この手順は、急性または長期の反復用量レジーム上のナノ物質暴露に関連する遺伝子毒性有害性のより生理学的に関連する評価を提供することができるインビトロで高度な3D肝培養物を開発するために使用されるように確立された。
多様なエンジニアリングナノ材料(ENM)の急速な開発と実装により、ENMへの暴露は避けられず、堅牢で予測的なインビトロ試験システムの開発が不可欠です。肝臓は代謝性恒常性および解毒に重要な役割を果たすだけでなく、ENM蓄積後の暴露の主要な部位であるため、肝臓毒性学はENM曝露を考慮する際に重要である。このことと、2D肝細胞モデルが生体内で観察される複雑な多細胞相互作用および代謝活性の複雑さを正確に模倣していないという理解に基づいて、生体外でのENMハザード評価目的に合わせた生理学的に関連する3D肝モデルの開発に大きな焦点が当てられています。動物実験を置き換え、低減、改良する3Rの原理に沿って、3D HepG2細胞株ベースの肝臓モデルが開発され、拡張および繰り返しENM暴露体制(≤14日)の両方をサポートできるユーザーフレンドリーで費用対効果の高いシステムです。これらのスフェロイドモデル(直径500μm≥)は、増殖能力(すなわち、細胞モデルの分割)を保持し、体外での遺伝毒性を効果的に評価するために「ゴールドスタンダード」マイクロ核アッセイと結合することができます。毒性学的エンドポイントの範囲(例えば、肝機能、(プロ)炎症反応、細胞毒性および遺伝毒性)の両方にわたっていくつかのEnMを使用して、急性(24時間)および長期(120時間)曝露療法を報告する能力が特徴付けられている。この3D in vitro肝モデルは、より現実的なENM暴露を評価するために利用される能力を有し、それによってENMハザード評価をより適切にサポートするための将来のin vitroアプローチを提供し、ルーチン的かつ容易にアクセス可能な方法でENMハザード評価を提供する。
人間ベースのアプリケーション(食品、化粧品、衣料品、スポーツ用品、電子機器、輸送、医薬品など)を通じて、多様なエンジニアリングナノ材料(ENM)の急速な開発と実装により、人間が定期的にENMにさらされることは避けられません。これにより、これらの材料が多数の用途で有利であると考える新しいサイズ固有のフィジオ化学的特性が、人間の健康と環境に付随する悪影響を引き起こす可能性があるという懸念が高まっている。現在、多くの国際的な活動は、積極的にこれらのENMへのより生理学的に関連する暴露を反映し、急性、長期、および繰り返し低用量暴露シナリオにわたってこれらの材料の潜在的な毒性を評価するために実施されています。
肝毒性学は、ENM曝露を考慮する際に重要であり、肝臓が曝露後のENM蓄積の主要部位であることを広く知られている1,2。また、肝臓は全身循環に入る物質の代謝と解毒のための第一次臓器系である。2D肝細胞モデルは、複雑な多細胞相互作用の複雑さを正確に模倣しない、または生体内で観察される代謝活性を適切に表さないという受け入れられた理解に基づいて、生体内代替技術のための堅牢で生理学的に関連する3D肝モデルの開発に大きく焦点を当てて4,5が確立されている。高度な3D培養技術を利用することで、インビトロ肝モデルの寿命が向上し、長期にわたる反復暴露体制の調査が可能になります。さらに、この高度な培養フォーマットは、胆汁カナリキュリ、活性トランスポータープロセスおよび改良されたCYP450薬物代謝能力などの強化された生理学的、organotypicの特徴の形成を促進し、モデル6の予測性を向上させる。現在の3Dインビトロ肝モデルは、単一培養物(肝細胞のみ)または共培養(非パレンキサイト細胞を有する肝細胞)からなるいくつかの形式で存在し、 超低接着板のマイクロ組織またはスフェロイド、吊り下げドロップスフェロイド、マトリックスおよび/または足場および微小流体細胞培養プラットフォームに埋め込まれた細胞に及ぶ、それらのすべては、肝毒性評価6、7のための効果的な高度なインビトロモデルとみなされる。しかし、これらのモデルシステムの大半は、高いメンテナンス、特殊な機器を必要とし、高価です。さらに、これらのモデルは、固定DNA損傷を定量化する方法を用いた遺伝毒性試験などのハザードエンドポイントの評価における使用を妨げる静的(すなわち、非分割細胞モデル)であることが多い。遺伝毒性は、規制毒性学の中核的前提条件であり、任意の毒性物質のリスク評価の重要な構成要素である8.外因性物質への暴露後に生じる可能性のあるDNA損傷のすべての形態を定量化するために適用できる単一のアッセイはありません。しかし、インビトロ遺伝子毒性試験用電池のコア成分は、微小核アッセイであり、これは総染色体損傷9を測定する信頼性の高い多面的な技術である。これは、OECD試験ガイドライン487によって記述された金標準技術であり、インビトロDNA損傷および遺伝毒性を評価するための、および規制ハザード評価10、11のための試験電池要件の一部である。
ヒト肝細胞癌細胞株HepG2は、細胞が容易に入手可能であるように初期ハザード評価スクリーニングに広く使用され、比較的安価にソース化し、培養が容易で、高スループットスクリーニング12,13に適している。3D球形構造に培養した場合、それらは肝臓微小環境を良好に再現し、微小核アッセイ3を支持するのに十分な増殖能力を有する肝モデルを提供することが示されている。HepG2スフェロイドモデルのさらなる開発は、長期にわたる反復暴露体制(≤14日間)における遺伝毒性ハザード評価をサポートするために、モデルの長寿および肝臓様機能性を向上させるために確立された。したがって、動物実験を置き換え、低減、改良する3Rの原理に沿って、本プロトコルは、複数の毒物学的エンドポイント(例えば、肝臓機能、(炎症マーカー、細胞毒性および遺伝毒性)に続く、急性および反復的な化学的およびENM暴露を確実に評価することができる高度な3Dインビトロ肝モデルを提供するために確立された。
ここでは、急性または長期にわたるENM曝露後の遺伝毒性ハザード評価のためのインビトロモデルシステムに基づく生理的に関連する3D肝細胞細胞株を確立する方法を提示する。プロトコルは6つの重要な段階に分けることができます:凍結保存HepG2細胞を培養する。ヘプG2スフェロイド製剤;ヘプG2スフェロイド転写は、吊り下げからアガロース懸濁液へ。ヘプG2スフェロイド収穫;マイクロ核アッセイとスコアリング;データ分析を行います。
3D肝モデルの適用は、標的にされる特定の生化学的エンドポイントまたは有害な結果経路によってかなり異なる。各モデルには、一次ヒト肝細胞(PHH)モデルのドナー間変動から細胞系モデルにおけるチトクロームp450活性の低下まで、その利点と限界があるが、すべて独自の権利6、12、18、19において価値がある。遺伝毒性を評価する場合、モデルには、能動増殖が必要なため、インビトロ小核アッセイなどの規制承認エンドポイントとの適合性が制限される。遺伝子毒性評価は、DNA修復が一過性の病変を矯正する機会がある場合に細胞分裂後に評価される固定DNA損傷の定量化を必要とするため、これが必要である。残念なことに、高度に分化した肝細胞(すなわち、hepaRG)ベースのスフェロイドまたはPHHマイクロ組織は、最も生理学的に関連する肝臓様特性を示すものと考えられるが、これは静的(不増殖)モデル12、19、20を形成する。その結果、ここで提示される3D HepG2スフェロイドモデルは、遺伝毒性試験をサポートできる適切な代替モデルを提供します。HepG2細胞系スフェロイドは、アルブミンや尿素産生などの基本的な肝臓様特性を維持しながら、スフェロイドの外表面に十分な積極的に細胞を分割し、CYP450活性5、12、19を有する。このインビトロ肝モデルは、この小核アッセイを補完するために開発されており、これは、遺伝毒性試験8、10、11、21の電池で推奨される2つのインビトロアッセイのうちの1つである。しかし、このモデルはDNAシーケンシング解析および遺伝子発現(RNA)技術に容易に適用することができ、彗星アッセイのような他のDNA損傷エンドポイントにさらに適応して利用される可能性がある。しかし、一部のエンドポイント解析において、ENM干渉が果たす役割を考慮することが重要です。例えば、フローサイトメトリーベースの解析は、特に粒子干渉22によるENM遺伝子毒性評価には適さない場合がある。
細胞分裂を活発に行うスフェロイドモデルの制限要因の1つは、その大きさです。シード密度の最適化は、モデルが増殖し続ける十分なセルが必要であるため、重要です。しかし、あまりにも高い細胞数, スフェロイドが過度にコンパクトになる結果, 壊死コアの増加につながります.この壊死の原因は、酸素および栄養拡散を制限していると考えられており、この拡散の限界は、組織23、24の約100〜150μmであると考えられている。しかし、これは細胞型、細胞数、足場相互作用および培養条件25に依存する。以来、直径約700μmがC3Aスフェロイドの中心における壊死の早期発症を避けるための限界であることを示されており、スフェロイド当たり4000HepG2細胞を播種すると、露光時のモデルの直径が≤500μm26であることを保証する。さらに、Shah et al. は、ヘプG2細胞が球状体1個当たり5000細胞を超える播種が培養7日後に生存率の25%減少を示したことを確立した。これを克服するために、本プロトコルで考案されたモデルは、スフェロイドの初期形成に続いて、吊り下げ低下がアガロース被覆井戸に移される重要なステップを経る。これにより、スフェロイド内で増え続ける細胞数を維持するために、より多くの培養培地が存在することを保証する。その結果、HepG2スフェロイドモデルは培養で10日後に70%以上生存し続け、インビトロでの長期ハザード評価に利用することができる。
HepG2スフェロイドモデルは急性および長期の曝露レジーレジーをサポートできるが、培地の完全な置換がスフェロイドの潜在的な損失のために推奨されないとして、培養期間中の細胞培養培地のリフレッシュは、このモデルに対して制限される。ENM露光では、均質なENM分散液が凝集・沈殿する傾向が高いと推測されます。しかし、ENM堆積物が粒子パラメータ(例えば、大きさ、形状および密度)に応じて変化し得る速度は、IN体外沈下、拡散および線量測定(ISDD)モデル、またはその最近の誘導体を使用して理論的に決定できることが注目に値する。この心を用いて、細胞培養液の50%のみが細胞培養の表面から慎重に除去されれば、ENM用量の破壊およびその後の除去は理論的には最小限に抑えられるべきである。しかし、ブラウン運動が遊びで、これは厳密にはそうではないかもしれないし、テストされる各特定のENMの堆積および沈下へのさらなる作業は、長期的な暴露体制27を通じて正しい量体測定が保持されることを確実にするために行われるべきである。主に、これは最終的な蓄積された濃度に不可欠である可能性があり、繰り返し投ずる体制を実行する際に考慮すべき潜在的な制限です。一方、化学物質ベースの暴露は、考慮すべき独自の制限がないわけではないが、化学物質が溶液中に残る傾向があり、新たに添加された濃度に加えて元の化学物質濃度を直接交換するという点でより単純なアプローチを提供し、メディアリフレッシュ中に失われた化学物質をそれに応じて29に置き換えることを保証する。将来の応用には、特定の臓器系が異種生物物質の生物蓄積によって誘発される副作用を改善または克服する能力を評価するために、長期培養期間にわたる反復暴露体制に対するモデルの適合性を評価することが含まれる。
結論として、この3Dインビトロ肝モデルは、現実的な暴露シナリオの範囲を評価するために利用される能力を有し、それによってENMと化学的ハザード評価の両方をより良くサポートするための将来のインビトロアプローチをルーチンで容易にアクセス可能な方法で提供する。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、この研究が補助金契約No.760813の下で、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムから資金を受け取っていることを認めたいと思います
Aflotoxin B1 | Sigma Aldrich, UK | A6636-5MG | |
Agarose | Sigma Aldrich, UK | A9539-50G | |
Autoclave Tape | |||
BCG Albumin Assay | Sigma Aldrich, UK | MAK124 | |
Bovine Serum Albumin Powder | Sigma Aldrich, UK | A9418 | |
Cell Freezing Aid | Thermo Fisher Scientific, UK | 5100-0001 – Mr Frosty | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Cytochalasin B | Merck, UK | 250233 | |
Cytology Metal Clips | |||
Cytospin 4 Centrifuge | ThermoFisher Scientific, UK | CM00730202 | |
DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine | GIBCO, Paisley, UK | 41965-039 | |
DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes | GIBCO, Paisley, UK | 21063-029 | |
DPX Mounting Medium | FisherScientific, UK | D/5330/05 | |
Ethanol | FisherScientific, UK | 10048291 | |
FBS | GIBCO, Paisley, UK | 10270-106 | |
Filter Cards for Shandon Cytospin | FisherScientific, UK | 15995742 | |
Frosted Glass Slides | ThermoFisher Scientific, UK | ||
Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr | VWR Chemicals, UK | MFCD00081642 | |
Glass Coverslips (24 x 60) | Deckglaser, VWR | ECN631-1575 | |
Haemocytometer and Coverslip | |||
Immersion Oil for Microscope | Zeiss, UK | 518F, ISO8034 | |
Laminar Class II Tissue Culture Hood | Scanlaf Mars | ||
Light Microscope | Zeiss, UK | Axiovert 40C | |
Liquid Nitrogen | |||
Methanol | FisherScientific, UK | 10284580 | |
Microwave | |||
Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips | Greiner-Bio-One, UK | ||
NuncMicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific, Denmark | 167008 | |
P1000 and P200 micropipettes | |||
P300 and P50 multi-channel pipettes | |||
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free | GIBCO, Paisley, UK | 14190-094 | |
Pen/Strep | GIBCO, Paisley, UK | 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml | |
Phosphatase Buffer Tablets | GIBCO, Paisley, UK | 10582-013 | |
Pipette Boy | |||
Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges | FisherScientific, UK | 11690581 | |
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe | Branson, USA | 101-063-971R | |
T-25 and T-75 Tissue Culture Flask | Greiner-Bio-One, UK | T-25 (690175) and T-75 (660175) | |
Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich, UK | T8154-100mL | |
Urea Assay Kit | Sigma Aldrich, UK | MAK006 | |
Virkon Disinfectant | DuPont, UK | Rely+On Virkon | |
Water Bath (37˚C) | Grant JBNova 18 | ||
Weighing Balance | |||
Xylene | FisherScientific, UK | 10588070 | |
0.05% Trypsin-EDTA | GIBCO, Paisley, UK | 5300-054 | |
0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
0.45µm Filter Unit | Millex HA, MF-Millipore, UK | SLHA033SS | |
1.0mL Syringe | BD Plastipak, FisherScientific, UK | 300185 | |
20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps | DWK Life Sciences GmbH, Germany | WHEA986581 | |
37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator | NUAIRE DHD Autoflow | ||
3mL Pasteur Pipette | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL Conical Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL or 100mL Glass Bottles | |||
50mL Skirted Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
5mL, 10mL and 25mL Pipettes | Greiner-Bio-One, UK | ||
9.4cm Square, Petri Dish | Greiner-Bio-One, UK | 688161 |