דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

1.Culturing תאים HepG2 cryopreserved הערה: תאי HepG2, שהתקבלו מאוסף תרבות הסוג האמריקאי (ATCC) היו מתורבתים ב-1x Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) עם 4.5 גרם/L D-גלוקוז ו-L-גלוטמין בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה 1% פניצילין/סטרפטומיצין. מדיום תרבית תאי DMEM חם מראש (כולל התוספים) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הסר בקבוקון אחד של תאי HepG2 מחנקן נוזלי ולהפשיר באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות, תוך מערבולת בעדינות את הבקבוקון כדי לאפשר הפשרה אחידה של השעיית התא. יש להקפיד לא להטביע את הבקבוקון מעל ה-O-ring על מנת להפחית את פוטנציאל הזיהום. לאחר הפשרה, להסיר את הבקבוקון מאמבט המים לרסס בנדיבות עם 70% אתנול כדי לסלק את המשטח החיצוני של הבקבוקון לפני הצבת מתחת למכסה המנוע סטרילי, Class II תרבית רקמה למינארית. בזהירות פיפטה התוכן של cryovial של תאי HepG2 לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 9 מ”ל של מדיום תרבות תא DMEM מחומם מראש (עם תוספי מזון). באמצעות פס 10 מ”ל, להעביר 10 מ”ל של המתלה התא לתוך בקבוק 25 ס”מ2 תרבות תאים חד פעמיים להדגיר את התרבות במשך 3 ימים (מן הזריעה) ב 5% CO2 ו 37 °C (60 °F) עד ~ 80% confluency הוא הגיע לפני שעבר תת תרבות לתוך גדול יותר 75 ס”מ2 בקבוק תרבות תאים חד פעמיים. לאחר 80% מפגש הוא הגיע, תת תרבות תאים בתנאים סטריליים על ידי טריפסיניזציה עם 0.05% טריפסין / EDTA פתרון מראש מחומם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בשום שלב אין לאפשר לתאים להתייבש. כאשר התאים יוצרים מונולייר דבק, הסר את המדיה על-ידי הטיה לסיר פסולת חיטוי. ואז מיד לשטוף את monolayer כדי להסיר את כל העקבות של מדיה קיימת על ידי שטיפת הבקבוק פעמיים עם 3 מ”ל של פתרון סטרילי 1x PBS נשמר בטמפרטורת החדר. כמו כן, להשליך PBS לתוך סיר פסולת חיטוי. לאחר שטיפת PBS מוסר, להוסיף 5 מ”ל של פתרון 0.05% טריפסין-EDTA מחומם מראש, הבטחת לכסות את כל פני השטח של התאים תאים דגירה במשך 6-8 דקות ב 37 °C (67 °F) ו 5% CO2. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לעקור את התאים מתחתית הבקבוק ולאחר מכן להוסיף 5 מ”ל של מדיום תרבית התא DMEM (עם תוספי מזון) כדי לנטרל את האנזים טריפסין. להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ”ל פיפטה התא השעיה למעלה ולמטה ביסודיות כדי להבטיח כי התאים מנותקים לחלוטין. צנטריפוגה השעיית התא מדולל ב 230 x g במשך 5 דקות. להשליך את supernatant לתוך חיטוי להשעות מחדש גלולה התא ב 25mL של מדיום תרבית התא DMEM (עם תוספי מזון). העבר את המתלה התא לתוך בקבוק 75 ס”מ2 תרבות תאים חד פעמיים דגירה ב 37 °C (77 °F) ו 5% CO2 במשך 3 ימים נוספים לפני שעבר הכנת ספרואיד. לאחר HepG2s היה זמן להסתגל שוב להגיע ~ 80% confluency, לקבוע את ריכוז התא כהכנה זריעת ספרואיד. 2. הכנת ספרואיד HepG2 חזור על צעדי תת-תרבות כאמור לעיל, למעט לאחר צנטריפוגה, להשעות מחדש את גלולת התא ב 1 מ”ל של DMEM תרבות בינונית מראש מחומם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. השעיית תא פיפטה למעלה ולמטה ביסודיות. ציון הכדאיות של התאים באמצעות מבחני ההדרה הכחולים של Trypan (ראה OSHA SOP 3.21 רעלני רבייה, מוטגנים, טרטוגנים ועוברים – נהלים לטיפול ואחסון בטוחים (2019) להנחיית בריאות ובטיחות)14 עם יחס של 1:1 של השעיית תאים לתמיסה כחולה מסוננת מראש של 0.4% Trypan. לפני ספירת תאים, לקחת 1 מ”ל של פתרון כחול Trypan באמצעות מזרק 1 מ”ל ומסנן עם יחידת מסנן 0.45 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי, 1 מ”ל. העבר 10 μL של פתרון מסונן, כחול Trypan לתוך צינור 0.2 מ”ל ולהוסיף 10 μL של השעיית התא. פתרון כחול Trypan מסונן הנותרים ניתן לאחסן עד 3 חודשים בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי. מרססים את ההמוקיטומטר ביסודיות עם 70% אתנול ומנגבים יבשים במגבת נייר סטרילית לפני שמבטיחים את העטיפה מלמעלה באמצעות אדי נשימה. החלקת הכיסוי על פני השטח הלחים בנשימה מעוררת כוחות מגובשים על ידי יצירת טבעות ניוטון. בעדינות פיפטה התא הכחול Trypan השעיה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 1000 μL (כדי להפחית את הלחץ העצום) לפני הוספת 10 μL למטומטר. ודא כי הפתרון מפוזר מתחת לתעודת הכיסוי ומכסה את הרשת כולה ללא בועות אוויר. איור 1: ספירת תאים באמצעות מד חום. ייצוג דיאגרמתי של המוציתומטר המדגיש מאין רבע לספור תאים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. תחת המיקרוסקופ, ספרו את התאים החיים (הלא מוכתמים) והמתים (כחולים מוכתמים) שנמצאו בארבעת הריבועים הפינתיים הגדולים (איור 1). אל תכלול תאים שנמצאו חופפים או יושבים על שני הקצוות הפנימיים של ריבועי הפינה הגדולים (כלומר, על הקווים) בספירה. באמצעות החישוב הבא, חשב את המספר הממוצע של תאים חיים ובת קיימא (לא מוכתמים) הקיימים במדגם:מספר תאים כולל/מ”ל = ספירת תאים חיים x 10,000כאשר הדילול מתייחס למספר הפעמים שפתרון המניה היה מדולל בכחול Trypan (2x במקרה זה) ו# הריבועים שנספרו מתייחס לארבעת הריבועים הפינתיים הגדולים של המוציתומטר שנספרו מבוסס על ספירת התאים הקיימת של HepG2 ושימוש בנוסחה הבאה:C1V1=C2V2איפה C1 = הריכוז של תאים קיימא כיום,V1 = נפח ההשעיה של התא כרגע,C2 = הריכוז של השעיית התא רצה,V2 = נפח ההשעיה התא רצה הכן פתרון מלאי 10 מ”ל של השעיית תא HepG2 עם מדיום תרבות תא DMEM בריכוז של 2.0 x 105 תאים / מ”ל על מנת להשיג 4000 תאי HepG2 לכל 20 μL תלוי טיפה. מערבבים את המתלה התא ביסודיות על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה μL 1000 כדי להבטיח את כל התאים מושעים לחלוטין בתוך המדיה. לבארות של צלחת תרבית תאים 96-גם, להוסיף 100 μL של סטרילי, טמפרטורת החדר PBS כדי למנוע טיפות תלויות להתייבש במהלך הדגירה. קחו את המכסה של צלחת סטנדרטית שטוחה בת 96 בארות של תרבית תאים, הפכו אותה והניחו בזהירות טיפות של פיפט 20 μL של מתלה התא למרכז כל חריץ היטב של המכסה, כפי שמוצג באיור 2. השתמש פיפטה רב ערוצית אבל להוסיף רק 2 – 4 טיפות בבת אחת כמו זריעה מרובה יכול להשפיע על הדיוק והמיקום של טיפות. מרכז את הטיפות בתוך החריצים של בארות הניח על המכסה; אחרת הם לא ייתלו במרכז הבארות כאשר המכסה של הצלחת מתהפך והם נמצאים בסיכון ליפול לתוך הצלחת. הופכים בעדינות את המכסה של צלחת ה-96 באר, כך שהטיפות תלויות כעת ומניחות בזהירות על גבי צלחת ה-96 באר. מניחים את כל צלחת 96 היטב עם מכסה בעדינות לתוך אינקובטור ב 37 °C (67 °F) ו 5% CO2 במשך 3 ימים לפני העברת ספרואיד על agarose.הערה: יש לנקוט משנה זהירות לא רק בעת הובלת הצלחות אל / מן האינקובטורים, אבל בעת פתיחה וסגירה של החממה בכלל כמו תנועה מוגזמת יכול לגרום הצלחות לנוע ואת spheroids ליפול או ליצור באופן שגוי. איור 2: 3D HepG2 בהכנת דגם ספירואידי במבחנה. (A) תאי HepG2 זרעים ב 20 טיפות μL על המכסה של צלחת 96-well. (B)תאי HepG2 לאחר הזריעה במודל טיפה תלוי כדי לאפשר היווצרות ספרואיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 3. העברת כדורי HepG2 מירידה תלויה להשעיית agarose הערה: ביום 3 פוסט זריעה לתוך טיפות תלויות, spheroids מועברים לתוך בארות של צלחת 96-באר כל אשר כבר מצופה בעבר עם שכבה דקה של 1.5% ג’ל agarose. הכן ג’לים agarose אוטוקלאב (כלומר, יום 2 לאחר זריעה) לפני יום של ציפוי צלחת (כלומר, יום 3 לאחר זריעה). כדי להכין 1.5% ג’ל agarose, לשקול 0.30 גרם של agarose לתוך בקבוק נקי, זכוכית ולאחר מכן להוסיף 20 מ”ל של פנול אדום ללא DMEM בינוני. אוטוקלאב agarose במשך 1 שעות ב 230 מעלות צלזיוס עבור עיקור. ציפוי agarose מונע את spheroids HepG2 לדבוק בבסיס של בארות ויוצרים monolayer הסלולר במקום לשמור על המבנה ספרואיד 3D שלהם. ביום 3 פוסט זריעה, להסיר את צלחת 96-well המכיל את Spheroids טיפה תלוי HepG2 מתוך האינקובטור בזהירות להפוך את המכסה כך spheroids כבר לא תלויים. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להסיר ולהשליך את 100 μL של PBS שנוספו בעבר לבסיס של צלחת 96-well. אפשר את הצלחות airdry במשך 2-3 דקות תוך חימום agarose כהכנה לציפוי.התראה: הליך זה גורם חם מאוד, נוזל agarose אשר אם נשפך על העור עלול לשרוף ולגרום לפציעה. יתר על כן, יש להקפיד בעת טיפול בבקבוק הזכוכית המכיל את הנוזל agarose כמו זה גם יכול להיות חם מאוד. באמצעות 1.5% ג’ל agarose שהוכן בעבר, לחמם את בקבוק הזכוכית המכיל את ג’ל agarose 20 מ”ל עבור 30 s במיקרוגל בוואט המרבי (כלומר, 900 W). כדי לצפות שתי צלחות 96-באר, בקבוק אחד 20 מ”ל של ג’ל agarose מוכן מראש 1.5% צריך להיות מספיק. לאחר נמס, בעדינות מערבולת agarose על ידי סיבוב בקבוק הזכוכית כדי להסיר את כל בועות ולאחר מכן להוסיף 50 μL של agarose לתוך הבסיס של כל באר.הערה: בעת הוספת agarose, הקפד לא זווית הצלחת >45° כמו agarose מגדיר במהירות ולא יהווה שטוח, שכבה ברמה שיכול לשבש את הצמיחה spheroid. חשוב לעבוד ביעילות בשלב זה כדי למנוע את agarose מלהתמצק לפני הצלחת מצופה לחלוטין. אפשר לצלחת לעמוד במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר לפני הוספת 100 μL של מדיום תרבית תא DMEM מחומם מראש (עם תוספי מזון) על גבי שכבת agarose מוצק בכל באר. הופכים את המכסה של צלחת ה-96 באר ומניחים בחזרה על גבי צלחת ה-96 באר כך שהספרואידים שוב תלויים. צנטריפוגה את הצלחת במשך 3 דקות ב 200 x גרם על מנת להעביר את spheroids מן טיפה תלוי לתוך בארות הפרט של צלחת 96-היטב. לאחר ההעברה, ספירואידי HepG2 צריך להיות מושעה כעת במדיום תרבות התא. אפשר להם להסתפק 24 שעות באינקובטור ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2. לחשוף כדורי HepG2 בגודל זה לטיפולים כימיים או ENM ביום 4 לאחר זריעה (כלומר, 24 שעות לאחר ההעברה ללוחות מצופים agarose). על מנת לשמור על הכדאיות של התאים לאורך תקופות תרבות ממושכות, יש לרענן את מדיום תרבות התאים כל 3 ימים. כדי לעשות זאת, בעדינות לשאוף 50 μL של מדיום תרבות התא מפני השטח של הבאר ולהחליף עם טרי 50 μL של מדיום תרבות התא DMEM. יש להקפיד לא להסיר או להפריע לספרואיד בעת ביצוע שינוי בינוני. 4. חשיפה ננו חומרית/כימית הערה: דגם הכדור-כבד HepG2 יכול לתמוך הן במשטרי חשיפה מבוססי ENM והן במשטר חשיפה מבוסס כימי, אך המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא חשיפות ENM. לפני החשיפה, יש לפזר כראוי את ה-ENM של הבדיקה; זה יכול להתבצע על פי הוראות פרוטוקול פיזור NanoGenoTox (הסכם מענק מס ‘20092101, 2018)15. לאחר פיזור על פי פרוטוקול פיזור NanoGenoTox, לדלל את ההשעיה ENM מן הריכוז ההתחלתי של 2.56 מ”ג / מ”ל לריכוז הרצוי הסופי במדיום תרבות תא DMEM שחומם מראש (כולל תוספי). נפח כולל של 5 מ”ל נדרש למנן צלחת אחת 96 גם. כדי לחשוף את הכדורואיד HepG2 או כימי או ENM, באמצעות פיפטה 200 μL, לשאוף 50 μL של מדיום תרבות התא מפני השטח של כל באר (משאיר 50 μL בבאר כדי לא להפריע את spheroids) ולהחליף עם 50 μL בינוני המכיל את רעילות הבדיקה במינון הנדרש. לאחר חומר הבדיקה הוחל, דגירה את הצלחות עבור זמן החשיפה הרצוי ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2. אם משטר חשיפה ארוך טווח (≥24 שעות) מתנהל, אז מיד לאחר פרק הזמן הרצוי לחשיפה חלף, לקצור את spheroids לניתוח נקודת קצה micronucleus כמתואר להלן בשלבים 6.1 – 6.4. עם זאת, עם משטרי חשיפה חריפים (למשל, ≤24 שעות), לאחר שתקופת החשיפה הסתיימה, הקציר, הבריכה, ולאחסן 50 μL של supernatant מכל באר בצלחת 96 גם ב -80 מעלות צלזיוס לניתוח ביוכימי נוסף מאוחר יותר. החלף את מדיום תרבות התא עם 50 μL של מדיום טרי המכיל 6 מיקרוגרם / מ”ל של Cytochalasin B ולהשאיר דגירה עבור 1 – 1.5 מחזורי תאים (כלומר, 24 – 26 שעות עבור HepG2) כהכנה קציר micronucleus בלוק ציטוקינזיס.הערה: עבור משטרי חשיפה אקוטיים (≤24 שעות), ניתן ליישם את מבחני המיקרונוקלוס של בלוק ציטוקינזיס עם Cytochalasin B, אך עבור משטרי חשיפה ארוכי טווח (≥24 שעות), יש להשתמש בגרסה המונונוקלארית (ללא Cytochalasin B) של ה-assay כמתואר להלן באיור 4. 5. קצירת ספרואידים HepG2 הערה: בעקבות טיפולים כימיים או טיפולי חשיפה ENM, הן תרבית התא בינוני או רקמת ספרואיד ניתן לקצור לניתוח נקודות קצה מרובות. בהתאם לניתוח נקודת הקצה, ניתן לקצור ספרואידים בנפרד (למשל, לניתוח תמונה) או לאגד יחד (למשל, לבדיקת מיקרונוקלאוס בלוק ציטוקינזיס). מוציאים את צלחת ה-96 באר מהחממה. באמצעות פיפטה 200 μL, לשאוף את 100 μL של מדיום תרבות התא כולל רקמת ספרואיד מכל באר ולאסוף בצינור סטרילי, 15 mL צנטריפוגה. יש להקפיד להימנע ממגע עם ההתעוררות. לאחר שנאסף, צנטריפוגה ההשעיה ספרואיד ב 230 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לניתוח נקודת קצה נוסף (למשל, בדיקות תפקודי כבד) מאוחר יותר. להשעות מחדש את גלולה של ספרואידים ב 1 מ”ל של סטרילי, טמפרטורת החדר PBS (1x). לאחר שטף, צנטריפוגה ההשעיה ספרואיד שוב ב 230 x g במשך 3 דקות. להשליך את supernatant, להשעות מחדש ב 500 μL של 0.05% פתרון טריפסין-EDTA דגירה במשך 6-8 דקות ב 37 °C (77 °F) ו 5% CO2. לאחר הדגירה, בעדינות פיפטה התאים טריפסיניזציה למעלה ולמטה כדי לנתק לחלוטין ולהשעות מחדש את התאים HepG2 לפני נטרול עם 1 מ”ל של מדיום תרבות התא DMEM. צנטריפוגה השעיית התא מדולל ב 230 x g במשך 5 דקות. להשליך את supernatant לתוך חיטוי להשעות מחדש גלולה התא ב 2mL של טמפרטורת החדר PBS (1x). צנטריפוגה השעיית התא ב 230 x g במשך 5 דקות. להשליך את supernatant לתוך חיטוי ולאחר מכן להשעות מחדש את גלולת התא פעם נוספת ב 2 מ”ל של PBS קר (1x). ודא שהתאים מפוזרים היטב כדי למנוע גושים של תאים המטשטשים את שדה הראייה כאשר הם מותקנים על שקופיות מיקרוסקופ. 6. מיקרונוקלוס מבחנים וניקוד עבור השיטה הידנית של מבחני המיקרונוקלוס, נדרש ציטוצנטריפוגה כדי לייצר ציטודו (אזור מוגדר ומרוכז של תאים) במרכז שקופית המיקרוסקופ. תהליך זה תומך בניקוד יעיל יותר של השקופית מכיוון שהוא מאפשר למלך לאתר בקלות את התאים המעניינים, בניגוד להערכת שקופית שלמה שבה ניתן להפיץ את התאים באופן נרחב. לטבול שקופיות מיקרוסקופ חלבי (שלושה למנה) ב 70% אתנול ואחריו ddH2O ולהשאיר לאוויר יבש במשך 5 דקות. מקם שקופיות מיקרוסקופ מוכנות במשפך cuvette כפי שמוצג באיור 3A, שם שקופית הזכוכית (iii) ממוקמת בתמיכה במתכת (iv) עם כרטיס סינון (ii) ומשפך cuvette (i) מאובטח למעלה. מסדרים משפכי cuvette ב cytocentrifuge עם משפך פונה כלפי מעלה, כך 100 μL של השעיית התא ניתן להוסיף ישירות לתוך כל אחד. ציטוספין במשך 5 דקות ב 500 x g כדי להבטיח תאים מופצים באופן שווה על פני השטח של השקופית. איור 3: הגדרת ציטוספין להכנת תאים מטופלים בשקופיות מיקרוסקופ. (A) מציג את הרכיבים הבודדים, (i) משפך cuvette, (ii) כרטיס סינון, (iii) שקופית מיקרוסקופ זכוכית ותמיכה (iv) מתכת הנדרשת כדי cytospin HepG2 תאים על שקופיות מיקרוסקופ. (B)המשפך האחרון של הקובטה הוקם. (ג)המיקום הנכון של משפך cuvette בתוך cytocentrifuge. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. השאירו שקופיות לאוויר יבש לפני הקיבעון בקור קרח, 90% מתנול במשך 10 דקות. לאחר קבוע, להשאיר את המגלשות לאוויר יבש לילה בטמפרטורת החדר לפני אחסון ב -20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים. במידת הצורך, הסירו את מגלשות המיקרוסקופ המוכנות מראש ממקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ואפשרו להתחמם לטמפרטורת החדר לפני שתתחייבו להכתים את גימסה.התראה: על פי תקנה (EC) מס ‘ 1272/2008 [CLP], פתרון הכתמת Giemsa הוא נוזל דליק מאוד אשר יכול להיות רעיל אם בלע ולגרום נזק במגע עם העיניים, העור או אם בשאיפה. עיין בגיליון SDS המשויך לקבלת ייעוץ מפורט בנושא אחסון, טיפול ובריאות ובטיחות בכימיקל זה לפני השימוש. בעוד השקופיות מפשירה, להכין פתרון כתמים 20% Giemsa (25 מ”ל נדרש כתם ~ 30 שקופיות) מדולל מאגר phosphatase (pH 6.8). יש לערבב היטב על-ידי מערבולת עדינה של הפתרון לפני הסינון באמצעות נייר סינון מקופל הממוקם במשפך. באמצעות פיפטה פסטר, להוסיף 3 – 5 טיפות של פתרון Giemsa מסונן כדי cytodot על כל שקופית ולהשאיר במשך 8 – 10 דקות. לשטוף שקופיות בשני רחיצות חיץ phosphatase רצופות לפני שטיפה קצרה מתחת למים קרים כדי להסיר כל שאריות כתם עודף. השאירו שקופיות לאוויר יבש. לאחר יבש, במכסה המנוע אדים, לטבול מגלשות ויטראז ב xylene במשך 10 s לפני הוספת טיפה של מדיום הרכבה למרכז cytodot ומקום כיסויי זכוכית על גבי. השאירו שקופיות מיקרוסקופ במכסה המנוע אדים לילה לייבוש לפני ניקוד ידני; ניתן לאחסן אותם ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר. 7. ניתוח נתונים כמתואר בהנחיות הבדיקה של ה-OECD 487 (2014)11, כדי להעריך ולכמת נזקי דנ”א הנגרמים כתוצאה מחשיפה ל- ENM או לחומר כימי, השתמש במיקרוסקופ אור (מטרה של פי 100 עם שמן טבילה) 2000 מונונוקלד או 1000 תאים בונוקלים לכל העתק ביולוגי כדי להבקיע עבור נוכחות של מיקרונוקלי, כפי שמוצג באיור 4. איור 4: מיקרונוקלוס מבחני ניקוד עץ ההחלטות. עץ החלטות סכמטי כדי להדגיש את הצורך בהליכי ניקוד שונים והערכת ציטוקסיות בעת שימוש בפקודת micronucleus עם מודלים תלת-ממדיים בעקבות משטרי חשיפה חריפים או ארוכי טווח. חשיפות אקוטיות (≤24 שעות) מאפשרות שימוש בפקודת הציטוקינזיס החסומה, בעוד שחשיפות ארוכות טווח (≥24 שעות) דורשות את הגרסה המונו-גרעינית של ההסתעפות; שתיהן מתוארות בהנחיית מבחן ה-OECD 487. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. בהתבסס על היחס של micronuclei הנוכחי לכל מספר של תאים mononucleated או binucleated הבקיע, לחשב אחוז של ערך genotoxicity. על מנת להעריך את הנזק DNA שנצפה אינו תוצאה של פסולת התא הנגרמת על ידי שיעור גבוה של תאים אפופטיים, לנקוט מידה של cytotoxicity לצד. במקרה זה, בהתאם לנוכחות של Cytochalasin B, השתמש בחישוב CPBI או RVCC (כמתואר באיור 4). Genotoxicity יש להעריך רק בדגימות שבהן cytotoxicity הוא פחות מ 55% ± 5% כהגדרתו ב-OECD מבחן הנחיות 48711.