该程序被确定用于在体外培养先进的3D肝培养物,它可以提供与纳米材料暴露在急性或长期重复剂量制度相关的基因毒性危害的生理相关评估。
由于各种工程纳米材料 (ENM) 的快速开发和实施,接触 ENM 是不可避免的,开发强大、预测性的体外测试系统至关重要。肝毒学是考虑ENM暴露的关键,因为肝脏在代谢平衡和排毒中起着至关重要的作用,并且是ENM暴露后积累的主要部位。基于这一点和公认的理解,2D肝细胞模型不能准确地模拟复杂的多细胞相互作用和体内观察到的代谢活动的复杂性,因此,人们更加注重开发生理相关的3D肝脏模型,这些模型专为ENM在体外的危险评估目的而定制。根据3R取代、减少和完善动物实验的原则,开发了3D HepG2细胞系肝脏模型,这是一个用户友好、经济高效的系统,可支持延长和重复的ENM暴露制度(≤14天)。这些球形模型(直径为 500 μm ≥)保留了其增殖能力(即分细胞模型),允许它们与”黄金标准”微核测定相结合,以有效评估体外基因毒性。他们报告一系列毒理学终点(如肝功能、(亲)炎症反应、细胞毒性和基因毒性)的能力,在急性(24 h)和长期(120 h)暴露机制中都使用多种ENM。这种 3D 体外肝模型能够用于评估更逼真的 ENM 暴露,从而提供未来的体外方法,以常规且易于访问的方式更好地支持 ENM 危险评估。
由于在大量基于人类的应用(如食品、化妆品、服装、体育器材、电子、运输和医药)中迅速发展和实施了各种工程纳米材料 (ENM),人类不可避免地会定期接触 ENM。由此,人们更加担心,认为这些材料在众多应用中具有优势的新型、尺寸特定的物理化学特性可能会同时对人类健康和环境造成不利影响。目前,许多国际活动正在开展,以积极反映与生理上更相关的接触这些ENM,并评估这些材料在急性、长期和反复的低剂量暴露情况下的潜在毒性。
肝毒学是考虑ENM暴露的关键,因为众所周知,肝脏是ENM积累后暴露1,2的主要部位。此外,肝脏是进入系统循环3的物质代谢和排毒的主要器官系统。基于公认的理解,2D肝细胞模型不能准确地模仿复杂的多细胞相互作用的复杂性或适当代表体内观察到的代谢活动,4、5已确定更注重开发体外替代技术的健壮和生理相关的体外3D肝脏模型。利用先进的3D培养技术可延长体外肝模型的寿命,从而可以研究长期、重复的暴露制度。此外,这种先进的文化形式促进了增强的生理、有机特征的形成,如胆汁管状、活性运输过程和提高CYP450药物代谢能力,从而提高了模型6的预测性。目前由单一培养物(仅限肝细胞)或共生培养(具有非帕伦奇细胞的肝细胞)组成的体外肝模型以多种形式存在, 从超低粘附板中的微质素或球体、悬垂球体、嵌入矩阵和/或脚手架中的细胞以及微流体细胞培养平台,所有这些都被认为是肝毒性评估6、7的有效高级体外模型。然而,这些型号系统大部分是高维护,需要专门设备,而且价格昂贵。此外,这些模型通常是静态的(即非分割细胞模型),防止它们用于危险终点的评估,例如使用量化固定DNA损伤的方法进行基因氧化测试。基因毒性是监管毒理学的核心前提,是任何毒物8的风险评估的重要组成部分。没有单一的检测可以用来量化接触外源性剂后可能出现的所有形式的DNA损伤。然而,体外基因氧化测试电池的核心部件是微核检测,这是一种可靠和多方面的技术,测量总染色体损伤9。这是经合组织测试指南487描述的一种黄金标准技术,用于评估体外DNA损伤和基因毒性,是监管危险评估10,11测试电池要求的一部分。
人类肝细胞癌细胞系,HepG2,被广泛用于初始危险评估筛查,因为细胞是现成的,相对便宜的来源,简单的培养和适应高吞吐量筛查12,13。当培养成3D球形结构时,它们已被证明能够很好地回顾肝脏微环境,并提供具有足够增殖能力的肝模型来支持微核测定3。进一步开发 HepG2 球形模型是为了提高模型的寿命和肝脏样功能,以支持长期重复暴露制度(≤14 天)的基因毒性危害评估。因此,根据3R取代、减少和改进动物实验的原则,本议定书已经建立,以提供先进的3D体外肝模型,能够可靠地评估多种毒理学终点(例如肝脏功能、(亲)炎症标记、细胞毒性和基因毒性),在常规和容易获得的常规和易于接触的化学品和ENM暴露之后。
在这里,我们提出了一种方法,建立一个生理相关的3D肝细胞系为基础的体外模型系统,用于在急性或长期重复ENM暴露后进行基因毒性危害评估。该协议可分为6个关键阶段:培养冷冻保存的HpG2细胞:HepG2 球形制备:HepG2 球形从悬垂转移到高糖悬架;赫普2球形收获:微核测定和评分;和数据分析。
3D肝模型的应用因特定的生化终点或目标的不良结果途径而有很大差异。每个模型都有其优点和局限性,从原始人类肝细胞 (PHH) 模型的捐赠者变异到基于细胞系模型的细胞色素 p450 活性降低,但所有这些模型本身都是有价值的 6、12、18、19。在评估基因毒性时,模型与监管批准的端点(如体外微核检测)相容性存在限制,因为需要活性增殖。这是必要的,因为基因毒性评估要求在DNA修复有机会纠正瞬态病变时,对固定DNA损伤的量化进行细胞分裂后进行评估。不幸的是,高度分化的肝细胞(即肝素)基球体或PHH微毒素,它们被认为是表现出最生理上相关的肝脏样特征形成静态(非扩散)模型12,19,20。因此,此处介绍的 3D HepG2 球形模型提供了一个合适的替代模型,能够支持基因毒性测试。HepG2细胞系球体在球体外表面有足够的主动分割细胞,同时保持基本的肝脏样特征,如白蛋白和尿素的产生和一些CYP450活性5,12,19。主要是这种体外肝脏模型已经开发,以补充微核检测,因为这是两个体外检测建议在电池中基因氧化测试8,10,11,21之一。然而,该模型可以很容易地应用于DNA测序分析和基因表达(RNA)技术,同时它有可能被进一步调整和用于其他DNA损伤终点,如彗星测定。尽管如此,重要的是要考虑ENM干扰在某些端点分析中的作用。例如,基于流细胞学的分析可能不适合ENM基因毒性评估,特别是由于粒子干扰22。
积极进行细胞分裂的球形模型的一个限制因素是它们的大小。优化播种密度至关重要,因为需要有足够的细胞,使模型继续增殖:但不是太高的细胞数,这导致球体变得过于紧凑,导致坏死核心增加。这种坏死的原因被认为是受限的氧气和营养扩散,因为这种扩散的极限被认为是大约100-150 μm的组织23,24。然而,这确实取决于细胞类型,细胞数量,脚手架相互作用和文化条件25。因为,已经表明,大约700μm直径是避免C3A球体中心过早坏死的极限,播种4000 HepG2细胞每个球体确保模型的直径在暴露时是≤500μm26。此外,Shah等人证实,在培养7天后,在球体外5000个细胞以上播种的 HepG2 细胞的存活率降低了 25%,这可能与平均直径为 680 μm 和 20 μL 悬垂下降5中营养物质的有限供应有关。为了克服这一点,本协议中设计的模型经历了一个关键步骤,即在球体初步形成后,悬垂滴被转移到高糖涂层井中。这确保了存在更多的培养介质,以维持球体中不断增长的细胞数量。因此,HepG2球形模型在培养10天后仍然超过70%的可行性,并可用于体外长期危险评估。
虽然 HepG2 球形模型可以支持急性和长期暴露机制,但该模型在延长培养期内刷新细胞培养介质受到限制,因为由于球体的潜在损失,不建议完全更换介质。据推测,在ENM暴露下,同质ENM分散到聚集体和沉积物的倾向很高。然而,值得注意的是,ENM沉积物的速率可能因粒子参数(如大小、形状和密度)而异,并且可以使用体外沉积、扩散和文量(ISDD)模型或其最近的衍生物(通常是指在 ENM(悬浮)暴露接近27、28时)从理论上确定。有鉴于此,假设只有50%的细胞培养介质被小心地从细胞培养表面移除,那么从理论上讲,ENM剂量的中断和随后的去除应该是最小的。然而,随着布朗的动议发挥作用,这可能并非严格的情况下,并进一步的工作,以沉积和沉积每个特定的ENM测试,以确保正确的剂型保留在整个长期暴露制度27。主要是,在执行重复的给精制度时,这是一个潜在的限制,因为这可能对最终的累积浓度至关重要。另一方面,基于化学的暴露,虽然不是没有自己的限制考虑,提供了一个更简单的方法,因为化学物质往往留在溶液中,因此直接取代原来的化学浓度,除了新增加的浓度,确保任何化学品在媒体茶点期间丢失的相应更换29。未来的应用将包括评估模型是否适合长期培养期间的重复接触制度,因为重复给药策略对于评估特定器官系统改善或克服由异种生物物质生物积累引起的不利影响(如果有的话)的能力至关重要。
总之,这种3D体外肝模型有能力用于评估一系列逼真的暴露方案,从而提供未来的体外方法,以常规和易于访问的方式更好地支持ENM和化学危害评估。
The authors have nothing to disclose.
作者希望承认,根据第760813号赠款协议,这项研究已获得欧洲联盟Horizno 2020研究和创新方案的资助,用于SARAS项目
Aflotoxin B1 | Sigma Aldrich, UK | A6636-5MG | |
Agarose | Sigma Aldrich, UK | A9539-50G | |
Autoclave Tape | |||
BCG Albumin Assay | Sigma Aldrich, UK | MAK124 | |
Bovine Serum Albumin Powder | Sigma Aldrich, UK | A9418 | |
Cell Freezing Aid | Thermo Fisher Scientific, UK | 5100-0001 – Mr Frosty | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Cytochalasin B | Merck, UK | 250233 | |
Cytology Metal Clips | |||
Cytospin 4 Centrifuge | ThermoFisher Scientific, UK | CM00730202 | |
DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine | GIBCO, Paisley, UK | 41965-039 | |
DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes | GIBCO, Paisley, UK | 21063-029 | |
DPX Mounting Medium | FisherScientific, UK | D/5330/05 | |
Ethanol | FisherScientific, UK | 10048291 | |
FBS | GIBCO, Paisley, UK | 10270-106 | |
Filter Cards for Shandon Cytospin | FisherScientific, UK | 15995742 | |
Frosted Glass Slides | ThermoFisher Scientific, UK | ||
Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr | VWR Chemicals, UK | MFCD00081642 | |
Glass Coverslips (24 x 60) | Deckglaser, VWR | ECN631-1575 | |
Haemocytometer and Coverslip | |||
Immersion Oil for Microscope | Zeiss, UK | 518F, ISO8034 | |
Laminar Class II Tissue Culture Hood | Scanlaf Mars | ||
Light Microscope | Zeiss, UK | Axiovert 40C | |
Liquid Nitrogen | |||
Methanol | FisherScientific, UK | 10284580 | |
Microwave | |||
Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips | Greiner-Bio-One, UK | ||
NuncMicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific, Denmark | 167008 | |
P1000 and P200 micropipettes | |||
P300 and P50 multi-channel pipettes | |||
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free | GIBCO, Paisley, UK | 14190-094 | |
Pen/Strep | GIBCO, Paisley, UK | 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml | |
Phosphatase Buffer Tablets | GIBCO, Paisley, UK | 10582-013 | |
Pipette Boy | |||
Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges | FisherScientific, UK | 11690581 | |
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe | Branson, USA | 101-063-971R | |
T-25 and T-75 Tissue Culture Flask | Greiner-Bio-One, UK | T-25 (690175) and T-75 (660175) | |
Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich, UK | T8154-100mL | |
Urea Assay Kit | Sigma Aldrich, UK | MAK006 | |
Virkon Disinfectant | DuPont, UK | Rely+On Virkon | |
Water Bath (37˚C) | Grant JBNova 18 | ||
Weighing Balance | |||
Xylene | FisherScientific, UK | 10588070 | |
0.05% Trypsin-EDTA | GIBCO, Paisley, UK | 5300-054 | |
0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
0.45µm Filter Unit | Millex HA, MF-Millipore, UK | SLHA033SS | |
1.0mL Syringe | BD Plastipak, FisherScientific, UK | 300185 | |
20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps | DWK Life Sciences GmbH, Germany | WHEA986581 | |
37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator | NUAIRE DHD Autoflow | ||
3mL Pasteur Pipette | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL Conical Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL or 100mL Glass Bottles | |||
50mL Skirted Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
5mL, 10mL and 25mL Pipettes | Greiner-Bio-One, UK | ||
9.4cm Square, Petri Dish | Greiner-Bio-One, UK | 688161 |