장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

1.냉동 보존 HepG2 세포를 배양 참고: 미국형 배양컬렉션(ATCC)에서 얻은 HepG2 세포는 4.5g/L D-포도당 및 L-글루타민을 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/성병절제술로 보충한 1x 덜벡코의 수정독수리 매체(DMEM)에서 배양되었다. 37°C 수조에서 전온 DMEM 세포 배양 배지(보충제 포함)가 30분 동안. 액체 질소에서 HepG2 세포의 유리병 1개를 제거하고 37°C 수조에서 2-3분 동안 해동하고 유리병을 부드럽게 소용돌이면서 세포 현탁액의 균일한 해동을 허용합니다. 오염 가능성을 줄이기 위해 O 링 위의 유리병을 침수하지 않도록 주의하십시오. 해동되면 수조에서 바이알을 제거하고 70% 에탄올로 넉넉하게 스프레이하여 바이알의 바깥표면을 오염제거한 후, 클래스 II 라미나르 조직 배양 후드를 배치합니다. HepG2 세포의 극저온의 내용을 사전 데밍DMEM 세포 배양 배지의 9mL를 포함하는 원심분리기 튜브로 조심스럽게 피펫(보충제 포함). 10mL 스트리펫을 사용하여, 세포 현탁액의 10mL를 25cm2 일회용 세포 배양 플라스크로 이송하고 3일 동안 배양(파종에서) 5% CO2 및 37°C에서 ~80% 인플루엔자에 도달하여 하위 배양을 더 큰 75cm2 일회용 세포 배양 플라스크로 진행한다. 일단 80%의 합류에 도달하면, 37°C 수조에서 37°C 수조에서 예열된 트립신/EDTA 용액0.05%를 트립시화하여 멸균 조건하에서 하위 배양 세포가 30분 동안 미리 데워졌다. 어떤 시점에서 세포가 건조 할 수 없습니다. 세포가 부착된 단층층을 형성함에 따라 소독제 폐기물 냄비에 기울어 미디어를 제거합니다. 그런 다음 즉시 단층층을 세척하여 실온에서 보관된 멸균 1x PBS 용액 3mL로 플라스크를 두 번 헹구어 기존 미디어의 모든 흔적을 제거합니다. 또한 PBS를 소독제 폐기물 냄비에 버리십시오. PBS 세척이 제거되면, 사전 따뜻하게 0.05% 트립신-EDTA 용액의 5mL을 추가하여 세포의 전체 표면을 커버하고 37°C에서 6-8분 동안 세포를 배양하고 5%CO2에서세포를 배양할 수 있도록 한다. 플라스크를 부드럽게 탭하여 플라스크 바닥에서 세포를 빼내고 DMEM 세포 배양 배지 5mL(보충제)를 추가하여 트립신 효소를 중화시합니다. 셀 서스펜션을 50mL 원심분리관으로 옮기고 세포 현탁액을 완전히 분리되도록 셀 서스펜션을 위아래로 철저히 전달합니다. 희석된 셀 현탁액을 5분 동안 230 x g로 원심분리합니다. DMEM 세포 배양 배지의 25mL에서 상체를 소독제로 폐기하고 세포 펠릿을 다시 중단하십시오(보충제). 세포 현탁액을 75cm2 일회용 세포 배양 플라스크로 옮기고 37°C및 5%CO2에서 3일 동안 더 구배한 후 스페로이드 제제를 진행한다. HepG2s가 적응하고 다시 한번 ~80%의 합류에 도달하면 스페로이드 파종에 대비하여 세포 농도를 결정합니다. 2. HepG2 스페로이드 제제 상술한 서브배양스 단계는 원심분리 후를 제외하고, 37°C 수조에서 미리 따뜻하게 된 DMEM 배양 배지의 1mL에서 셀 펠릿을 다시 중단한다. 파이펫 셀 서스펜션을 위아래로 철저히 유지합니다. Trypan Blue 제외 분석(OSHA SOP 3.21 생식 독소, 뮤타겐, 테라토겐 및 배아독신 참조- 안전 취급 및 저장 절차(2019) 및 건강 및 안전 지침을 위한 절차 참조)를 사용하여 세포 생존가능성 점수 매기기 0.4% 사전 필터링된 셀 서스펜션의 1:1 비율로 사용됩니다. 세포 계수에 앞서, 1mL 주사기를 사용하여 Trypan 블루 용액 1mL을 복용하고 0.45 μm 필터 유닛을 사용하여 멸균 튜브, 1mL 튜브에 넣습니다. 여과된 10 μL의 트리판 블루 용액을 0.2mL 튜브로 옮기고 셀 서스펜션 10μL을 추가합니다. 남은 여과 된 Trypan 블루 용액은 향후 사용을 위해 실온에서 최대 3개월까지 보관할 수 있습니다. 70% 에탄올로 혈성계를 철저히 뿌리고 멸균 종이 타월로 닦아 호흡 증기를 사용하여 상단의 커버슬립을 고정하십시오. 숨이 멎을 듯한 표면을 가로질러 커버슬립을 미끄러지면 뉴턴 링을 생성하여 응집력을 유도합니다. 혈액 세포계에 10 μL을 추가하기 전에 1000 μL 파이펫 (깎아 지른듯한 스트레스를 줄이기 위해)을 사용하여 Trypan 블루 셀 서스펜션을 위아래로 부드럽게 피펫합니다. 용액이 덮개 슬립 아래에 분산되어 있고 기포없이 전체 그리드를 덮는지 확인합니다. 그림 1: 혈액 세포계를 사용하여 셀을 계산합니다. 셀을 계산할 사분면강조되는 혈모세포계의 다이어그램 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 현미경하에서, 4개의 큰 코너사각형(그림 1)에서발견되는 살아있는(염색되지 않은) 및 죽은(스테인드 블루) 세포를 세는다. 카운트에서 큰 모서리 사각형(즉, 선에)의 내부 두 모서리에 겹치거나 앉는 것으로 밝혀진 셀은 제외합니다. 다음 계산을 사용하여 샘플에 존재하는 라이브 실행 가능한 셀(스테인드)의 평균 수를 계산합니다.셀/mL = 라이브 셀 카운트 x x 10,000의 총 수희석은 Trypan blue(이 경우 2배)에서 주식 용액이 희석된 횟수를 의미하며, #는 계산된 혈모세포계의 4개의 큰 코너 사각형을 말합니다. 실행 가능한 HepG2 셀 수에 따라 다음 수식을 사용 하 여:C1V1=C2V2여기서 C1 = 현재 실행 가능한 세포의 농도,V1 = 현재 셀 서스펜션의 부피,C2 = 세포 현탁액의 농도가 원하고,V2 = 셀 서스펜션의 부피가 원함 20 μL 매달려 낙하당당 4000 HepG2 세포를 달성하기 위해 DMEM 세포 배양 배지로 HepG2 세포 현탁액의 10mL 스톡 솔루션을 2.0 x 105 셀/mL 농도로 준비한다. 모든 셀이 미디어 내에서 완전히 중단되도록 1000 μL 파이펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 셀 서스펜션을 완전히 혼합합니다. 96웰 세포 배양 판의 우물에 100 μL의 멸균, 실온 PBS를 추가하여 배양 중에 매달려 방울이 건조되는 것을 방지합니다. 표준 평면 바닥 96웰 세포 배양판의 뚜껑을 가지고, 그것을 반전하고 조심스럽게 피펫 20 μL 뚜껑의 각 웰 홈의 중심으로 세포 현탁액의 방울, 도 2에도시된 바와 같이. 멀티 채널 파이펫을 사용하지만 여러 시드가 방울의 정확도와 배치에 영향을 줄 수 있기 때문에 한 번에 2 – 4 방울만 추가하십시오. 뚜껑에 놓인 우물의 홈 내의 방울을 중앙으로 배치한다. 그렇지 않으면 접시의 뚜껑을 뒤집어 접시에 떨어질 위험이있을 때 그들은 우물의 중앙에 매달려 있지 않습니다. 96웰 플레이트의 뚜껑을 부드럽게 뒤집기 때문에 방울이 매달려 있고 96웰 플레이트 위에 조심스럽게 놓습니다. 전체 96 웰 플레이트에 뚜껑을 37°C, 아가로즈로 옮기기 3일 전에 3일 동안 5%CO2에 부드럽게 뚜껑을 닫습니다.참고: 배판을 인큐베이터에서/로 운반할 때뿐만 아니라 과도한 움직임이 판이 바뀌거나 스페로이드가 잘못 형성될 수 있으므로 일반적으로 인큐베이터를 열고 닫을 때주의를 기울여야 합니다. 도 2: 시험관 내 3D HepG2 내의 혈청계 모델 제제. (A)20 μL로 시드된 HepG2 세포는 96웰 플레이트의 뚜껑에 떨어뜨립니다. (B)HepG2 세포는 파종 낙하 모델에서 파종 후 스페이로이드 형성을 허용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3. HepG2 스페로이드 전송 매달려 드롭에서 아가로즈 서스펜션에 참고 : 3 일째에 파종 된 방울로 파종, 스페로이드는 이전에 1.5 %의 아가로즈 젤의 미세 층으로 코팅 된 동일한 96 웰 플레이트의 우물로 전송됩니다. 플레이트 코팅 일 전에 아가로즈 젤 및 오토 클레이브 (즉, 2 일째 포스트 시드)를 준비하십시오 (즉, 3 일 포스트 시드). 1.5% 아가로즈 젤을 준비하려면 0.30 g의 아가로즈를 깨끗한 유리 병에 넣은 다음 페놀 레드 프리 DMEM 배지 20mL를 추가합니다. 멸균을 위해 230°C에서 1시간 동안 아가로즈를 오토클레이브한다. 아가로즈 코팅은 HepG2 스페로이드가 우물 의 바닥에 고착하고 3D 스페로이드 구조를 유지하는 대신 세포 단층을 형성하는 것을 방지합니다. 3일째 포스트 시드는 인큐베이터에서 HepG2 매달려 있는 드롭 스퍼로이드를 함유한 96웰 플레이트를 제거하고 뚜껑을 조심스럽게 뒤집어 스페로이드가 더 이상 매달려 있지 않도록 합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 이전에 96웰 플레이트의 베이스에 추가된 PBS의 100 μL을 제거하고 폐기합니다. 코팅을 준비하기 위해 아가로즈를 가열하는 동안 플레이트가 2-3 분 동안 공기 건조되도록하십시오.주의: 이 절차는 피부에 담그면 화상을 입고 부상을 입을 수 있는 매우 뜨겁고 액체 아가로즈가 발생합니다. 또한 액체 아가로즈가 함유 된 유리 병을 취급 할 때주의해야합니다. 이전에 준비된 1.5% 아가로즈 젤을 사용하여, 20mL 아가로즈 젤을 함유한 유리병을 최대 와트(즉, 900 W)로 전자레인지에 30s에 가열합니다. 96웰 플레이트 2개를 코팅하려면 미리 준비된 1.5% 아가로즈 젤 1.20mL 병 1병으로 충분합니다. 녹으면 유리 병을 회전시켜 거품을 제거한 다음 각 우물의 베이스에 50 μL의 아가로즈를 추가하여 아가로즈를 부드럽게 소용돌이치게 합니다.참고: 아가로즈를 추가할 때 아가로즈가 빠르게 설정되고 스페로이드 성장을 방해할 수 있는 평평한 레벨 레이어를 형성하지 않기 때문에 플레이트 >45°를 각도로 채점하지 않도록 하십시오. 플레이트가 완전히 코팅되기 전에 아가로즈가 고화되는 것을 방지하기 위해이 단계에서 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다. 플레이트가 실온에서 2분 동안 방치한 후, 각 우물의 고체 아가로즈 층 위에 100 μL의 전온DMEM 세포 배양 배지(보충제)를 첨가합니다. 96웰 플레이트의 뚜껑을 뒤집어 96웰 플레이트 위에 다시 놓아 스페로이드가 다시 한 번 매달려 있습니다. 96웰 플레이트의 개별 우물로 매달려 있는 물방울에서 스페로이드를 전송하기 위해 200 x g에서 3 분 동안 플레이트를 원심 분리합니다. 이송 후, HepG2 스페로이드는 이제 세포 배양 배지에서 중단되어야 한다. 37°C 및 5% CO2에서인큐베이터에서 24시간 동안 정착하도록 허용한다. 이 크기의 HepG2 스페로이드를 4일째 포스트 시드(예: 아가로즈 코팅 플레이트로 옮긴 후 24시간)에 화학 또는 ENM 치료에 노출시키세요. 확장된 배양 기간 동안 세포 생존가능성을 유지하기 위해 3일마다 세포 배양 배지를 새로 고칩니다. 이를 위해, 음의 표면으로부터 세포 배양 배지의 50 μL을 부드럽게 흡인시키고 DMEM 세포 배양 배지의 신선한 50 μL로 대체한다. 중간 변경을 수행할 때 스페로이드를 제거하거나 방해하지 않도록 주의하십시오. 4. 나노 물질 / 화학 적 노출 참고: HepG2 간 스페로이드 모델은 ENM 및 화학 기반 노출 정권을 모두 지원할 수 있지만 이 프로토콜의 주요 초점은 ENM 노출입니다. 노출되기 전에 시험 ENM은 적절하게 분산되어야 합니다. 이는 나노게노톡스 분산 프로토콜(보조금 계약 번호 20092101, 2018)15에의해 지시된 대로 수행될 수 있다. NanoGenoTox 분산 프로토콜에 따른 분산에 따라, ENM 현탁액을 2.56 mg/mL의 시작 농도에서 사전 데운 DMEM 세포 배양 배지에서 최종 원하는 농도로 희석(보충제 포함). 총 부피 5 mL 1 96 웰 플레이트를 투여 하는 데 필요한. HepG2 스페로이드를 화학 물질 또는 ENM에 노출시키기 위해, 200 μL 파이펫을 사용하여 각 우물의 표면으로부터 세포 배양 배지의 50 μL을 흡인(50 μL을 남기고 스페로이드를 방해하지 않도록) 필요한 용량으로 시험 독성물질을 함유하는 50 μL 배지로 대체한다. 시험 재료가 적용되면, 37 °C 및 5 % CO2에서원하는 노출 시간에 대한 플레이트를 배양한다. 장기(≥24h) 노출 정권이 실시되면, 원하는 노출 기간이 경과한 직후, 아래에 설명된 바와 같이 마이크로핵 엔드포인트 분석을 위한 스페로이드를 수확하여 6.1–6.4단계에서 설명한 바와 같이 한다. 그러나 급성 노출 정권(예를 들어, ≤24h)을 사용하면 노출 기간이 끝나면 96웰 플레이트에서 각각의 우물에서 50μl의 수퍼나티를 저장하여 나중에 추가생화학적 분석을 하였다. 세포 배양 배지를 Cytochalasin B의 6 μg/mL을 포함하는 신선한 배지의 50 μL로 대체하고 사이토카네시스 블록 미세핵 분석 수확에 대비하여 1 – 1.5 세포 주기 (즉, 24 – 26 h HepG2용 26 시간)에 대한 배양에 맡깁니다.참고: 급성(≤24h) 노출 정권의 경우, 사이토샬라신 B를 사용하는 사이토카네시스 블록 미세핵 분석이 적용될 수 있지만 장기(≥24h) 노출 정권의 경우, 분석의 단핵 버전(Cytochalasin B 제외)은 도 4에설명된 바와 같이 활용되어야 한다. 5. HepG2 스페로이드 수확 참고: 화학 적 또는 ENM 노출 치료에 따라, 세포 배양 배지 또는 스페로이드 조직 모두 여러 엔드포인트 분석을 위해 수확 될 수있다. 종점 분석에 따라, 스페로이드는 개별적으로 수확할 수 있습니다 (예를 들어, 이미지 분석을 위해) 또는 함께 풀로 풀 (예를 들어, 사이토 카네시스 블록 미세 핵 분석). 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거합니다. 200 μL 파이펫을 사용하여 각 우물에서 스페로이드 조직을 포함하는 세포 배양 배지의 100 μL을 흡인하고 멸균, 15mL 원심분리기 튜브로 수집한다. 아가로즈와의 접촉을 피하기 위해 주의하십시오. 수집한 후, 스페로이드 서스펜션을 230 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상체를 제거하고 -80°C에 저장하여 나중에 추가 종점 분석(예를 들어, 간 기능 검사)을 추가로 검사합니다. 멸균, 실온 PBS (1 x)의 1 mL에서 스페로이드의 펠릿을 다시 중단합니다. 세척한 후, 3분 동안 230 x g에서 스페로이드 서스펜션을 다시 원심분리합니다. 상체를 버리고, 0.05% 트립신-EDTA 용액의 500 μL에서 다시 중단하고 37°C및 5% CO2에서6-8분 동안 배양한다. 배양 후, 트립시화 된 세포를 위아래로 부드럽게 피펫하여 DMEM 세포 배양 배지의 1 mL로 중화하기 전에 HepG2 세포를 완전히 분리하고 다시 중단합니다. 희석된 셀 현탁액을 5분 동안 230 x g로 원심분리합니다. 상온 PBS(1x)의 2mL에서 상체를 소독제로 폐기하고 세포 펠릿을 다시 중단한다. 5 분 동안 230 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상체를 소독제로 폐기한 다음 감기 PBS(1x)의 2mL에서 다시 한 번 세포 펠릿을 다시 중단한다. 현미경 슬라이드에 장착 할 때 시야를 가리는 세포의 덩어리를 방지하기 위해 세포가 잘 분산되어 있는지 확인하십시오. 6. 미세 핵 분석 및 점수 마이크로뉴클레우스 분석의 수동 방법에 대해, 세포원심분리기는 현미경 슬라이드의 중심에서 세포도(정의된, 집중된 세포 영역)를 생성하는 데 요구된다. 이 프로세스는 셀이 널리 퍼질 수 있는 전체 슬라이드를 평가하는 것과 는 달리 득점자가 관심 있는 세포를 쉽게 찾을 수 있기 때문에 슬라이드의 보다 효율적인 점수를 지원합니다. 70% 에탄올에 서리가 내린 현미경 슬라이드(용량당 3회)를 찍어 ddH2O로 찍어 5분 동안 공기 건조상태로 둡니다. 3A에도시된 바와 같이 준비된 현미경 슬라이드를 큐벳 깔때기로 배치하여 유리 슬라이드(iii)가 필터 카드(ii)와 큐벳 깔때기(i)를 상단에 고정하여 금속 지지대(iv)에 배치한다. 깔때기를 향한 사이토센심분리기의 큐벳 깔때기를 정렬하므로 100 μL의 셀 서스펜션을 각 에 직접 첨가할 수 있습니다. 세포가 슬라이드 표면에 균등하게 분포되도록 500 x g에서 5 분 동안 사이토 스핀. 도 3: 현미경 슬라이드에 처리 된 세포를 준비하는 사이토스핀 설정. (A)개별 구성 요소를 표시, (i) 큐벳 깔때기, (ii) 필터 카드, (iii) 유리 현미경 슬라이드 및 (iv) 금속 지지는 현미경 슬라이드에 사이토 스핀 HepG2 세포를 필요로한다. (B)최종 큐벳 깔때기 설정. (C)사이토센심분리기 내의 큐벳 깔때기의 올바른 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 차가운 얼음에 고정하기 전에 공기 건조에 슬라이드를 두고, 10 분 동안 90 % 메탄올. 일단 고정되면, 최대 6 개월 동안 -20 °C에 저장하기 전에 실온에서 밤새 건조 슬라이드를 둡니다. 필요한 경우- -20°C 냉동고에서 미리 준비된 현미경 슬라이드를 제거하고 Giemsa 염색을 착수하기 전에 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다.주의: 규정(EC) 제1272/2008 [CLP]에 따르면, Giemsa 염색 용액은 삼킨 경우 독성이 있고 눈, 피부 또는 흡입시 손상을 일으킬 수 있는 고인화성 액체입니다. 사용하기 전에 이 화학 물질에 대한 자세한 저장, 취급 및 건강 및 안전 조언을 위해 관련 SDS 시트를 참조하십시오. 슬라이드가 해동되는 동안, 인산파제 버퍼(pH 6.8)에서 희석된 20% Giemsa 염색 용액(염색~30슬라이드에 필요한 25mL)을 준비한다. 깔때기에 놓인 접힌 필터 용지를 사용하여 필터링하기 전에 용액을 부드럽게 소용돌이시켜 철저히 섞습니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 각 슬라이드의 사이토도트에 3 – 5 방울의 여과 된 지름사 용액을 추가하고 8 – 10 분 동안 둡니다. 두 개의 연속된 포스파타제 버퍼 세척으로 슬라이드를 세척한 후 차가운 물 에서 잠시 헹구어 남은 여분의 얼룩을 제거합니다. 슬라이드를 공기 건조상태로 둡니다. 일단 건조, 연기 후드에, 사이토도의 중심에 장착 매체의 드롭을 추가하기 전에 10 초에 자일렌에 스테인드 슬라이드를 찍어 상단에 유리 커버 슬립을 배치. 수동 점수 매기기 전에 건조 하룻밤 연기 후드에 현미경 슬라이드를 두고; 그들은 실온에서 무기한 으로 보관 할 수 있습니다. 7. 데이터 분석 OECD 시험 지침 487 (2014)11에설명된 바와 같이, ENM 또는 화학 물질에 노출된 결과로 유도된 DNA 손상을 평가하고 정량화하기 위해, 2000개의 단핵또는 1000개의 이중핵세포를 생물학적 복제당 1000개의 이중핵세포를 사용하여 마이크로뉴클레오니의 존재를 위해 점수를 매기는 것으로 나타났다. 그림 4: 미세 핵 분석 점수 결정 트리. 급성 또는 장기 노출 정권에 따라 3D 모델로 미세 핵 분석술을 사용할 때 다른 채점 및 세포 독성 평가 절차의 필요성을 강조하는 회로도 의사 결정 트리. 급성 (≤24 h) 노출은 세포역학 차단 미세 핵 분석의 사용을 허용, 장기 (≥24 h) 노출은 분석의 단일 핵 버전을 필요로하는 동안; 둘 다 OECD 시험 지침 487에 기술되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 득점된 단핵 또는 이중핵 세포의 수당 존재하는 미세핵의 비율에 기초하여, 유전체 독성 값의 백분율을 계산합니다. 관찰된 DNA 손상을 평가하기 위해서는 세포 세포의 높은 비율에 의한 세포 이물질의 결과와 함께 세포 독성을 측정하십시오. 이 경우 Cytochalasin B의 존재에 따라 CPBI 또는 RVCC 계산(그림 4에설명된 대로)을 사용합니다. 유독성은 OECD 테스트 가이드라인 48711에정의된 바와 같이 세포 독성이 55% ± 미만인 샘플에서만 평가되어야 합니다.