Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

1.Culturing kryokonservierte HepG2-Zellen HINWEIS: HepG2-Zellen, die aus der American Type Culture Collection (ATCC) gewonnen wurden, wurden in 1x Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) mit 4,5g/L D-Glucose und L-Glutamin kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin-Antibiotikum. Vorwarme DMEM Zellkultur Medium (einschließlich der Ergänzungen) in einem 37 °C Wasserbad für 30 min. Entfernen Sie eine Durchstechflasche mit HepG2-Zellen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie in einem 37 °C-Wasserbad für 2-3 min auf, während Sie die Durchstechflasche sanft wirbeln, um ein gleichmäßiges Auftauen der Zellsuspension zu ermöglichen. Achten Sie darauf, die Durchstechflasche über dem O-Ring nicht zu versenken, um das Kontaminationspotenzial zu verringern. Nach dem Auftauen die Durchstechflasche aus dem Wasserbad nehmen und großzügig mit 70% Ethanol besprühen, um die Außenfläche der Durchstechflasche zu dekontaminieren, bevor sie unter eine sterile, laminare Gewebekulturhaube der Klasse II gestellt wird. Den Inhalt des Kryovials von HepG2-Zellen sorgfältig in ein Zentrifugenrohr mit 9 ml vorgewärmtem DMEM-Zellkulturmedium (mit Nahrungsergänzungsmitteln) zu führen. Mit einem 10 ml Streifenpette 10 ml der Zellsuspension in einen 25 cm2 Einweg-Zellkulturkolben übertragen und die Kultur 3 Tage lang (von der Aussaat) bei 5%CO2 und 37 °C bebrüten, bis die Konfluenz von 80 % erreicht wird, bevor eine Subkultur in einen größeren 75 cm2 Einwegzellkulturkolben eingeflossen ist. Sobald 80% Konfluenz erreicht ist, subkulturzellen unter sterilen Bedingungen durch Trypsinisierung mit 0,05% Trypsin/EDTA-Lösung vorgewärmt in einem 37°C Wasserbad für 30 min. Zu keinem Zeitpunkt sollten die Zellen austrocknen dürfen. Wenn Zellen eine anhehrende Monoschicht bilden, entfernen Sie das Medium, indem Sie in einen Desinfektions-Abfalltopf kippen. Waschen Sie dann sofort die Monoschicht, um alle Spuren vorhandener Medien zu entfernen, indem Sie den Kolben zweimal mit 3 ml steriler 1x PBS-Lösung bei Raumtemperatur spülen. Entsorgen Sie PBS auch in den Desinfektionsmittel-Abfalltopf. Sobald PBS-Waschanlage entfernt ist, fügen Sie 5 ml vorgewärmte 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die gesamte Oberfläche der Zellen und Inkubationszellen für 6-8 min bei 37 °C und 5%CO2zu bedecken. Tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Unterseite des Kolbens zu entfernen und fügen Sie dann 5 ml DMEM Zellkulturmedium (mit Ergänzungen) hinzu, um das Trypsin-Enzym zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml Zentrifugenrohr und pipette die Zellsuspension gründlich nach oben und unten, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig getrennt sind. Zentrifugieren Sie die verdünnte Zellsuspension bei 230 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand in Desinfektionsmittel und suspendieren Sie das Zellpellet in 25 ml DMEM-Zellkulturmedium (mit Ergänzungen). Zellsuspension in einen 75 cm2 Einweg-Zellkulturkolben übertragen und bei 37 °C und 5%CO2 weitere 3 Tage vor der Sphäroidzubereitung inkubieren. Sobald die HepG2s Zeit hatten, sich zu akklimatisieren und wieder 80% Konfluenz zu erreichen, bestimmen Sie die Zellkonzentration in Vorbereitung auf die Sphäroid-Saat. 2. HepG2 Sphäroid-Vorbereitung Wiederholen Sie die oben genannten Subkulturschritte, außer nach der Zentrifugation, setzen Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM-Kulturmedium wieder auf, das in einem 37 °C-Wasserbad vorgewärmt wird. Pipette-Zell-Suspension nach oben und unten gründlich. Score Zelllebensfähigkeit mit dem Trypan Blue Exclusion Assay (siehe OSHA SOP 3.21 Reproductive Toxins, Mutagens, Teratogens and Embryotoxins – Procedures for Safe Handling and Storage (2019) for health and safety guidance)14 with a 1:1 ratio of cell suspension to vor-filtered 0.4% Trypan blue solution. Vor der Zellzählung 1 ml Trypan-Blaulösung mit einer 1 ml Spritze und Filter mit einer 0,45-mm-Filtereinheit in ein steriles, 1 ml-Rohr nehmen. Übertragen Sie 10 l gefilterte, Trypan-blau-Lösung in ein 0,2 ml-Rohr und fügen Sie 10 l Zellsuspension hinzu. Die verbleibende gefilterte Trypan blue Lösung kann bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur für die zukünftige Verwendung gelagert werden. Das Hämozytometer gründlich mit 70% Ethanol besprühen und mit einem sterilen Papiertuch trocken wischen, bevor der Deckelrutsch oben mit Atemdampf gesichert wird. Das Schieben des Deckelrutsches über die atmungsaktive Oberfläche induziert durch die Erzeugung von Newton-Ringen kohäsive Kräfte. Pipette der Trypan-Blauzellenaufhängung nach oben und unten mit einer 1000-L-Pipette (zur Reduzierung der Schiere-Beanspruchung), bevor dem Hämozytometer 10 l hinzugefügt werden. Stellen Sie sicher, dass die Lösung unter dem Deckelschlupf verteilt ist und das gesamte Netz ohne Luftblasen abdeckt. Abbildung 1:Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer. Diagrammmatische Darstellung eines Hämozytometers, der hervorhebt, aus welchem Quadranten Zellen gezählt werden sollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Zählen Sie unter dem Mikroskop die lebenden (unbefleckten) und toten (blau gefärbten) Zellen, die in den vier großen Eckquadraten gefunden wurden (Abbildung 1). Schließen Sie alle Zellen aus, die sich überlappen oder auf den inneren zwei Kanten der großen Eckquadrate (d. h. auf den Linien) in der Anzahl sitzen. Berechnen Sie anhand der folgenden Berechnung die durchschnittliche Anzahl lebender, lebensfähiger Zellen (unbefleckt) in der Stichprobe:Gesamtzahl der Zellen/ml = Anzahl der Lebendzellen x x 10.000wobei sich die Verdünnung darauf bezieht, wie oft die Stammlösung in Trypan blau verdünnt wurde (in diesem Fall 2x) und die Anzahl der gezählten Quadrate sich auf die vier großen Eckquadrate des haemozytometers bezieht, die gezählt wurden Basierend auf der lebensfähigen HepG2-Zellzahl und mit der folgenden Formel:C1V1=C2V2wobeiC1 = die Konzentration lebensfähiger Zellen derzeit,V1 = das Volumen der Zellsuspension derzeit,C2 = Konzentration der Zellsuspension gewünscht,V2 = volumender Zellsuspension gewünscht Bereiten Sie eine 10 ml-Stammlösung der HepG2-Zellsuspension mit DMEM-Zellkulturmedium mit einer Konzentration von 2,0 x 105 Zellen/ml vor, um 4000 HepG2-Zellen pro 20 L hängendem Tropfen zu erreichen. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich, indem Sie mit einer 1000-L-Pipette vorsichtig nach oben und unten pipetieren, um sicherzustellen, dass alle Zellen vollständig in den Medien aufgehängt sind. Zu den Brunnen einer 96-Well-Zellkulturplatte, fügen Sie 100 l sterile Raumtemperatur PBS, um zu verhindern, dass die hängenden Tropfen während der Inkubation austrocknen. Nehmen Sie den Deckel einer Standard-Flachboden 96-Well-Zellkulturplatte, invertieren Sie sie und pipette20 L Tropfen der Zellsuspension vorsichtig in die Mitte jeder Bohrung des Deckels, wie in Abbildung 2gezeigt. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, aber fügen Sie nur 2 – 4 Tropfen auf einmal hinzu, da mehrere Aussaaten die Genauigkeit und Platzierung der Tropfen beeinflussen können. Zentrieren Sie die Tropfen innerhalb der Rillen der Brunnen auf dem Deckel ausgelegt; andernfalls hängen sie nicht in der Mitte der Brunnen, wenn der Deckel der Platte umgedreht wird und laufen Gefahr, in die Platte abzufallen. Drehen Sie den Deckel der 96-Well-Platte vorsichtig um, so dass die Tropfen nun hängen und vorsichtig auf die 96-Well-Platte legen. Legen Sie die gesamte 96-Wellplatte mit Deckel vorsichtig bei 37 °C und 5% CO2 3 Tage vor dem Sphäroidtransfer auf Agarose sanft in einen Inkubator.HINWEIS: Beim Transport der Platten zu/von den Brutkästen ist besonders vorsichtig zu sein, sondern beim Öffnen und Schließen des Inkubators im Allgemeinen, da übermäßige Bewegung dazu führen kann, dass sich die Platten verschieben und die Sphäroide entweder fallen oder sich falsch bilden. Abbildung 2: 3D HepG2 in vitro Sphäroid Modellvorbereitung. (A) Die HepG2-Zellen in 20 l Samen fällt auf den Deckel einer 96-Well-Platte. (B) Die HepG2-Zellen nach dem Aussaat im hängenden Tropfenmodell, um eine Sphäroidbildung zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 3. HepG2 Sphäroidtransfer vom hängenden Tropfen zur Agarose-Suspension HINWEIS: Am Tag 3 nach der Aussaat in hängende Tropfen werden die Sphäroide in die Brunnen der gleichen 96-Well-Platte übertragen, die alle zuvor mit einer feinen Schicht von 1,5% Agarose-Gel beschichtet wurden. Bereiten Sie Agarose-Gele und Autoklaven (d. h. Tag 2 nach der Aussaat) vor dem Tag der Plattenbeschichtung (d. h. Tag 3 nach der Aussaat). Um ein 1,5% Agarose-Gel zuzubereiten, 0,30 g Agarose in eine saubere Glasflasche wiegen und dann 20 ml phenolrotes DMEM-Medium hinzufügen. Autoklavieren Sie die Agarose für 1 h bei 230 °C zur Sterilisation. Die Agarose-Beschichtung verhindert, dass die HepG2-Sphäroide an der Basis von Brunnen haften und eine zelluläre Monoschicht bilden, anstatt ihre 3D-Sphäroidstruktur beizubehalten. Entfernen Sie am 3. Tag nach der Aussaat die 96-Well-Platte mit den HepG2 hängenden Tropfensphäroiden aus dem Inkubator und kippen Sie den Deckel vorsichtig um, damit die Sphäroide nicht mehr hängen. Entfernen und entsorgen Sie mit einer Mehrkanalpipette die 100 L PBS, die zuvor der Basis der 96-Well-Platte hinzugefügt wurden. Lassen Sie die Platten für 2-3 min lufttrocknen, während Sie die Agarose in Vorbereitung auf die Beschichtung erhitzen.VORSICHT: Dieses Verfahren führt zu sehr heißem, flüssigem Agrose, das bei Vergossen auf die Haut brennen und Verletzungen verursachen kann. Darüber hinaus ist beim Umgang mit der Glasflasche, die die flüssige Agarose enthält, Vorsicht geboten, da auch diese sehr heiß sein kann. Mit den zuvor hergestellten 1,5% Agarose-Gelen die Glasflasche mit dem 20 ml Agarose-Gel für 30 s in einer Mikrowelle mit maximal watt (d.h. 900 W) erhitzen. Um zwei 96-Well-Platten zu beschichten, sollte eine 20 ml Flasche vorgefertigtem 1,5% Agarose-Gel ausreichen. Nach dem Schmelzen die Agarose vorsichtig wirbeln, indem Sie die Glasflasche drehen, um Blasen zu entfernen, und dann 50 l Agarose in die Basis jedes Brunnens geben.HINWEIS: Achten Sie beim Hinzufügen der Agarose darauf, die Platte nicht zu winkeln >45°, da sich die Agarose schnell festlegt und keine flache, ebene Schicht bildet, die das Sphäroidwachstum stören kann. Es ist wichtig, in diesem Stadium effizient zu arbeiten, um zu verhindern, dass sich die Agarose verfestigt, bevor die Platte vollständig beschichtet wird. Lassen Sie die Platte für 2 min bei Raumtemperatur stehen, bevor Sie 100 l vorgewärmtes DMEM-Zellkulturmedium (mit Ergänzungen) auf die feste Agaroseschicht in jedem Brunnen hinzufügen. Drehen Sie den Deckel der 96-Well-Platte und legen Sie wieder auf die Oberseite der 96-Well-Platte, so dass die Sphäroide jetzt wieder hängen. Zentrifugieren Sie die Platte für 3 min bei 200 x g, um die Sphäroide aus dem hängenden Tröpfchen in die einzelnen Brunnen der 96-Well-Platte zu übertragen. Nach der Übertragung sollten die HepG2-Sphäroide nun im Zellkulturmedium ausgesetzt werden. Lassen Sie sie sich mit 24 h im Inkubator bei 37 °C und 5%CO2absetzen. HepG2-Sphäroide dieser Größe entweder chemischen oder ENM-Behandlungen am Tag 4 nach der Aussaat aussetzen (d. h. 24 h nach dem Transfer auf Agarose-beschichtete Platten). Um die Zelllebensfähigkeit über längere Kulturperioden zu erhalten, aktualisieren Sie das Zellkulturmedium alle 3 Tage. Um dies zu tun, saugen Sie sanft 50 l des Zellkulturmediums von der Oberfläche des Brunnens und ersetzen Sie durch ein frisches 50 l DMEM Zellkulturmedium. Achten Sie darauf, das Sphäroid nicht zu entfernen oder zu stören, wenn Sie einen Mittlerenwechsel durchführen. 4. Nanomaterial/Chemische Exposition HINWEIS: Das HepG2-Lebersphäroidmodell kann sowohl ENM- als auch chemikalienbasierte Expositionsregime unterstützen, aber der Hauptfokus dieses Protokolls liegt auf ENM-Expositionen. Vor der Exposition muss die Prüfung ENM entsprechend dispergiert sein; dies kann nach anweisungsgemäß durch das NanoGenoTox Dispersion Protocol (Grant Agreement No. 20092101, 2018)15durchgeführt werden. Nach der Dispersion nach dem NanoGenoTox Dispersionsprotokoll die ENM-Suspension von der Anfangskonzentration von 2,56 mg/ml auf die endgültige gewünschte Konzentration im vorgewärmten DMEM-Zellkulturmedium (einschließlich der Ergänzungen) verdünnen. Zur Dosierung einer 96-Well-Platte ist ein Gesamtvolumen von 5 ml erforderlich. Um das HepG2-Sphäroid entweder einer Chemikalie oder einem ENM auszusetzen, indem man eine 200-L-Pipette verwendet, saugen Sie 50 l Zellkulturmedium von der Oberfläche jedes Brunnens ab (wobei 50 l im Brunnen bleiben, um die Sphäroide nicht zu stören) und durch 50 l Medium zu ersetzen, das das Testgiftmittel in der erforderlichen Dosis enthält. Nach dem Aufbringen des Prüfmaterials die Platten für die gewünschte Belichtungszeit bei 37 °C und 5%CO2inkubieren. Wenn ein langfristiges (≥24 h) Expositionsregime durchgeführt wird, dann ernten Sie unmittelbar nach Ablauf des gewünschten Expositionszeitraums die Sphäroide für die Mikrokernendpunktanalyse, wie unten in den Schritten 6.1 – 6.4 beschrieben. Bei akuten Expositionsregimen (z. B. ≤24 h) werden jedoch nach Ablauf der Expositionsperiode 50 L Überstand aus jedem Brunnen in der 96-Wellplatte bei -80 °C für weitere biochemische Analysen später geerntet und gelagert. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch 50 l frisches Medium, das 6 g/ml Cytochalasin B enthält, und lassen Sie es für 1 – 1,5 Zellzyklen (d. h. 24 – 26 h für HepG2) in Vorbereitung auf die Zytokineseblock-Mikrokern-Assay-Ernte inkubieren.HINWEIS: Bei akuten (≤24 h) Expositionsregimen kann der Zytokineseblock-Mikrokern-Assay mit Cytochalasin B angewendet werden, aber für langfristige (≥24 h) Expositionsregime muss die mononukleare Version (ohne Cytochalasin B) des Assays wie unten in Abbildung 4beschrieben verwendet werden. 5. HepG2 Sphäroid-Ernte HINWEIS: Nach chemischen oder ENM-Expositionsbehandlungen können sowohl Zellkulturmedium als auch Sphäroidgewebe für die Analyse mehrerer Endpunkte geerntet werden. Je nach Endpunktanalyse können Sphäroide entweder einzeln geerntet (z.B. für die Bildanalyse) oder zusammengepoolt werden (z.B. für Zytokinese-Mikrokern-Assay). Entfernen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator. Mit einer 200-L-Pipette die 100 L Zellkulturmedium einschließlich des Sphäroidgewebes aus jedem Brunnen aspirieren und in einem sterilen, 15 ml Zentrifugenrohr sammeln. Achten Sie darauf, den Kontakt mit der Agarose zu vermeiden. Zentrifugieren Sie nach der Erhebung die Sphäroidsuspension bei 230 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie bei -80 °C für weitere Endpunktanalysen (z. B. Leberfunktionstests) später. Das Pellet der Sphäroide in 1 ml steriler Raumtemperatur PBS (1x) wieder aufhängen. Nach dem Waschen die Sphäroidsuspension wieder bei 230 x g für 3 min zentrieren. Den Überstand entsorgen, in 500 l mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung erneut aussetzen und 6-8 min bei 37 °C und 5%CO2inkubieren. Nach der Inkubation pipettedien die Trypsinisierten Zellen sanft nach oben und unten, um die HepG2-Zellen vollständig zu trennen und wieder aufzuhängen, bevor sie mit 1 ml DMEM-Zellkulturmedium neutralisiert werden. Zentrifugieren Sie die verdünnte Zellsuspension bei 230 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand in desinfizierendes und setzen Sie das Zellpellet in 2 ml Raumtemperatur PBS (1x) wieder auf. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 230 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand in desinfizierend und setzen Sie das Zellpellet dann erneut in 2 ml kaltem PBS (1x) wieder auf. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut dispergiert sind, um zu verhindern, dass Zellklumpen das Sichtfeld verdecken, wenn sie auf Mikroskopschlitten montiert werden. 6. Mikrokern-Assay und Scoring Für die manuelle Methode des Mikrokern-Assays ist eine Zytozentrifuge erforderlich, um ein Zytodot (eine definierte, konzentrierte Zellregion) in der Mitte des Mikroskopschlittens zu erzeugen. Dieser Prozess unterstützt eine effizientere Bewertung der Folie, da es dem Scorer ermöglicht, die Zellen von Interesse leicht zu lokalisieren, im Gegensatz zur Auswertung einer ganzen Folie, in der die Zellen weit verbreitet werden können. Tauchen Sie gefrostete Mikroskop-Dias (drei pro Dosis) in 70% Ethanol gefolgt von ddH2O und lassen Sie an der Luft für 5 min trocknen. Das präparierte Mikroskop gleitet in den Küvettentrichter, wie in Abbildung 3Adargestellt, wo der Glasschlitten (iii) mit einer Filterkarte (ii) und einem darüber befestigten Küvettentrichter (i) in den Metallträger (iv) gelegt wird. Ordnen Sie Küvettentrichter in der Zytozentrifuge mit nach oben gerichtetem Trichter an, so dass jeweils 100 l Zellsuspension direkt zugegeben werden können. Cytospin für 5 min bei 500 x g, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig auf die Oberfläche des Dias verteilt sind. Abbildung 3: Cytospin-Setup zur Vorbereitung behandelter Zellen auf Mikroskopschlitten. (A) Zeigt die einzelnen Komponenten, (i) Küvettentrichter, (ii) Filterkarte, (iii) Glasmikroskopschlitten und (iv) Metallunterstützung an, die erforderlich ist, um HepG2-Zellen auf Mikroskopschlitten zu verdrehen. (B) Der endgültige Küvettentrichter wurde aufgestellt. (C) Die korrekte Platzierung des Küvettentrichters innerhalb der Zytozentrifuge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Lassen Sie die Dias vor der Fixierung in eiskalt, 90% Methanol für 10 min, an die Luft trocknen. Lassen Sie die Dias nach der Fixe über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, bevor Sie sie bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern. Entfernen Sie bei Bedarf die vorgefertigten Mikroskopschlitten aus dem Gefrierschrank von -20 °C und lassen Sie sich vor der Giemsa-Färbung auf Raumtemperatur erwärmen.VORSICHT: Gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 [CLP] ist die Giemsa-Färbelösung eine leicht entzündliche Flüssigkeit, die bei Verschlucken giftig sein kann und bei Kontakt mit Denaugen, Haut oder beim Einatmen Schäden verursacht. Detaillierte Lagerungs-, Handhabungs-, Gesundheits- und Sicherheitshinweise zu dieser Chemikalie vor der Verwendung finden Sie auf dem zugehörigen SDS-Blatt. Während die Dias auftauen, bereiten Sie eine 20% Giemsa-Färbungslösung (25 ml erforderlich, um 30 Dias zu färben) in Phosphatasepuffer (pH 6.8) verdünnt. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie die Lösung vorsichtig verwirbeln, bevor Sie mit gefaltetem Filterpapier filtern, das in einen Trichter gelegt wird. Mit einer Pasteur Pipette 3 – 5 Tropfen gefilterte Giemsa-Lösung auf jedem Schlitten zum Zytodot geben und 8 – 10 min lassen. Waschen Sie Dias in zwei aufeinanderfolgenden Phosphatase-Pufferwäschen, bevor Sie kurz unter kaltem Wasser spülen, um überschüssige Fleckenreste zu entfernen. Lassen Sie die Dias an der Luft trocken. Einmal trocken, in einer Dunstabzugshaube, tauchen Sie gebeizt Dias in Xylol für 10 s, bevor Sie einen Tropfen Desontes medium in die Mitte des Zytodots und einen Platz ein Glasabdeckungslip auf der Oberseite hinzufügen. Lassen Sie Mikroskop-Dias in der Dunstabzugshaube über Nacht trocknen, bevor sie manuell bewertet werden; sie können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden. 7. Datenanalyse Wie in den OECD-Testrichtlinien 487 (2014)11beschrieben, verwenden Sie ein Lichtmikroskop (100x Objektiv mit Tauchöl) 2000 mononukleierte oder 1000 binukleierte Zellen pro biologischer Replikation, um das Vorhandensein von Mikrokernen zu bewerten, wie in Abbildung 4dargestellt. Abbildung 4: Micronucleus Assay Scoring Entscheidungsbaum. Schematische Entscheidungsstruktur, um die Notwendigkeit unterschiedlicher Bewertungsverfahren für Scoring und Zytotoxizität bei der Verwendung des Mikrokern-Assays mit 3D-Modellen nach akuten oder langfristigen Expositionsregimen hervorzuheben. Akute (≤24 h) Expositionen ermöglichen die Verwendung des zytokinesisblockierten Mikrokerntests, während langfristige (≥24 h) Expositionen die mononukleare Version des Assays erfordern; beide sind in der OECD-Testleitlinie 487 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Berechnen Sie auf der Grundlage des Anteils der Mikronuklei pro Anzahl der bewerteten mononukleierten oder binucleatierten Zellen einen Prozentsatz des Genotoxizitätswertes. Um die beobachtete DNA-Schädigung nicht als Folge von Zellablagerungen durch einen hohen Anteil an apoptotischen Zellen verursacht, nehmen Sie ein Maß der Zytotoxizität neben. Verwenden Sie in diesem Fall je nach Vorhandensein von Cytochalasin B entweder CPBI- oder RVCC-Berechnung (wie in Abbildung 4beschrieben ). Die Genotoxizität darf nur in Proben bewertet werden, in denen die Zytotoxizität weniger als 55 % ± 5 % beträgt, wie in der OECD-Testleitlinie 48711definiert.