JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

लंबी अवधि के नैनोमैटेरियल एक्सपोजर के बाद इन विट्रो जेनोटॉक्सिसिटी परीक्षण के लिए उन्नत 3डी लिवर मॉडल

Published: June 05, 2020
doi:
10.3791/61141
, , , , , ,
1In vitro Toxicology Group,Swansea University Medical School

Summary

इस प्रक्रिया को विट्रो में उन्नत 3 डी हेपेटिक संस्कृतियों को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए स्थापित किया गया था, जो एक तीव्र या दीर्घकालिक, दोहराया खुराक व्यवस्थाओं दोनों पर नैनोमैटेरियल एक्सपोजर से जुड़े जनोत्जी खतरों का अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक आकलन प्रदान कर सकता है।

Abstract

इंजीनियर नैनोमैटेरियल्स (ईएनएम) की विविध सरणी के तेजी से विकास और कार्यान्वयन के कारण, एनएम के संपर्क में अपरिहार्य है और मजबूत, भविष्य कहनेवाला इन विट्रो परीक्षण प्रणालियों का विकास आवश्यक है। एचईएम एक्सपोजर पर विचार करते समय हेपेटिक टॉक्सिकोलॉजी महत्वपूर्ण है, क्योंकि यकृत मेटाबोलिक होमोसेस्टेसिस और विषहरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और साथ ही एनएम संचय पोस्ट एक्सपोजर की एक प्रमुख साइट है। इसके आधार पर और स्वीकार की गई समझ के आधार पर कि 2डी हेपेटोसिटे मॉडल वीवो में देखी गई जटिल बहु-सेलुलर इंटरैक्शन और मेटाबोलिक गतिविधि की जटिलताओं की सटीक नकल नहीं करते हैं, विट्रो में एनएम जोखिम आकलन उद्देश्यों के अनुरूप शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी जिगर मॉडल के विकास पर अधिक ध्यान केंद्रित किया जाता है। पशु प्रयोग को बदलने, कम करने और परिष्कृत करने के लिए 3Rs के सिद्धांतों के अनुरूप, एक 3D HepG2 सेल-लाइन आधारित जिगर मॉडल विकसित किया गया है, जो एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, लागत प्रभावी प्रणाली है जो विस्तारित और दोहराया ENM जोखिम व्यवस्था (≤14 दिनों) दोनों का समर्थन कर सकता है । ये गोलाकार मॉडल (व्यास में ≥500 माइक्रोन) अपनी प्रजनन क्षमता (यानी, सेल मॉडल को विभाजित करने) को बनाए रखते हैं, जिससे उन्हें विट्रो में जीनोक्सीसिटी का प्रभावी ढंग से आकलन करने के लिए ‘गोल्ड स्टैंडर्ड’ माइक्रोन्यूक्लिस परख के साथ मिलकर बनाने की अनुमति देता है। विषाक्तता के अंत बिंदुओं (जैसे, यकृत समारोह, (समर्थक-) भड़काऊ प्रतिक्रिया, साइटोटॉक्सिकिटी और जनोटेक्सिटी) पर रिपोर्ट करने की उनकी क्षमता को तीव्र (24 एच) और दीर्घकालिक (120 एच) एक्सपोजर व्यवस्थाओं दोनों में कई एनएम का उपयोग करके चित्रित किया गया है। इस 3 डी इन विट्रो हेपेटिक मॉडल में अधिक यथार्थवादी एनएम एक्सपोजर का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली क्षमता है, जिससे एक नियमित और आसानी से सुलभ तरीके से एनएम जोखिम मूल्यांकन का बेहतर समर्थन करने के लिए भविष्य में इन विट्रो दृष्टिकोण प्रदान किया जा सके।

Introduction

मानव-आधारित अनुप्रयोगों (जैसे, भोजन, सौंदर्य प्रसाधन, कपड़े, खेल उपकरण, इलेक्ट्रॉनिक्स, परिवहन और चिकित्सा) की अधिकता में इंजीनियर नैनोमैटेरियल्स (एनएम) की एक विविध सरणी के तेजी से विकास और कार्यान्वयन के कारण, यह अपरिहार्य है कि मनुष्यों को नियमित आधार पर एनएम के संपर्क में किया जाएगा। इसके साथ, इस बात की चिंताएं बढ़ रही हैं कि उपन्यास, आकार विशिष्ट फिजियो-रासायनिक विशेषताएं जो इन सामग्रियों को कई अनुप्रयोगों में लाभप्रद समझे हैं, मानव स्वास्थ्य और पर्यावरण पर समान रूप से प्रतिकूल प्रभाव पैदा कर सकती हैं। वर्तमान में कई अंतरराष्ट्रीय गतिविधियों जगह में सक्रिय रूप से इन ENM के लिए और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक जोखिम को प्रतिबिंबित और तीव्र, दीर्घकालिक, और दोहराया कम खुराक जोखिम परिदृश्यों पर इन सामग्रियों की संभावित विषाक्तता का आकलन कर रहे हैं ।

ENM एक्सपोजर पर विचार करते समय हेपेटिक टॉक्सिकोलॉजी महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह व्यापक रूप से ज्ञात है कि यकृत एनएम संचय पोस्ट एक्सपोजर1,2की एक प्रमुख साइट है। इसके अलावा, यकृत मेटाबोलिज्म और सिस्टमिक सर्कुलेशन3में प्रवेश करने वाले पदार्थों के विषहरण के लिए प्राथमिक अंग प्रणाली है। स्वीकार्य समझ के आधार पर कि 2डी हेपेटोसाइट मॉडल जटिल बहुकोशिकीय बातचीत की जटिलताओं की सटीक नकल नहीं करते हैं या वीवो में मनाए गए मेटाबोलिक गतिविधि का उचित प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, वीवो स्थानापन्न प्रौद्योगिकियों में के लिए मजबूत और शारीरिक रूप से प्रासंगिक इन विट्रो 3 डी लिवर मॉडल विकसित करने में अधिक ध्यान केंद्रित किया गया है4,5। उन्नत 3 डी संस्कृति प्रौद्योगिकियों का उपयोग लंबी अवधि के लिए अनुमति देने वाले इन विट्रो हेपेटिक मॉडल की दीर्घायु में सुधार करता है, बार-बार एक्सपोजर व्यवस्थाओं की जांच की जानी चाहिए। इसके अतिरिक्त, यह उन्नत संस्कृति प्रारूप बढ़ाया शारीरिक, ऑर्गेनोटिक सुविधाओं जैसे पित्त कैनालिकुली, सक्रिय ट्रांसपोर्टर प्रक्रियाओं और बेहतर CYP450 दवा चयापचय क्षमताओं के गठन को बढ़ावा देता है, इस प्रकार मॉडल 6 की परव्यक्तता में सुधारहोताहै। मोनो-संस्कृतियों (केवल हेपेटोसाइट्स) या सह-संस्कृतियों (नॉनपरेन्चिमल कोशिकाओं के साथ हेपेटोसाइट्स) से मिलकर वर्तमान 3 डी इन विट्रो हेपेटिक मॉडल कई प्रारूपों में मौजूद हैं, अल्ट्रालो आसंजन प्लेटों में माइक्रोटिस्यूज या स्फेरॉइड से लेकर, हैंगिंग ड्रॉप स्पेरोइड्स, मैट्रिस और/या मचान और माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर प्लेटफॉर्म्स में एम्बेडेड कोशिकाएं, जिनमें से सभी को हेपेटिक विषाक्तता आकलन6, 7के लिए प्रभावी उन्नत इन विट्रो मॉडल मानाजाताहै । हालांकि, इन मॉडल प्रणालियों के बहुमत उच्च रखरखाव कर रहे हैं, विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और महंगे हैं । इसके अलावा, ये मॉडल अक्सर स्थिर होते हैं (यानी, गैर-विभाजित सेल मॉडल) जो खतरे के अंत बिंदुओं के आकलन में उनके उपयोग को रोकता है, जैसे कि जीनोटॉक्सिकिटी परीक्षण तरीकों का उपयोग करना जो निश्चित डीएनए क्षति की मात्रा निर्धारित करते हैं। जेनोटॉक्सिकिटी नियामक विष विज्ञान में एक मुख्य शर्त है, और यह किसी भी विषाक्त8के जोखिम आकलन का एक महत्वपूर्ण घटक है। कोई एक परख है कि डीएनए क्षति है कि एक बहिर्जात एजेंट के संपर्क में आने के बाद पैदा हो सकता है के सभी रूपों की मात्रा निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है । हालांकि, इन विट्रो जीनोटेक्सिटी परीक्षण बैटरी का एक मुख्य घटक माइक्रोन्यूक्लियस परख है, जो एक विश्वसनीय और बहुआयामी तकनीक है जो सकल गुणसूत्र क्षति9को मापता है। यह ओईसीडी टेस्ट गाइडलाइन 487 द्वारा विट्रो डीएनए क्षति और जनोत्तनी का आकलन करने के लिए वर्णित एक स्वर्ण मानक तकनीक है और यह नियामक जोखिम आकलन10,11के लिए परीक्षण बैटरी आवश्यकता का हिस्सा है।

मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइन, हेपजी 2, प्रारंभिक जोखिम मूल्यांकन स्क्रीनिंग के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि कोशिकाएं आसानी से उपलब्ध हैं, स्रोत के लिए अपेक्षाकृत सस्ती, संस्कृति के लिए सरल और उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग12,13के लिए उत्तरदायी हैं। जब 3 डी गोलाकार संरचनाओं में सुसंस्कृत, वे जिगर माइक्रोएनवायरमेंट अच्छी तरह से पुनर्पूंजीकरण और पर्याप्त प्रसार क्षमताओं के साथ एक हेपेटिक मॉडल की पेशकश करने के लिए माइक्रोन्यूक्लिस परख3का समर्थन दिखाया गया है । दीर्घकालिक, दोहराए गए एक्सपोजर शासनों (≤14 दिनों) पर जनोत्तनी जोखिम आकलन का समर्थन करने के लिए मॉडल की दीर्घायु और जिगर जैसी कार्यक्षमता में सुधार करने के लिए हेपजी2 स्फेरॉइड मॉडल का और विकास स्थापित किया गया था। इस प्रकार, 3Rs के सिद्धांतों के अनुरूप बदलने के लिए, पशु प्रयोग को कम और परिष्कृत करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल एक उन्नत 3 डी इन विट्रो हेपेटिक मॉडल प्रदान करने के लिए स्थापित किया गया है जो कई विषाक्तता अंत बिंदुओं (जैसे, यकृत कार्यक्षमता, (प्रो-)) भड़काऊ मार्कर, साइटोटॉक्सिटी और जननोतिकता) का मूल्यांकन करने में सक्षम है, तीव्र, दीर्घकालिक और दोहराया गया रासायनिक और एनएम एक्सपोजर एक नियमित और आसानी से सुलभ तरीके से।

यहां, हम तीव्र या दीर्घकालिक, दोहराए गए एनएम एक्सपोजर के बाद जनोत्तेजक जोखिम आकलन के लिए इन विट्रो मॉडल सिस्टम आधारित शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3डी हेपेटोसाइट सेल लाइन स्थापित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल को 6 प्रमुख चरणों में तोड़ा जा सकता है: क्रायोप्रीवित हेपजी 2 कोशिकाओं को तैयार करना; हेपजी2 स्फेरॉइड तैयारी; हेपजी2 स्फेरोइड स्थानांतरण फांसी ड्रॉप से एगर उठे निलंबन के लिए; हेपजी2 स्फेरॉइड हार्वेस्ट; माइक्रोन्यूक्लिस परख और स्कोरिंग; और डेटा विश्लेषण।

Protocol

1. संस्कृति क्रायोप्रीवित हेपजी2 कोशिकाएं नोट: अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (एटीसीसी) से प्राप्त HepG2 कोशिकाओं को 1x Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में 4.5 g/L D-ग्लूकोज और एल-ग्लूटामाइन के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक के साथ पूरक में सुसंस्कृत किया गया । 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पूर्व-गर्म डीएमईएम सेल कल्चर माध्यम (पूरक सहित)। तरल नाइट्रोजन से हेपजी2 कोशिकाओं की एक शीशी निकालें और 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गल, जबकि धीरे-धीरे कोशिका निलंबन के समान विगलन के लिए अनुमति देने के लिए शीशी घूमता है। प्रदूषण की क्षमता को कम करने के लिए ओ-रिंग के ऊपर शीशी को जलमग्न न करने का ध्यान रखें। एक बार गल जाने के बाद, पानी के स्नान से शीशी को हटा दें और एक बाँझ, कक्षा द्वितीय लेमिनायर ऊतक संस्कृति हुड के नीचे रखने से पहले शीशी की बाहरी सतह को दूषित करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ उदारता से स्प्रे करें। ध्यान से एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में HepG2 कोशिकाओं के क्रायोवियल की सामग्री को पिपेट करें जिसमें पूर्व-गर्म डीएमईएम सेल कल्चर माध्यम (पूरक के साथ) का 9 एमएल होता है। 10 एमएल स्ट्रिपेट का उपयोग करके, सेल निलंबन के 10 एमएल को 25 सेमी2 डिस्पोजेबल सेल कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें और संस्कृति को 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों तक (सीडिंग से) के लिए इनक्यूबेट करें जब तक ~ 80% संकुचन उप-संस्कृति से गुजरने से पहले एक बड़ा 75 सेमी 2 डिस्पोजेबल सेल कल्चर फ्लास्क में पहुंचजाता है। एक बार 80% तक पहुंच जाने के बाद, 0.05% ट्राइपसिन/ईडीटीए समाधान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 30 मिनट के लिए पूर्व-गर्म के साथ बाँझ परिस्थितियों में उप-संस्कृति कोशिकाएं। किसी भी बिंदु पर कोशिकाओं को सूखने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए। चूंकि कोशिकाएं एक अनुयायी मोनोलेयर बनाती हैं, इसलिए मीडिया को कीटाणुनाशक अपशिष्ट बर्तन में टिप करके हटा दें। फिर तुरंत कमरे के तापमान पर रखे बाँझ 1x पीबीएस समाधान के 3 एमएल के साथ दो बार फ्लास्क को कुल्ला करके मौजूदा मीडिया के सभी निशानों को हटाने के लिए मोनोलेयर को धोएं। इसके अलावा, कीटाणुनाशक अपशिष्ट बर्तन में पीबीएस त्यागें। एक बार पीबीएस वॉश को हटा दिए जाने के बाद, कोशिकाओं की पूरी सतह को कवर करने और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 6-8 मिनट के लिए कोशिकाओं को 2% से कम करने के लिए सुनिश्चित करते हुए, पूर्व-गर्म 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान के 5 मिलील जोड़ें। फ्लास्क के नीचे से कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए धीरे-धीरे फ्लास्क पर टैप करें और फिर ट्राइप्सिन एंजाइम को बेअसर करने के लिए डीएमईएम सेल कल्चर मीडियम (सप्लीमेंट के साथ) के 5 एमएल जोड़ें। सेल निलंबन को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को पूरी तरह से असंबद्ध करने के लिए सेल निलंबन को अच्छी तरह से ऊपर और नीचे पिपेट करें। 5 मिनट के लिए 230 x ग्राम पर पतला सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें। डीएमईएम सेल कल्चर मीडियम (सप्लीमेंट के साथ) के 25mL में सुपरनिटेंट को कीटाणुनाशक और फिर से निलंबित सेल पेलेट में त्यागें। सेल निलंबन को 75 सेमी2 डिस्पोजेबल सेल कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और 5% सीओ2 को गोलाकार तैयारी से पहले 3 दिनों के लिए। एक बार हेपजी2एस के पास एक बार फिर ~ 80% की अनुकूलता तक पहुंचने और पहुंचने का समय हो गया है, तो स्फेरॉइड सीडिंग की तैयारी में सेल एकाग्रता निर्धारित करें। 2. हेपजी2 स्फेरॉइड तैयारी उप-संस्कृति कदमों को दोहराएं, अपकेंद्रित्र के अलावा, डीएमईएम संस्कृति माध्यम के 1 मिलील में सेल-पेलेट को फिर से निलंबित करें 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पूर्व-गर्म। पिपेट सेल निलंबन ऊपर और नीचे अच्छी तरह से। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन परख का उपयोग करके स्कोर सेल व्यवहार्यता (ओशा एसओपी 3.21 प्रजनन विषाक्त पदार्थ, म्यूटेजेन्स, टेराटोजेन्स और भ्रूण – स्वास्थ्य और सुरक्षा मार्गदर्शन के लिए सुरक्षित हैंडलिंग और भंडारण (2019) के लिए प्रक्रियाएं देखें)14 सेल निलंबन के 1:1 अनुपात के साथ पूर्व-फ़िल्टर 0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन। सेल काउंटिंग से पहले, 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन का 1 एमएल लें और एक बाँझ, 1 एमएल ट्यूब में 0.45 माइक्रोन फिल्टर इकाई के साथ फ़िल्टर करें। फ़िल्टर किए गए 10 माइक्रोन, ट्राइपन ब्लू सॉल्यूशन को 0.2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 माइक्रोन सेल निलंबन जोड़ें। शेष फ़िल्टर किए गए ट्राइपन ब्लू समाधान को भविष्य के उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर 3 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है। हीमोसाइटोमीटर को 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से स्प्रे करें और सांस वाष्प का उपयोग करके शीर्ष पर कवरस्लिप हासिल करने से पहले बाँझ कागज तौलिया के साथ सूखी पोंछें। सांस गीला सतह भर में कवरस्लिप फिसलने न्यूटन के छल्ले पैदा करके एकजुट बलों लाती है । हीमोसाइटोमीटर में 10 माइक्रोन जोड़ने से पहले 1000 माइक्रोल पिपेट (सरासर तनाव को कम करने के लिए) का उपयोग करके ट्राइपैन ब्लू सेल सस्पेंशन को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें। सुनिश्चित करें कि समाधान कवर स्लिप के नीचे फैलाया जाता है और हवा के बुलबुले के बिना पूरे ग्रिड को कवर करता है। चित्रा 1: हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती। एक हीमोसाइटोमीटर का आरेखीय प्रतिनिधित्व जो कोशिकाओं को गिनने के लिए चतुर्भुज है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । माइक्रोस्कोप के तहत, चार बड़े कोने वर्गों(चित्रा 1)में पाए जाने वाले जीवित (अन दाग) और मृत (सना हुआ नीला) कोशिकाओं की गणना करें। गिनती में बड़े कोने वर्गों (यानी, लाइनों पर) के आंतरिक दो किनारों पर ओवरलैप या बैठने के लिए पाए जाने वाले किसी भी कोशिकाओं को बाहर करें। निम्नलिखित गणना का उपयोग करके, नमूने में मौजूद जीवित, व्यवहार्य कोशिकाओं (अन दाग) की औसत संख्या की गणना करें:कोशिकाओं की कुल संख्या/एमएल = लाइव सेल काउंट एक्स एक्स 10,000जहां कमजोर पड़ने से यह संदर्भित होता है कि ट्राइपैन ब्लू (इस मामले में 2x) में स्टॉक समाधान को कितनी बार पतला किया गया था और गिना जाने वाले वर्गों के # हीमोसाइटोमीटर के चार बड़े कोने वर्गों को संदर्भित करता है व्यवहार्य HepG2 सेल गिनती के आधार पर और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर:C1V1=C2V2जहां सी1 = वर्तमान में व्यवहार्य कोशिकाओं की एकाग्रता,V1 = वर्तमान में सेल निलंबन की मात्रा,C2 = सेल निलंबन की एकाग्रता चाहता था,V2 = सेल निलंबन की मात्रा चाहता था 2.0 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर डीएमईएम सेल कल्चर मीडियम के साथ हेपजी2 सेल सस्पेंशन का 10 एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें ताकि 4000 हेपजी2 कोशिकाओं को प्रति 20 माइक्रोन हैंगिंग ड्रॉप प्राप्त किया जा सके। सभी कोशिकाओं को पूरी तरह से मीडिया के भीतर निलंबित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक 1000 μL पिपेट का उपयोग कर धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा सेल निलंबन अच्छी तरह से मिलाएं। एक ९६-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के कुओं के लिए, बाँझ, कमरे के तापमान PBS के १०० μL जोड़ने के लिए इनक्यूबेशन के दौरान बाहर सुखाने से फांसी बूंदों को रोकने के लिए । एक मानक फ्लैट नीचे 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के ढक्कन ले लो, यह उलटा और ध्यान से ढक्कन के प्रत्येक अच्छी तरह से नाली के केंद्र में सेल निलंबन की 20 माइक्रोन बूंदों पिपेट, के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है । एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें लेकिन एक बार में केवल 2 – 4 बूंदें जोड़ें क्योंकि कई सीडिंग बूंदों की सटीकता और प्लेसमेंट को प्रभावित कर सकती है। ढक्कन पर रखे कुओं के खांचे के भीतर बूंदों को केंद्र; अन्यथा वे कुओं के केंद्र में लटका नहीं होगा जब थाली के ढक्कन खत्म हो गया है और थाली में बंद गिरने का खतरा है । धीरे-धीरे 96-अच्छी प्लेट के ढक्कन को फ्लिप करें, इसलिए बूंदें अब लटक रही हैं और ध्यान से 96-अच्छी प्लेट के शीर्ष पर रखें। ढक्कन के साथ पूरे 96 अच्छी तरह से प्लेट को धीरे-धीरे 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें और 5% सीओ2 को 3 दिनों के लिए एगरेराइड ट्रांसफर से पहले रखें।नोट: अतिरिक्त देखभाल न केवल जब प्लेटों के परिवहन के लिए/इनक्यूबेटर से लिया जाना चाहिए, लेकिन जब खोलने और सामांय में इनक्यूबेटर बंद के रूप में अत्यधिक आंदोलन प्लेटों को स्थानांतरित करने के लिए और गोलाकार या तो गिर या गलत फार्म का कारण बन सकता है । चित्रा 2: 3डी हेपजी2 इन विट्रो स्पेरोइड मॉडल तैयार करना। (A)20 माइक्रोन में वरीयता प्राप्त हेपजी2 कोशिकाएं 96-वेल प्लेट के ढक्कन पर गिरती हैं। (ख)हैंगिंग ड्रॉप मॉडल में हेपजी2 कोशिकाओं के बाद बोने के लिए स्पेरोइड गठन के लिए अनुमति देने के लिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 3. हेपजी2 स्फेरॉइड ट्रांसफर हैंगिंग ड्रॉप से एगरेग निलंबन नोट: फांसी बूंदों में 3 पोस्ट सीडिंग के बाद, गोलाकार एक ही ९६-अच्छी तरह से थाली के कुओं में स्थानांतरित कर रहे है जिनमें से सभी पहले १.५% agarose जेल की एक ठीक परत के साथ लेपित किया गया है । प्लेट कोटिंग (यानी दिन 3 पोस्ट सीडिंग) के दिन से पहले एग्राजिंग जैल और ऑटोक्लेव (यानी दिन 2 पोस्ट सीडिंग) तैयार करें। 1.5% एगरल्ड जेल तैयार करने के लिए, 0.30 ग्राम का वजन एक साफ, कांच की बोतल में हो गया और फिर 20 एमएल फिनोल-रेड फ्री डीएमईएम माध्यम जोड़ें। नसबंदी के लिए 230 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एगरे को ऑटोक्लेव किया। एगर उठे कोटिंग हेपजी 2 स्फेरॉइड को कुओं के आधार का पालन करने और उनके 3 डी स्फेरोइड संरचना को बनाए रखने के बजाय एक सेलुलर मोनोलेयर बनाने से रोकता है। दिन 3 पोस्ट सीडिंग पर, 96-अच्छी तरह से हेपजी2 हैंगिंग ड्रॉप स्पेरोइड युक्त प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और ध्यान से ढक्कन को फ्लिप करें ताकि गोलाकार अब लटक न जाएं। एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, पीबीएस के 100 माइक्रोन को पहले 96-अच्छी प्लेट के आधार पर हटाएं और त्यागें। प्लेटों को कोटिंग की तैयारी में एगरे को गर्म करते समय 2-3 मिनट के लिए एयरड्री की अनुमति दें।सावधानी: इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप बहुत गर्म, तरल एगर उठे जो अगर त्वचा पर स्पिल्ट जल सकते हैं और चोट का कारण बन सकते हैं। इसके अलावा, तरल agarose युक्त कांच की बोतल को संभालने के दौरान देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि यह भी बहुत गर्म हो सकता है। पहले तैयार 1.5% एगर उठे जैल का उपयोग करके, अधिकतम वाट (यानी, 900 डब्ल्यू) पर माइक्रोवेव में 30 एस के लिए 20 एमएल एगर उठे जेल वाले कांच की बोतल को गर्म करें। दो 96-अच्छी प्लेटों को कोट करने के लिए, पहले से तैयार 1.5% एगर उठे जेल की एक 20 एमएल बोतल पर्याप्त होनी चाहिए। एक बार पिघल जाने के बाद, किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए कांच की बोतल को घुमाकर धीरे-धीरे एगर उठी और फिर प्रत्येक कुएं के आधार में एगर उठे के 50 माइक्रोन जोड़ें।नोट: एगर उठे को जोड़ते समय, यह सुनिश्चित करें कि प्लेट को कोण न करें और जीटी;45 ° के रूप में एगर उठे जल्दी सेट करें और एक फ्लैट, स्तर की परत नहीं बनाएंगे जो गोलाकार विकास को बाधित कर सकता है। प्लेट पूरी तरह से लेपित होने से पहले एगरे को जमना से रोकने के लिए इस स्तर पर कुशलतापूर्वक काम करना महत्वपूर्ण है। प्रत्येक कुएं में ठोस agarose परत के शीर्ष पर पूर्व गर्म DMEM सेल संस्कृति माध्यम (पूरक के साथ) के १०० μL जोड़ने से पहले कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए खड़े करने के लिए थाली की अनुमति दें । ९६-अच्छी थाली के ढक्कन फ्लिप और ९६ के शीर्ष पर वापस जगह अच्छी तरह से थाली तो spheroids अब एक बार फिर से लटक रहे हैं । 96-अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में लटकती बूंद से गोलाकार स्थानांतरित करने के लिए 200 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए प्लेट को अपकेंद्रित्र करें। स्थानांतरण के बाद, HepG2 spheroids अब सेल संस्कृति माध्यम में निलंबित कर दिया जाना चाहिए । उन्हें इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24घंटे के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें। इस आकार के हेपजी 2 स्फेरॉइड को दिन 4 पोस्ट सीडिंग (यानी, 24 घंटे के बाद एगरेड को स्थानांतरित करने के बाद रासायनिक या एनएम उपचार) के लिए बेनकाब करें। विस्तारित संस्कृति अवधि में सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, सेल संस्कृति माध्यम को हर 3 दिनों में ताज़ा करें। ऐसा करने के लिए, धीरे-धीरे सेल कल्चर माध्यम के 50 माइक्रोन को कुएं की सतह से हटा दें और डीएमईएम सेल कल्चर मीडियम के नए सिरे से 50 माइक्रोन के साथ बदलें। इस बात का ध्यान रखें कि मीडियम चेंज करते समय स्फेरॉइड को न हटाएं या परेशान न करें। 4. नैनोमटेरियल/केमिकल एक्सपोजर नोट: HepG2 जिगर spheroid मॉडल दोनों ENM और रासायनिक आधारित जोखिम व्यवस्थाओं का समर्थन कर सकते हैं, लेकिन इस प्रोटोकॉल का प्राथमिक ध्यान ENM जोखिम है । एक्सपोजर से पहले, परीक्षण एनएम को उपयुक्त रूप से फैलाया जाना चाहिए; यह नैनोजेनोटॉक्स फैलाव प्रोटोकॉल (अनुदान समझौते संख्या 20092101, 2018)15द्वारा निर्देशित के रूप में किया जा सकता है। नैनोजेनोटॉक्स फैलाव प्रोटोकॉल के अनुसार फैलाव के बाद, पूर्व-गर्म डीएमईएम सेल कल्चर माध्यम (पूरक सहित) में अंतिम वांछित एकाग्रता के लिए 2.56 मिलीग्राम/एमएल की शुरुआती एकाग्रता से एनएम निलंबन को पतला करें। एक 96 अच्छी तरह से प्लेट की खुराक के लिए 5 एमएल की कुल मात्रा की आवश्यकता होती है। हेपजी2 स्फेरॉइड को या तो रासायनिक या एनएम में बेनकाब करने के लिए, 200 माइक्रोल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं की सतह से सेल संस्कृति माध्यम के 50 माइक्रोन को एस्पिरेट करें (50 माइक्रोन को अच्छी तरह से छोड़ दें ताकि स्फेरॉइड को परेशान न किया जा सके) और आवश्यक खुराक पर परीक्षण विषाक्त युक्त 50 माइक्रोन माध्यम से प्रतिस्थापित करें। एक बार परीक्षण सामग्री लागू हो जाने के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर वांछित एक्सपोजर समय के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। यदि एक दीर्घकालिक (≥24 एच) एक्सपोजर शासन आयोजित किया जाता है, तो वांछित एक्सपोजर समय सीमा बीत जाने के तुरंत बाद, माइक्रोन्यूक्लिस एंडपॉइंट विश्लेषण के लिए गोलाकारों को फसल दें जैसा कि नीचे चरण 6.1 – 6.4 में वर्णित है। हालांकि, तीव्र एक्सपोजर शासनों (जैसे, ≤24 घंटे) के साथ, एक बार एक्सपोजर अवधि समाप्त हो जाने के बाद, फसल, पूल, और बाद में जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक कुएं से सुपरनैंट के 50μL स्टोर करें। साइटोकिन्सिस ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लिस के लिए तैयार करने में साइटोकिन्सिस ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लिस के लिए तैयार करने में 1 – 1.5 सेल चक्र (यानी, 24 – 26 h HepG2) के लिए इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ देते हैं।नोट: तीव्र (≤24 एच) एक्सपोजर व्यवस्थाओं के लिए, साइटोकिनसिस साइटोचलासिन बी के साथ माइक्रोन्यूक्लियस परख को अवरुद्ध किया जा सकता है लेकिन दीर्घकालिक (≥24 एच) एक्सपोजर शासनों के लिए, परख के मोनोन्यूक्लियर संस्करण (साइटोचलासिन बी के बिना) का उपयोग चित्र 4में नीचे वर्णित किया जाना चाहिए। 5. हेपजी2 स्फेरॉइड हार्वेस्टिंग नोट: या तो रासायनिक या ENM जोखिम उपचार के बाद, दोनों सेल संस्कृति माध्यम या गोलाकार ऊतक कई अंत बिंदु विश्लेषण के लिए काटा जा सकता है । एंडपॉइंट विश्लेषण के आधार पर, स्फेरॉइड को या तो व्यक्तिगत रूप से काटा जा सकता है (उदाहरण के लिए, छवि विश्लेषण के लिए) या एक साथ जमा किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, साइटोकिन्सिस ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लिस परख के लिए)। इनक्यूबेटर से 96-वेल प्लेट निकालें। 200 माइक्रोल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं से गोलाकार ऊतक सहित सेल संस्कृति माध्यम के 100 माइक्रोन को एस्पिरेट करें और एक बाँझ, 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में एकत्र करें। एग्जीग्ना के संपर्क से बचने का ध्यान रखें। एक बार एकत्र होने के बाद, 5 मिनट के लिए 230 x ग्राम पर स्फेरॉयड सस्पेंशन को अपकाइज करें। सुपरनेट को निकालें और बाद में आगे के एंडपॉइंट विश्लेषण (जैसे, यकृत, यकृत समारोह परीक्षण) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बाँझ, कमरे के तापमान PBS (1x) के 1 एमसीएल में स्फेरॉइड के गोली को फिर से निलंबित करें। एक बार धोए जाने के बाद, 3 मिनट के लिए 230 x ग्राम पर फिर से स्फेरॉयड सस्पेंशन को अपकाइज करें। सुपरनैंट को त्यागें, 0.05% ट्राइपसिन-ईडीटीए समाधान के 500 माइक्रोल में फिर से निलंबित करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 6-8 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, डीएमईएम सेल कल्चर मीडियम के 1 एमएल के साथ बेअसर होने से पहले हेपजी2 कोशिकाओं को पूरी तरह से असंबद्ध करने और फिर से निलंबित करने के लिए ट्राइपसिनाइज्ड कोशिकाओं को धीरे-धीरे पिपेट करें। 5 मिनट के लिए 230 x ग्राम पर पतला सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें। सुपरनिटेंट को कीटाणुनाशक में छोड़ दें और कमरे के तापमान पीबीएस (1x) के 2mL में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए 230 x g पर सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें। सुपरनिटेंट को कीटाणुनाशक में फेंकें और फिर ठंडे पीबीएस (1x) के 2 मिलील में एक बार फिर सेल पेलेट को निलंबित करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार होने पर देखने के क्षेत्र को अस्पष्ट करने वाली कोशिकाओं के झुरमुटों को रोकने के लिए अच्छी तरह से फैलाया जाता है। 6. माइक्रोन्यूक्लिस परख और स्कोरिंग माइक्रोन्यूक्लिस परख की मैनुअल विधि के लिए, माइक्रोस्कोप स्लाइड के केंद्र में एक साइटोडॉट (कोशिकाओं का एक परिभाषित, केंद्रित क्षेत्र) का उत्पादन करने के लिए एक साइटोसेंट्रफ्यूज की आवश्यकता होती है। यह प्रक्रिया स्लाइड के अधिक कुशल स्कोरिंग का समर्थन करती है क्योंकि यह स्कोरर को आसानी से ब्याज की कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, जैसा कि एक पूरी स्लाइड का मूल्यांकन करने का विरोध करता है जहां कोशिकाओं को व्यापक रूप से फैलाया जा सकता है। 70% इथेनॉल में डिफ्रॉड माइक्रोस्कोप स्लाइड (तीन प्रति खुराक) डुबकी और5मिनट के लिए सूखी हवा के लिए छोड़ दें। तैयार माइक्रोस्कोप स्लाइड को क्यूवेट कीप में रखें जैसा कि चित्र 3 एमें दिखाया गया है, जहां ग्लास स्लाइड (iii) को एक फिल्टर कार्ड (ii) और क्यूवेट कीप (i) शीर्ष पर सुरक्षित के साथ धातु समर्थन (iv) में रखा गया है। कीप के साथ साइटोसेंट्रफ्यूज में क्यूवेट फ़नल की व्यवस्था करें, इसलिए सेल निलंबन के 100 माइक्रोन को सीधे हर एक में जोड़ा जा सकता है। 500 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए साइटोस्पिन यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को स्लाइड की सतह पर समान रूप से वितरित किया जाता है। चित्र 3: माइक्रोस्कोप स्लाइड पर इलाज कोशिकाओं को तैयार करने के लिए साइटोस्पिन सेटअप। (A)व्यक्तिगत घटकों को प्रदर्शित करता है, (i) क्यूवेट कीप, (ii) फिल्टर कार्ड, (iii) ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड और (iv) धातु समर्थन माइक्रोस्कोप स्लाइड पर साइटोस्पिन हेपजी2 कोशिकाओं के लिए आवश्यक है । (ख)अंतिम क्यूवेट कीप की स्थापना की । (ग)साइटोसेंट्रफ्यूज के भीतर क्यूवेट कीप का सही प्लेसमेंट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । बर्फ-ठंड में निर्धारण से पहले हवा सूखी करने के लिए स्लाइड छोड़ दें, 10 मिनट के लिए ९०% मेथनॉल । एक बार तय होने के बाद, 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करने से पहले कमरे के तापमान पर रात भर सूखी हवा के लिए स्लाइड छोड़ दें। आवश्यकता पड़ने पर, पहले से तैयार माइक्रोस्कोप स्लाइड को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटा दें और गिमसा धुंधला करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति दें।सावधानी: विनियमन (ईसी) नंबर 1272/2008 [सीएलपी] के अनुसार, Giemsa धुंधला समाधान एक अत्यधिक ज्वलनशील तरल है जो विषाक्त हो सकता है अगर निगल लिया और आंखों, त्वचा या अगर साँस के साथ संपर्क पर नुकसान का कारण है । उपयोग से पहले इस रसायन पर विस्तृत भंडारण, हैंडलिंग और स्वास्थ्य और सुरक्षा सलाह के लिए संबद्ध एसडीएस शीट का उल्लेख करें। जबकि स्लाइड्स डिफ्रॉस्टिंग कर रहे हैं, फॉस्फेट बफर (पीएच 6.8) में पतला ~ 30 स्लाइड्स दाग करने के लिए आवश्यक 20% गिम्सा धुंधला समाधान (25 एमएल) तैयार करें। एक फ़नल में रखे मुड़ा फिल्टर पेपर का उपयोग करके फ़िल्टर करने से पहले समाधान को धीरे-धीरे घूमता करके अच्छी तरह से मिलाएं। एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक स्लाइड पर साइटोडॉट में फ़िल्टर किए गए गिम्सा समाधान की 3 – 5 बूंदें जोड़ें और 8 – 10 मिनट के लिए छोड़ दें। किसी भी अतिरिक्त दाग बचे हुए को दूर करने के लिए ठंडे पानी के नीचे संक्षेप में कुल्ला करने से पहले लगातार दो फॉस्फेट बफर वॉश में स्लाइड धोएं। स्लाइड को हवा में सूखा छोड़ दें। एक बार सूखने के बाद, एक धुएं हुड में, साइटोडॉट के केंद्र में बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ने से पहले 10 एस के लिए जाइलीन में दाग स्लाइड डुबकी और एक जगह शीर्ष पर एक ग्लास कवरलिप । मैनुअल स्कोरिंग से पहले सूखने के लिए रात भर धुएं हुड में माइक्रोस्कोप स्लाइड छोड़ दें; उन्हें अनिश्चित काल के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। 7. डेटा विश्लेषण जैसा कि ओईसीडी टेस्ट दिशानिर्देश 487 (2014)11में वर्णित है, डीएनए क्षति का आकलन करने और एक ईएनएएम या रासायनिक एजेंट के संपर्क में आने के परिणामस्वरूप प्रेरित करने के लिए, एक हल्के माइक्रोस्कोप (विसर्जन तेल के साथ 100x उद्देश्य) 2000 मोनोन्यूक्लिटेड या 1000 द्विनीय कोशिकाओं प्रति जैविक प्रतिकृति का उपयोग करें, जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है। चित्रा 4: माइक्रोन्यूक्लिस परख स्कोरिंग निर्णय पेड़। तीव्र या दीर्घकालिक एक्सपोजर व्यवस्थाओं के बाद 3 डी मॉडल के साथ माइक्रोन्यूक्लिस परख का उपयोग करते समय विभिन्न स्कोरिंग और साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन प्रक्रियाओं की आवश्यकता को उजागर करने के लिए योजनाबद्ध निर्णय पेड़। तीव्र (≤24 एच) एक्सपोजर साइटोकिन्सिस अवरुद्ध माइक्रोन्यूक्लियस परख के उपयोग की अनुमति देते हैं, जबकि दीर्घकालिक (≥24 एच) एक्सपोजर को परख के मोनोन्यूक्लियर संस्करण की आवश्यकता होती है; दोनों को ओईसीडी टेस्ट गाइडलाइन ४८७ में बताया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । मोनोन्यूक्लिड या बाइन्यूक्लिटेड कोशिकाओं की संख्या के अनुसार मौजूद माइक्रोन्यूक्लियी के अनुपात के आधार पर, जेनोटॉक्सिकिटी मूल्य के प्रतिशत की गणना करें। डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए मनाया कोशिका मलबे के परिणामस्वरूप नहीं है जो एपोटोटिक कोशिकाओं के उच्च अनुपात के कारण होता है, साथ ही साइटोटॉक्सिकिटी का उपाय करें। इस मामले में, साइटोचलासिन बी की उपस्थिति के आधार पर, सीपीबीआई या आरवीसीसी गणना (जैसा कि चित्र 4में वर्णित है) का उपयोग करें। जेनोटॉक्सिकिटी का मूल्यांकन केवल नमूनों में किया जाना चाहिए जहां साइटोटॉक्सिकिटी 5% से कम है ± 5% जैसा कि ओईसीडी टेस्ट दिशानिर्देश 48711में परिभाषित किया गया है।

Representative Results

दीर्घकालिक संस्कृति और जीनोटॉक्सिक जोखिम मूल्यांकन के लिए इस सेल-लाइन आधारित 3डी लिवर स्फेरोइड मॉडल की उपयुक्तता का मूल्यांकन संस्कृति में 14 दिनों की अवधि में मॉडल की व्यवहार्यता और यकृत जैसी कार्यक्षमता का निर्धारण करने के साथ-साथ माइक्रोन्यूक्लिस परख के लिए इसकी प्रयोज्यता के लिए बेसलाइन लक्षण वर्णन करके किया गया था। 3D HepG2 जिगर स्पेरोइड मॉडल के आधारभूत लक्षण वर्णनकिसी भी इन विट्रो विष विज्ञानी मूल्यांकन से पहले, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि 3डी हेपजी2 स्फेरॉइड ने एगरॉर्ज ट्रांसफर या केमिकल/एनएम उपचार करने से पहले ठीक से बनाया है। हैंगिंग ड्रॉप विधि का उपयोग करके उत्पादित हेपजी 2 गोलाकार आमतौर पर 2-3 दिन बाद सीडिंग (4000 कोशिकाएं/गोलाकार) 495.52 माइक्रोन डब्ल्यू एक्स 482.69 माइक्रोन एच के औसत व्यास के साथ कॉम्पैक्ट, गोलाकार आकार के गोलाकार बनाने के लिए लेते हैं जैसा कि चित्रा 5ए-5 सीमें दिखाया गया है। हेपजी 2 स्फेरॉइड जो सही ढंग से बने हैं और इन विट्रो टॉक्सिकोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने के लिए स्वीकार्य हैं, एक चिकनी सतह और कोई दृश्य अनुमानों के साथ एक कॉम्पैक्ट, गोलाकार आकार की संरचना होनी चाहिए। चित्रा 5 अच्छी गुणवत्ता(चित्रा 5डी-एफ)और एक खराब गुणवत्ता(चित्रा 5जी-1)स्फेरॉइड के उदाहरण प्रदान करता है। जिसके बाद को छोड़ दिया जाना चाहिए। आमतौर पर, प्रति प्लेट गठित 90-95% स्फेरॉइड सही ढंग से बनेंगे और आगे के प्रयोग के लिए व्यवहार्य होंगे। चित्र 5:हैंगिंग ड्रॉप विधि के माध्यम से गठित हेपजी2 स्फेरॉइड की प्राकृतिक आकृति विज्ञान को प्रदर्शित करने वाली हल्की माइक्रोस्कोपी छवियां। (ए-सी)शो डे 2 और(डी-1)डे 4 हेपजी2 लिवर स्पेरोइड्स पोस्ट सीडिंग । (डी-एफ)अच्छी गुणवत्ता के उदाहरण हैं हेपजी 2 स्पेरोइड्स जबकि(जी-1)खराब गठन वाले स्फेरॉइड दिखाता है। सभी छवियों को माइक्रोस्कोप का उपयोग करके X20 उद्देश्य पर लिया गया था। स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । हेपजी2 स्फेरॉइड व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए, उनके जिगर जैसी कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए एक बुनियादी कोलोरिमेट्रिक ब्रोमोक्रेसोल ग्रीन एल्बुमिन (बीसीजी) परख या यूरिया परख किया जा सकता है। जिगर की तरह कार्यक्षमता एक 14 दिन संस्कृति अवधि में Trippan ब्लू अपवर्जन परख का उपयोग कर व्यवहार्यता के साथ लाइन में मूल्यांकन किया गया था जिगर स्पेरोइड मॉडल की दीर्घायु निर्धारित करने और स्थापित अगर यह दीर्घकालिक या दोहराया ENM/रासायनिक आधारित जोखिम आकलन(चित्रा 6)का समर्थन कर सकता है । एल्बुमिन एकाग्रता संस्कृति अवधि की अवधि में लगातार बनी रही। यूरिया उत्पादन 7 दिन तक एक पठार तक पहुंचने से पहले संस्कृति में एक सप्ताह से अधिक प्रति गोलाकार उत्पादित यूरिया की एकाग्रता में वृद्धि प्रदर्शित करता है । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि 3 डी हेपजी2 स्फेरॉइड में उत्पादित एल्बुमिन और यूरिया का स्तर 2डी प्रारूप में सुसंस्कृत एक ही सेल लाइन में देखी गई तुलना में काफी अधिक है। दरअसल, हेपजी2 कोशिकाओं, पीक एल्बुमिन और यूरिया के स्तर की 2डी संस्कृतियां क्रमशः ०.००१ मिलीग्राम/एमएल और ०.०१० एनजी/μL थीं । इसके अलावा, शाह एट अल द्वारा प्रकाशित पिछले काम में लगभग समान हेपजी2 स्फेरॉइड सिस्टम का उपयोग करके, लेखक 2डी सुसंस्कृत हेपजी 2 कोशिकाओं की तुलना में5की तुलना में 3D हेपजी2 इन विट्रो मॉडल सिस्टम में मेटाबोलिक गतिविधि (CYP1A1 और CYP1A2) में उल्लेखनीय सुधार को उजागर करते हैं। चित्रा 6: हेपजी2 लिवर स्पेरोइड्स के लिए 14-दिवसीय बेसलाइन चरित्र चित्रण डेटा। हैंगिंग ड्रॉप से स्थानांतरण के बाद,(ए)क्रमशः जिगर की तरह एल्बुमिन और यूरिया कार्यक्षमताको उजागर करते हुए14दिन की अवधि में हेपजी2 स्फेरॉइड मॉडल की व्यवहार्यता पर प्रकाश डालता है । मतलब डेटा ± SEM प्रस्तुत, एन = 4। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । एक परिगलित कोर के अपरिहार्य विकास के साथ, 3 डी जिगर स्पेरोइड संस्कृतियों की एक ज्ञात सीमा, इस हेपजी 2 आधारित मॉडल की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए स्थापित किया जाना था कि यह दीर्घकालिक (5-10 दिन) जोखिम व्यवस्थाओं को बनाए रखने में सक्षम था, जबकि माइक्रोन्यूक्लिस परख5का समर्थन करने के लिए आवश्यक प्रसार क्षमता को बनाए रखने के लिए। दरअसल, इस 3डी लिवर स्फेरॉइड मॉडल को संस्कृति में 10 दिनों में 70% व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। इसके आधार पर और ≥14 दिन की संस्कृति अवधि में देखी गई निरंतर यकृत जैसी कार्यक्षमता के साथ, यह 3 डी लिवर स्फेरॉइड मॉडल इस प्रकार 10 दिनों तक दीर्घकालिक, दोहराया ENM एक्सपोजर व्यवस्थाओं का समर्थन कर सकता है (यानी, स्फेरॉइड की व्यवहार्यता से पहले 70% से नीचे छोड़ दें)। संदर्भ के लिए, यह सलाह दी जाती है कि हेपजी2 स्फेरॉइड के लिए एल्बुमिन स्तर ४००० कोशिकाओं/स्फेरॉइड पर वरीयता प्राप्त ≥२०.० एनजी/माइक्रोन किया जाना चाहिए जबकि यूरिया उत्पादन इस मॉडल के साथ इन विट्रो विषविज्ञान आकलन करने से पहले ≥०.२५ एनजी/μL होना चाहिए । इंजीनियर नैनोमैटेरियल्स का जेनोटॉक्सिकिटी असेसमेंटजीनोटॉक्सिकता मूल्यांकन के लिए, सूक्ष्मन्यूक्लियस परख का उपयोग तीव्र (24 एच) और दीर्घकालिक (120 एच) एनएम एक्सपोजर दोनों के बाद माइक्रोन्यूक्लियी की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए किया गया था। Aflatoxin B1 एक ज्ञात जिगर कार्सिनोजन16, 17 है और माइक्रोन्यूक्लिस परख के लिए एक अनुशंसित सकारात्मक नियंत्रण है। अनुकूलन प्रयोगों से पता चला है कि अल्फाटॉक्सिन बी 1 का 0.1 माइक्रोन 3डी हेपजी2 लिवर स्फेरॉइड में एक महत्वपूर्ण सकारात्मक (≥2.0 गुना वृद्धि) जीनोटॉक्सिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है और इस प्रकार इस मॉडल के साथ आयोजित हर माइक्रोन्यूक्लिस परख में उपयोग किया जाता है। हेपजी 2 स्फेरोइड मॉडल का उपयोग करके माइक्रोन्यूक्लियस परख परिणामों की वैधता सुनिश्चित करने के लिए, इस 3 डी इन विट्रो मॉडल में उपयोग की जाने वाली हेपजी2 कोशिकाओं के लिए पृष्ठभूमि माइक्रोन्यूक्लियस आवृत्ति 0.6% – 1.2% की सीमा के भीतर होनी चाहिए। नतीजतन, अल्फाटॉक्सिन बी 1 को नकारात्मक नियंत्रण के साथ देखे गए कम से कम दो गुना अधिक की जीनोटॉक्सिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करना चाहिए; इस प्रकार, अल्फाटॉक्सिन बी 1 के 0.1 माइक्रोनएम को 1.5% – 3.0% के बीच माइक्रोन्यूक्लिई आवृत्ति को प्रेरित करना चाहिए। इन नियंत्रण मापदंडों का उपयोग करके, आईएनएम से जुड़े जेनोटॉक्सिसिटी इन विट्रो का मज़बूती से मूल्यांकन किया जा सकता है। ओईसीडी टेस्ट दिशानिर्देश 487 के आधार पर, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एनएम या रसायन का परीक्षण करते समय, चयनित सांद्रता 5% साइटोटॉक्सिकिटी (नकारात्मक नियंत्रण ± के संबंध में सीपीबीआई या आरवीसीसी मूल्यों में कमी से संकेतित) 5% से अधिक नहीं होनी चाहिए)11। चित्रा 7 उत्पन्न डेटा दिखाता है जब Aflatoxin B1 और दो ENMs (टाइटेनियम डाइऑक्साइड (TiO2)और ज़ुल्फ़ (एजी)) HepG2 spheroids में दोनों तीव्र और दीर्घकालिक जोखिम के बाद मूल्यांकन किया गया, और बाद में जीनोटॉक्सिक क्षमता माइक्रोन्यूक्लिस परख का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । मूल्यांकन किए गए दोनों एनएमएस का परीक्षण एक गैर-टोकॉक्सिक, एक तीव्र (24 घंटे) एक्सपोजर और दीर्घकालिक (१२० एच) एक्सपोजर शासन पर ५.०० μg/mL की कम खुराक पर किया गया था । टीओ2 और एजी एनएमएस दोनों में जीनोटॉक्सिकिटी के लिए एक समान प्रवृत्ति देखी जा सकती है, जिससे 24 घंटे के एक्सपोजर के बाद हुई ऊंचा जनेऊक्सीता प्रतिक्रिया दीर्घकालिक 5 दिन के एक्सपोजर के बाद स्पष्ट नहीं थी। यह दोनों समय-बिंदुओं पर Aflatoxin B1 सकारात्मक नियंत्रण द्वारा प्रेरित निरंतर जीनोटॉक्सिकिटी के बावजूद था। चित्र 7: टीओ2 और एचईपीजी2 लिवर स्पेरोइड्स पर एजी ईएनएएम एक्सपोजर के बाद जेनोटॉक्सीसिटी असेसमेंट। जीनोटॉक्सिकिटी (माइक्रोन्यूक्लिस फ्रीक्वेंसी) असेसमेंट माइक्रोन्यूक्लिस परख पोस्ट(ए)तीव्र (24 घंटे) और(बी)लॉन्ग-टर्म (१२० घंटे) एक्सपोजर का इस्तेमाल करते हुए टीओ 2 और एजी ईएनएम के५.०० माइक्रोग्राम/एमएल का एक्सपोजर । नकारात्मक नियंत्रण केवल एक मीडिया है, जबकि सकारात्मक नियंत्रण 0.1 माइक्रोन ऑफ एफ्लोटॉक्सिन बी 1 है। मतलब डेटा (n=2) प्रस्तुत ± एसडी महत्व नकारात्मक नियंत्रण के संबंध में संकेत दिया: * = पी≤ ०.०५। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

विशेष जैव रासायनिक अंत बिंदु या प्रतिकूल परिणाम मार्ग लक्षित किए जाने के आधार पर 3 डी हेपेटिक मॉडल के लिए आवेदन काफी भिन्न होते हैं। प्रत्येक मॉडल के अपने लाभ और सीमाएं हैं, प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट (पीएचएच) मॉडल में इंटरडोनर भिन्नता से सेल-लाइन आधारित मॉडल में साइटोक्रोम p450 गतिविधि को कम करने के लिए, लेकिन सभी अपने स्वयं के अधिकार6,12,18, 19में मूल्यवान हैं। जीनोटॉक्सिकता का आकलन करते समय इन विट्रो माइक्रोन्यूक्लियस परख जैसे नियामक अनुमोदित अंत बिंदुओं के साथ मॉडल अनुकूलता में सीमाएं होती हैं, क्योंकि सक्रिय प्रसार की आवश्यकता होती है। यह आवश्यक है, क्योंकि जीनोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए निश्चित डीएनए क्षति के परिमाणीकरण की आवश्यकता होती है, जब डीएनए मरम्मत के लिए क्षणिक घावों को सही करने का अवसर होता है तो सेल विभाजन के बाद मूल्यांकन किया जाना चाहिए । दुर्भाग्य से, अत्यधिक विभेदित हेपेटोसाइट (यानी, हेपार्ग) आधारित स्फेरॉइड या पीएचएच माइक्रोटिस्यूस, जिन्हें सबसे शारीरिक रूप से प्रासंगिक यकृत जैसी विशेषताओं को प्रदर्शित करने के लिएसमझा जाता है,12, 19,20मॉडल स्थिर (गैर-प्रसार) मॉडल बनाते हैं। नतीजतन, यहां प्रस्तुत 3डी हेपजी2 स्फेरॉइड मॉडल एक उपयुक्त, वैकल्पिक मॉडल प्रदान करता है जो जेनोटॉक्सिसिटी परीक्षण का समर्थन करने में सक्षम है। हेपजी 2 सेल-लाइन आधारित स्फेरॉइड में स्फेरॉइड की बाहरी सतह पर पर्याप्त सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाएं होती हैं, जबकि बुनियादी यकृत जैसी विशेषताओं, जैसे एल्बुमिन और यूरिया उत्पादन और कुछ CYP450 गतिविधि5,12, 19को बनाएरखते हैं। मुख्य रूप से इस इन विट्रो लिवर मॉडल को माइक्रोन्यूक्लियस परख के पूरक के लिए विकसित किया गया है, क्योंकि यह जीनोटेक्सिटी परीक्षण8,10, 11,21के लिए बैटरी में अनुशंसित इन विट्रो परख में से एक है। हालांकि, मॉडल आसानी से डीएनए अनुक्रमण विश्लेषण और जीन अभिव्यक्ति (आरएनए) प्रौद्योगिकियों के लिए लागू किया जा सकता है, जबकि यह आगे अनुकूलित और धूमकेतु परख के रूप में अंय डीएनए क्षति अंत बिंदुओं के लिए उपयोग करने की क्षमता है । फिर भी, यह भूमिका है कि ENM हस्तक्षेप कुछ अंत बिंदु विश्लेषण में खेलता है पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री आधारित विश्लेषण विशेष रूप से कण हस्तक्षेप22के कारण एनएम जेनोटॉक्सिकिटी मूल्यांकन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं।

स्फेरॉइड मॉडल का एक सीमित कारक जो सक्रिय रूप से सेल डिवीजन से गुजरता है, उनका आकार है। सीडिंग घनत्व का अनुकूलन महत्वपूर्ण है क्योंकि पर्याप्त कोशिकाएं होने की आवश्यकता है जो मॉडल को पैदा करना जारी रखने की अनुमति देती हैं; लेकिन बहुत अधिक सेल संख्या नहीं है, जिसके परिणामस्वरूप स्फेरॉइड अत्यधिक कॉम्पैक्ट होता है, जिससे एक बढ़ी हुई परिगलित कोर होती है। इस परिगलन का कारण प्रतिबंधित ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का प्रसार माना जाता है, क्योंकि इस प्रसार की सीमा लगभग 100 – 150 माइक्रोन ऊतक23,24माना जाता है। हालांकि, यह सेल प्रकार, सेल संख्या, पाड़ इंटरैक्शन और संस्कृति की स्थिति25पर निर्भर करता है। चूंकि, यह दिखाया गया है कि लगभग 700 माइक्रोन व्यास C3A स्फेरॉइड के केंद्र में परिगलन की समय से पहले शुरुआत से बचने की सीमा है, प्रति गोलाकार 4000 हेपजी2 कोशिकाओं को सीडिंग यह सुनिश्चित करता है कि एक्सपोजर के समय मॉडल का व्यास ≤500 माइक्रोन26है। इसके अलावा, शाह एट अल की स्थापना की है कि HepG2 कोशिकाओं प्रति spheroid प्रति ५००० कोशिकाओं से ऊपर वरीयता प्राप्त संस्कृति में 7 दिनों के बाद व्यवहार्यता में 25% की कमी का प्रदर्शन किया है, जो ६८० μm के औसत व्यास और एक 20 μL फांसी ड्रॉप5में पोषक तत्वों की सीमित उपलब्धता से संबंधित हो सकता है । इसे दूर करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल में तैयार मॉडल एक महत्वपूर्ण कदम से गुजरता है जहां स्फेरॉइड के प्रारंभिक गठन के बाद फांसी की बूंद को एगरेंग कोटेड कुओं में स्थानांतरित कर दिया जाता है। यह सुनिश्चित करता है कि संस्कृति माध्यम की एक बड़ी मात्रा स्फेरॉइड के भीतर कोशिकाओं की बढ़ती संख्या को बनाए रखने के लिए मौजूद है । नतीजतन, हेपजी2 स्फेरोइड मॉडल संस्कृति में 10 दिनों के बाद 70% से अधिक व्यवहार्य रहता है और विट्रो में दीर्घकालिक जोखिम आकलन के लिए उपयोग किया जा सकताहै।

जबकि हेपजी 2 स्फेरॉइड मॉडल तीव्र और दीर्घकालिक एक्सपोजर व्यवस्थाओं दोनों का समर्थन कर सकता है, विस्तारित संस्कृति अवधि के दौरान ताज़ा सेल संस्कृति माध्यम इस मॉडल के लिए प्रतिबंधित है क्योंकि स्पेरोइड के संभावित नुकसान के कारण माध्यम के पूर्ण प्रतिस्थापन की सलाह नहीं दी जाती है। यह माना जाता है कि ENM एक्सपोजर के साथ, समरूप ENM फैलाव के लिए समूह और तलछट के लिए प्रवृत्ति अधिक है । हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि जिस दर पर एक एनएम तलछट कण मापदंडों (जैसे, आकार, आकार और घनत्व) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और सैद्धांतिक रूप से इन विट्रो तलछट, प्रसार और डोसिमेट्री (आईएसडीडी) मॉडल, या इसके हालिया डेरिवेटिव का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, जिसे अक्सर ENM (निलंबन) एक्सपोजर के बारे में संदर्भित किया जाता है27,28। इस बात के साथ मन है, यह माना जाता है कि यदि सेल संस्कृति माध्यम का केवल 50% सावधानी से सेल संस्कृति की सतह से हटा दिया जाता है, तो एनएम खुराक के व्यवधान और बाद में हटाने को कम से कम होना चाहिए। हालांकि, खेल में ब्राउनियन प्रस्ताव के साथ, यह कड़ाई से मामला नहीं हो सकता है और प्रत्येक विशेष ENM के बयान और तलछट में आगे काम करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए सही dosimetry27 दीर्घकालिकजोखिम शासनों भर में बनाए रखा है । मुख्य रूप से यह एक संभावित सीमा पर विचार करने के लिए जब दोहराया डोजिंग शासनों प्रदर्शन के रूप में यह अंतिम, संचित एकाग्रता के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है । दूसरी ओर रासायनिक आधारित एक्सपोजर, विचार करने के लिए अपनी सीमाओं के बिना नहीं, उस रासायनिक पदार्थों में अधिक सरलीकृत दृष्टिकोण प्रदान करते हैं और इस प्रकार नए जोड़े गए एकाग्रता के अलावा मूल रासायनिक एकाग्रता का प्रत्यक्ष प्रतिस्थापन यह सुनिश्चित करता है कि मीडिया जलपान के दौरान खो गए किसी भी रसायन कोतदनुसार 29प्रतिस्थापित किया जाए। भविष्य के अनुप्रयोगों में दीर्घकालिक संस्कृति अवधियों में बार-बार एक्सपोजर व्यवस्थाओं के लिए मॉडल की उपयुक्तता का मूल्यांकन करना शामिल होगा क्योंकि बार-बार डोजिंग रणनीतियां किसी विशेष अंग प्रणाली की क्षमता का आकलन करने या प्रतिकूल प्रभावों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, यदि कोई हो, एक ज़ेनोबायोटिक पदार्थ के बायोएकुमुलेशन द्वारा प्रेरित है।

अंत में, इस 3 डी इन विट्रो हेपेटिक मॉडल में यथार्थवादी एक्सपोजर परिदृश्यों की एक श्रृंखला का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग करने की क्षमता है, जिससे एक नियमित और आसानी से सुलभ तरीके से एनएम और रासायनिक जोखिम मूल्यांकन दोनों का बेहतर समर्थन करने के लिए विट्रो दृष्टिकोण में भविष्य प्रदान किया जा सके।

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखक यह स्वीकार करना चाहेंगे कि इस शोध को अनुदान समझौते संख्या 760813 के तहत गश्ती परियोजना के लिए यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है ।

Materials

Aflotoxin B1 Sigma Aldrich, UK A6636-5MG
Agarose Sigma Aldrich, UK A9539-50G
Autoclave Tape
BCG Albumin Assay Sigma Aldrich, UK MAK124
Bovine Serum Albumin Powder Sigma Aldrich, UK A9418
Cell Freezing Aid Thermo Fisher Scientific, UK 5100-0001 – Mr Frosty
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Cytochalasin B Merck, UK 250233
Cytology Metal Clips
Cytospin 4 Centrifuge ThermoFisher Scientific, UK CM00730202
DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine GIBCO, Paisley, UK 41965-039
DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes GIBCO, Paisley, UK 21063-029
DPX Mounting Medium FisherScientific, UK D/5330/05
Ethanol FisherScientific, UK 10048291
FBS GIBCO, Paisley, UK 10270-106
Filter Cards for Shandon Cytospin FisherScientific, UK 15995742
Frosted Glass Slides ThermoFisher Scientific, UK
Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr VWR Chemicals, UK MFCD00081642
Glass Coverslips (24 x 60) Deckglaser, VWR ECN631-1575
Haemocytometer and Coverslip
Immersion Oil for Microscope Zeiss, UK 518F, ISO8034
Laminar Class II Tissue Culture Hood Scanlaf Mars
Light Microscope Zeiss, UK Axiovert 40C
Liquid Nitrogen
Methanol FisherScientific, UK 10284580
Microwave
Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips Greiner-Bio-One, UK
NuncMicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific, Denmark 167008
P1000 and P200 micropipettes
P300 and P50 multi-channel pipettes
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free GIBCO, Paisley, UK 14190-094
Pen/Strep GIBCO, Paisley, UK 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml
Phosphatase Buffer Tablets GIBCO, Paisley, UK 10582-013
Pipette Boy
Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges FisherScientific, UK 11690581
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe Branson, USA 101-063-971R
T-25 and T-75 Tissue Culture Flask Greiner-Bio-One, UK T-25 (690175) and T-75 (660175)
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich, UK T8154-100mL
Urea Assay Kit Sigma Aldrich, UK MAK006
Virkon Disinfectant DuPont, UK Rely+On Virkon
Water Bath (37˚C) Grant JBNova 18
Weighing Balance
Xylene FisherScientific, UK 10588070
0.05% Trypsin-EDTA GIBCO, Paisley, UK 5300-054
0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes Greiner-Bio-One, UK
0.45µm Filter Unit Millex HA, MF-Millipore, UK SLHA033SS
1.0mL Syringe BD Plastipak, FisherScientific, UK 300185
20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps DWK Life Sciences GmbH, Germany WHEA986581
37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator NUAIRE DHD Autoflow
3mL Pasteur Pipette Greiner-Bio-One, UK
50mL Conical Falcon Tubes Greiner-Bio-One, UK
50mL or 100mL Glass Bottles
50mL Skirted Falcon Tubes Greiner-Bio-One, UK
5mL, 10mL and 25mL Pipettes Greiner-Bio-One, UK
9.4cm Square, Petri Dish Greiner-Bio-One, UK 688161
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Geiser, M., Kreyling, W. G. Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).
  2. Modrzynska, J. Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver. Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).
  3. Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
  4. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  5. Shah, U. -. K., et al. A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).
  6. Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates. Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).
  7. van Grunsven, L. A. 3D in vitro models of liver fibrosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).
  8. Corvi, R., Madia, F. In vitro genotoxicity testing – can the performance be enhanced. Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).
  9. Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).
  10. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  11. OECD. . OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).
  12. Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).
  13. Sison-Young, R. L., et al. A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity. Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).
  14. European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines (2019)
  15. Jensen, K. A. The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG. European Union Grant Agreement n° 2009. 21, 01 (2014).
  16. Marchese, S., et al. Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development. Toxins. 10, 214 (2018).
  17. Rushing, B. R., Selim, M. I. Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods. Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).
  18. Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model. Scientific Reports. 9, 7295 (2019).
  19. Berger, B., et al. Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail. Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).
  20. Ramaiahgari, S. C., et al. A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies. Archives of Toxicology. , (2014).
  21. Li, Y., et al. Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials. Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).
  22. Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).
  23. Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  24. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).
  25. Asthana, A., Kisaalita, W. S. Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures. Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).
  26. Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).
  27. Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles. Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).
  28. Hinderliter, P. M., et al. ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies. Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).
  29. Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies. Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).

Tags

3D Liver ModelHep G2 SpheroidIn Vitro GenotoxicityLong-term Nanomaterial ExposureAlternative To Animal TestingMicronucleus AssayCell SeedingMedia ChangeAgaroseCentrifugationEngineered Nanomaterials (ENMs)

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Llewellyn, S. V., Conway, G. E., Shah, U., Evans, S. J., Jenkins, G. J., Clift, M. J., Doak, S. H. Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure. J. Vis. Exp. (160), e61141, doi:10.3791/61141 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image