har kapasitet til å bli brukt til å evaluere mer realistiske ENM-eksponeringer, og gir dermed en fremtidig in vitro-tilnærming for bedre å støtte ENM-farevurdering på en rutinemessig og lett tilgjengelig måte.
På grunn av den raske utviklingen og implementeringen av et mangfoldig utvalg av konstruerte nanomaterialer (ENM) på tvers av en mengde menneskebaserte applikasjoner (f.eks. mat, kosmetikk, klær, sportsutstyr, elektronikk, transport og medisin), er det uunngåelig at mennesker vil bli utsatt for ENM med jevne mellomrom. Med dette er det økte bekymringer for at de nye, størrelsesspesifikke fysiokjemiske egenskapene som anser disse materialene fordelaktige i mange applikasjoner, kan forårsake negative effekter på menneskers helse og miljøet samtidig. For tiden er mange internasjonale aktiviteter på plass for aktivt å reflektere mer fysiologisk relevante eksponeringer for disse ENM og vurdere den potensielle toksisiteten til disse materialene over akutte, langsiktige og gjentatte lavdoseeksponeringsscenarier.
Levertoksikologi er nøkkelen når man vurderer ENM-eksponering, da det er allment kjent at leveren er et viktig sted for ENM-akkumulering etter eksponering1,2. Videre er leveren det primære organsystemet for metabolisme og avgiftning av stoffer som går inn i systemisksirkulasjon 3. Basert på den aksepterte forståelsen av at 2D-hepatocyttmodeller ikke nøyaktig etterligner kompleksiteten i intrikate multicellulære interaksjoner eller på riktig måte representerer metabolsk aktivitet observert in vivo, er det etablert et større fokus på å utvikle robuste og fysiologisk relevante in vitro 3D levermodeller for in vivo-erstatningsteknologier er etablert4,5. Bruk av avanserte 3D-kulturteknologier forbedrer levetiden til in vitro levermodeller, noe som gjør det mulig å undersøke gjentatte eksponeringsregimer på lang sikt. I tillegg fremmer dette avanserte kulturformatet dannelsen av forbedrede fysiologiske, organotypiske egenskaper som galle canaliculi, aktive transportørprosesser og forbedrede CYP450-stoffmetaboliseringsevner, og dermed forbedre forutsigbarheten til modellene6. Nåværende 3D in vitro levermodeller bestående av monokulturer (kun hepatocytter) eller medkulturer (hepatocytter med ikke-parenchymale celler) finnes i flere formater, alt fra mikrotissues eller sfæroider i ultralow adhesjon plater, hengende dråpe sfæroider, celler innebygd i matriser og / eller stillaser og mikrofluidiske cellekulturplattformer, som alle anses effektive avanserte in vitro modeller for hepatisk toksisitet vurdering6,7. Imidlertid er de fleste av disse modellsystemene høyt vedlikehold, krever spesialisert utstyr og er dyre. Videre er disse modellene ofte statiske (dvs. ikke-viderende cellemodeller) som forhindrer bruk i vurderingen av fareendepunkter, for eksempel gentoksisitetstesting ved hjelp av metoder som kvantifiserer fast DNA-skade. Gentoksisitet er en sentral forutsetning i regulatorisk toksikologi, og det er en viktig komponent i risikovurderingen av ethvert toksiskmiddel 8. Det er ingen enkelt analyse som kan brukes til å kvantifisere alle former for DNA-skade som kan oppstå etter eksponering for et eksogent middel. Imidlertid er en kjernekomponent i in vitro genotoxicity testing batteriet mikronukleusanalysen, som er en pålitelig og mangesidig teknikk som måler grov kromosomskade9. Det er en gullstandardteknikk beskrevet av OECDs testretningslinje 487, for å vurdere in vitro DNA-skade og gentoksisitet og er en del av testbatterikravet for regulatorisk farevurdering10,11.
Den humane hepatocellulære karsinomcellelinjen, HepG2, brukes mye til innledende farevurderingsscreening, da cellene er lett tilgjengelige, relativt billige å kilde, enkle å kultur og egnet til høy gjennomstrømningsscreening12,13. Når de dyrkes i 3D sfæriske strukturer, har de vist seg å rekapitulere levermikromiljøet godt og tilby en levermodell med tilstrekkelig proliferative evner til å støtte mikronukleusanalysen3. Videreutvikling av HepG2 sfæroidmodeller ble etablert for å forbedre modellens levetid og leverlignende funksjonalitet for å støtte gentoksisitetsfarevurdering over langsiktige, gjentatte eksponeringsregimer (≤ 14 dager). I tråd med prinsippene til 3R-ene for å erstatte, redusere og foredle dyreeksperimentering, er den nåværende protokollen etablert for å gi en avansert 3D in vitro levermodell som er i stand til pålitelig evaluering av flere toksikologiske endepunkter (f.eks. leverfunksjonalitet, (pro-)inflammatoriske markører, cytotoksisitet og gentoksisitet) etter akutte, langsiktige og gjentatte kjemiske og ENM-eksponeringer i en rutinemessig og lett tilgjengelig måte.
Her presenterer vi en metode for å etablere en fysiologisk relevant 3D-hepatocyttcellelinje basert på in vitro-modellsystem for gentoksisitetsfarevurdering etter akutte eller langsiktige, gjentatte ENM-eksponeringer. Protokollen kan deles inn i 6 viktige stadier: kultiverende kryopreserverte HepG2-celler; HepG2 sfæroid forberedelse; HepG2 sfæroid overføring fra hengende dråpe til agarose suspensjon; HepG2 sfæroid høst; micronucleus analyse og scoring; og dataanalyse.
Bruksområder for 3D-levermodeller varierer betydelig avhengig av det spesifikke biokjemiske endepunktet eller ugunstige utfallsveier som målrettes. Hver modell har sine fordeler og begrensninger, fra interdonorvariasjon i primære menneskelige hepatocyttmodeller (PHH) til redusert cytokrom p450-aktivitet i cellelinjebaserte modeller, men alle er verdifulle i seg selv6,12,18,19. Ved vurdering av gentoksisitet er det begrensninger i modellenes kompatibilitet med regulatoriske godkjente endepunkter som in vitro mikronukleusanalysen, da aktiv spredning er nødvendig. Dette er nødvendig, da gentoksisitetsvurdering krever kvantifisering av fast DNA-skade som skal vurderes etter celledeling når det er mulighet for DNA-reparasjon for å korrigere forbigående lesjoner. Dessverre er svært differensiert hepatocytt (dvs. HepaRG) baserte sfæroider eller PHH-mikrotissues, som anses å vise de mest fysiologisk relevante leverlignende egenskapene, statiske (ikke-proliferative) modeller12,19,20. Som et resultat gir 3D HepG2 sfæroidmodellen som presenteres her en passende, alternativ modell som er i stand til å støtte gentoksisitetstesting. HepG2 cellelinjebaserte sfæroider har tilstrekkelig aktivt dele celler på den ytre overflaten av sfæroidene samtidig som grunnleggende leverlignende egenskaper, for eksempel albumin og urea produksjon og noen CYP450 aktivitet5,12,19. Hovedsakelig er denne in vitro levermodellen utviklet for å utfylle mikronukleusanalysen, da dette er en av de to in vitro-analysene som anbefales i batteriet for gentoksisitetstesting8,10,11,21. Modellen kan imidlertid lett anvendes på DNA-sekvenseringsanalyse og genuttrykksteknologier (RNA), mens den har potensial til å bli ytterligere tilpasset og utnyttet for andre DNA-skadeendepunkter, for eksempel kometanalysen. Likevel er det viktig å vurdere hvilken rolle ENM-interferens spiller i enkelte endepunktanalyser. For eksempel kan strømningscytometribaserte analyser ikke være egnet for ENM gentoksisitetsvurdering spesielt på grunn av partikkelinterferens22.
En begrensende faktor for sfæroidmodeller som aktivt gjennomgår celledeling er deres størrelse. Optimalisering av såingstetthet er kritisk, da det må være nok celler som gjør at modellen kan fortsette å spre seg; men ikke for høyt et cellenummer, noe som resulterer i at sfæroiden blir altfor kompakt, noe som fører til en økt nekrotisk kjerne. Årsaken til denne nekrose antas å være begrenset oksygen og næringsdiffusjon, da grensen for denne diffusjonen antas å være ca. 100 – 150 μm vev23,24. Dette avhenger imidlertid av celletype, cellenummer, stillasinteraksjoner og kulturforhold25. Siden det har vist seg at ca 700 μm diameter er grensen for å unngå for tidlig utbrudd av nekrose i midten av C3A sfæroider, såing 4000 HepG2 celler per sfæroid sikrer diameteren på modellen på tidspunktet for eksponering er ≤ 500 μm26. Videre etablerte Shah et al. at HepG2-celler frøet over 5000 celler per sfæroid viste en 25% reduksjon i levedyktighet etter 7 dager i kultur, noe som kan gjelde gjennomsnittlig diameter på 680 μm og begrenset tilgjengelighet av næringsstoffer i en 20 μL hengende dråpe5. For å overvinne dette gjennomgår modellen som er utviklet i den nåværende protokollen et kritisk skritt der hengende dråpe overføres til agarosebelagte brønner etter innledende dannelse av sfæroidet. Dette sikrer at et større volum av kulturmedium er til stede for å opprettholde det stadig økende antall celler i sfæroidene. Som et resultat forblir HepG2 sfæroidmodellen over 70% levedyktig etter 10 dager i kultur og kan brukes til langsiktig farevurdering in vitro.
Mens HepG2 sfæroid-modellen kan støtte både akutte og langsiktige eksponeringsregimer, er forfriskende cellekulturmedium i lengre kulturperioder begrenset for denne modellen, da fullstendig utskifting av mediet ikke anbefales på grunn av det potensielle tapet av sfæroidene. Det antas at med ENM-eksponeringer er tendensen til homogene ENM-dispersjoner til agglomerat og sediment høy. Det er imidlertid bemerkelsesverdig at hastigheten som et ENM-sedimenter kan variere avhengig av partikkelparametrene (f.eks. størrelse, form og tetthet) og kan bestemmes teoretisk ved hjelp av in vitro sedimentering, diffusjon og dosimetri (ISDD) modell, eller dens nylige derivater, ofte referert til når det gjelder ENM (suspensjon) eksponering nærmer seg27,28. Med dette er det antatt at hvis bare 50% av cellekulturmediet forsiktig fjernes fra overflaten av cellekulturen, bør forstyrrelsen og etterfølgende fjerning av ENM-dosen i teorien være minimal. Men med Brownian bevegelse i spill, kan dette ikke strengt tatt være tilfelle, og videre arbeid i avsetning og sedimentering av hver enkelt ENM som skal testes bør gjennomføres for å sikre at riktig dosimetri beholdes gjennom de langsiktige eksponeringsregimene27. I hovedsak er dette en potensiell begrensning å vurdere når man utfører gjentatte doseringsregimer, da dette kan være avgjørende for den endelige, akkumulerte konsentrasjonen. Kjemisk basert eksponering derimot, mens de ikke uten egne begrensninger å vurdere, tilbyr en mer forenklet tilnærming ved at kjemiske stoffer har en tendens til å forbli i løsning og dermed en direkte erstatning av den opprinnelige kjemiske konsentrasjonen i tillegg til den nylig tilsatte konsentrasjonen sikrer at kjemikalier som går tapt under medieforfriskninger, erstattes tilsvarende29. Fremtidige anvendelser vil omfatte evaluering av modellens egnethet for gjentatte eksponeringsregimer over langsiktige kulturperioder, da gjentatte doseringsstrategier er avgjørende for å vurdere evnen til et bestemt organsystem til å forbedre eller overvinne bivirkningene, hvis noen, indusert av bioakkumulering av et xenobiotisk stoff.
Avslutningsvis har denne 3D in vitro-levermodellen kapasitet til å bli brukt til å evaluere en rekke realistiske eksponeringsscenarier, og dermed gi en fremtidig in vitro-tilnærming for bedre å støtte både ENM og kjemisk farevurdering på en rutinemessig og lett tilgjengelig måte.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne erkjenne at denne forskningen har fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 for PATROLS-prosjektet, under tilskuddsavtale nr.
Aflotoxin B1 | Sigma Aldrich, UK | A6636-5MG | |
Agarose | Sigma Aldrich, UK | A9539-50G | |
Autoclave Tape | |||
BCG Albumin Assay | Sigma Aldrich, UK | MAK124 | |
Bovine Serum Albumin Powder | Sigma Aldrich, UK | A9418 | |
Cell Freezing Aid | Thermo Fisher Scientific, UK | 5100-0001 – Mr Frosty | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Cytochalasin B | Merck, UK | 250233 | |
Cytology Metal Clips | |||
Cytospin 4 Centrifuge | ThermoFisher Scientific, UK | CM00730202 | |
DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine | GIBCO, Paisley, UK | 41965-039 | |
DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes | GIBCO, Paisley, UK | 21063-029 | |
DPX Mounting Medium | FisherScientific, UK | D/5330/05 | |
Ethanol | FisherScientific, UK | 10048291 | |
FBS | GIBCO, Paisley, UK | 10270-106 | |
Filter Cards for Shandon Cytospin | FisherScientific, UK | 15995742 | |
Frosted Glass Slides | ThermoFisher Scientific, UK | ||
Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr | VWR Chemicals, UK | MFCD00081642 | |
Glass Coverslips (24 x 60) | Deckglaser, VWR | ECN631-1575 | |
Haemocytometer and Coverslip | |||
Immersion Oil for Microscope | Zeiss, UK | 518F, ISO8034 | |
Laminar Class II Tissue Culture Hood | Scanlaf Mars | ||
Light Microscope | Zeiss, UK | Axiovert 40C | |
Liquid Nitrogen | |||
Methanol | FisherScientific, UK | 10284580 | |
Microwave | |||
Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips | Greiner-Bio-One, UK | ||
NuncMicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific, Denmark | 167008 | |
P1000 and P200 micropipettes | |||
P300 and P50 multi-channel pipettes | |||
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free | GIBCO, Paisley, UK | 14190-094 | |
Pen/Strep | GIBCO, Paisley, UK | 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml | |
Phosphatase Buffer Tablets | GIBCO, Paisley, UK | 10582-013 | |
Pipette Boy | |||
Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges | FisherScientific, UK | 11690581 | |
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe | Branson, USA | 101-063-971R | |
T-25 and T-75 Tissue Culture Flask | Greiner-Bio-One, UK | T-25 (690175) and T-75 (660175) | |
Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich, UK | T8154-100mL | |
Urea Assay Kit | Sigma Aldrich, UK | MAK006 | |
Virkon Disinfectant | DuPont, UK | Rely+On Virkon | |
Water Bath (37˚C) | Grant JBNova 18 | ||
Weighing Balance | |||
Xylene | FisherScientific, UK | 10588070 | |
0.05% Trypsin-EDTA | GIBCO, Paisley, UK | 5300-054 | |
0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
0.45µm Filter Unit | Millex HA, MF-Millipore, UK | SLHA033SS | |
1.0mL Syringe | BD Plastipak, FisherScientific, UK | 300185 | |
20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps | DWK Life Sciences GmbH, Germany | WHEA986581 | |
37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator | NUAIRE DHD Autoflow | ||
3mL Pasteur Pipette | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL Conical Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL or 100mL Glass Bottles | |||
50mL Skirted Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
5mL, 10mL and 25mL Pipettes | Greiner-Bio-One, UK | ||
9.4cm Square, Petri Dish | Greiner-Bio-One, UK | 688161 |