نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل
Summary
وقد ثبت أن هذا الإجراء يستخدم لتطوير ثقافات كبدية ثلاثية الأبعاد متقدمة في المختبر، والتي يمكن أن توفر تقييما أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية للمخاطر الجينية المرتبطة بالتعرض للمواد النانوية على حد سواء على المدى الحاد أو الطويل، نظم الجرعة المتكررة.
Abstract
نظرا للتطور السريع والتنفيذ لمجموعة متنوعة من المواد النانوية المهندسة (ENM) ، فإن التعرض ل ENM أمر لا مفر منه وتطوير أنظمة اختبار قوية وتنبئية في المختبر أمر ضروري. علم السموم الكبدي هو المفتاح عند النظر في التعرض ENM، كما الكبد يخدم دورا حيويا في التوازن الأيضي وإزالة السموم، فضلا عن كونها موقعا رئيسيا لتراكم ENM بعد التعرض. وبناء على هذا والفهم المقبول بأن نماذج خلايا الكبد 2D لا تحاكي بدقة تعقيدات التفاعلات المعقدة متعددة الخلايا والنشاط الأيضي الملاحظ في الجسم الحي ، هناك تركيز أكبر على تطوير نماذج الكبد ثلاثية الأبعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية المصممة لأغراض تقييم مخاطر ENM في المختبر. وتمشيا مع مبادئ 3Rs لاستبدال وتقليل وصقل التجارب على الحيوانات ، وقد تم تطوير نموذج الكبد 3D HepG2 خط الخلية القائمة ، وهو نظام سهل الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن تدعم كل من نظم التعرض الموسعة والمتكررة ENM (≤14 يوما). تحتفظ هذه النماذج الكروية (قطرها ≥500 ميكرومتر) بقدرتها التكاثرية (أي تقسيم نماذج الخلايا) مما يسمح لها بالاقترن بمسيح النوى الدقيق “القياسي الذهبي” لتقييم السمية الجينية في المختبر بشكل فعال. وقد تميزت قدرتها على الإبلاغ عن مجموعة من نقاط النهاية السمية (مثل وظائف الكبد والاستجابة الالتهابية (المؤيدة) والسمية الخلوية والسمية الجينية باستخدام عدة تدابير تحديد النمس عبر كل من نظم التعرض الحادة (24 ساعة) وطويلة الأجل (120 ساعة). هذا النموذج الكبدي ثلاثي الأبعاد في المختبر لديه القدرة على الاستفادة منه لتقييم التعرض ل ENM أكثر واقعية ، وبالتالي توفير نهج مستقبلي في المختبر لدعم تقييم مخاطر ENM بشكل أفضل بطريقة روتينية وسهلة الوصول إليها.
Introduction
نظرا للتطور السريع والتنفيذ السريع لمجموعة متنوعة من المواد النانوية المهندسة (ENM) عبر عدد كبير من التطبيقات البشرية (مثل الطعام ومستحضرات التجميل والملابس والمعدات الرياضية والإلكترونيات والنقل والطب) ، فمن المحتم أن يتعرض البشر لENM على أساس منتظم. مع هذا، هناك مخاوف متزايدة من أن الرواية، وحجم الخصائص الفيزيائية الكيميائية المحددة التي تعتبر هذه المواد مفيدة في العديد من التطبيقات يمكن أن يسبب آثارا سلبية على صحة الإنسان والبيئة في الوقت المناسب. ويوجد حاليا العديد من الأنشطة الدولية التي تعكس بفعالية التعرض الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لهذه المعدات وتقييم السمية المحتملة لهذه المواد على سيناريوهات التعرض الحاد والطويل الأجل والمتكررة للجرعات المنخفضة.
السموم الكبدية هو المفتاح عند النظر في التعرض ENM، كما هو معروف على نطاق واسع أن الكبد هو موقع رئيسي لتراكم ENM بعد التعرض1،2. وعلاوة على ذلك، فإن الكبد هو الجهاز الأساسي لنظام التمثيل الغذائي وإزالة السموم من المواد التي تدخل الدورة الدموية الجهازية3. استنادا إلى الفهم المقبول بأن نماذج خلايا الكبد 2D لا تحاكي بدقة تعقيدات التفاعلات المعقدة متعددة الخلايا أو تمثل بشكل مناسب النشاط الأيضي الملاحظ في الجسم الحي ، فقد تم إنشاء تركيز أكبر على تطوير نماذج كبد 3D قوية و ذات صلة فسيولوجية في المختبر لتقنيات استبدال الجسم الحي4،5. إن استخدام تقنيات متطورة في مجال الثقافة ثلاثية الأبعاد يحسن من طول عمر النماذج الكبدية في المختبر مما يسمح بإجراء دراسة لأنظمة التعرض المتكررة على المدى الطويل. بالإضافة إلى ذلك، هذا الشكل ثقافة متقدمة يعزز تشكيل تعزيز الفسيولوجية، والميزات العضوية مثل canaliculi الصفراء، وعمليات النقل النشط وتحسين قدرات استقلاب المخدرات CYP450، وبالتالي تحسين التنبؤية للنماذج6. نماذج الكبد ثلاثية الأبعاد الحالية في المختبر التي تتكون من ثقافات أحادية (خلايا الكبد فقط) أو الثقافات المشتركة (خلايا الكبد مع الخلايا غير الحيوية) موجودة في عدة أشكال، بدءا من microtissues أو كرويات في لوحات التصاق فائقة التوهج، شنقا قطرة كرويدات، والخلايا جزءا لا يتجزأ من المصفوفات و / أو السقالات ومنصات ثقافة الخلايا microfluidic، وكلها تعتبر فعالة متقدمة في نماذج المختبر لتقييم السمية الكبدية6،7. ومع ذلك، فإن غالبية هذه النظم النموذجية هي صيانة عالية، وتتطلب معدات متخصصة ومكلفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه النماذج غالبا ما تكون ثابتة (أي نماذج الخلايا الناندية) التي تمنع استخدامها في تقييم نقاط نهاية الخطر، مثل اختبار السمية الجينية باستخدام أساليب تحدد حجم تلف الحمض النووي الثابت. السمية الجينية هي شرط أساسي في علم السموم التنظيمي ، وهو عنصر حيوي في تقييم المخاطر لأيمادة سامة 8. لا يوجد أي فحص واحد يمكن تطبيقه لتحديد جميع أشكال تلف الحمض النووي التي قد تنشأ بعد التعرض لعامل خارجي. ومع ذلك ، فإن المكون الأساسي لبطارية اختبار السمية الجينية في المختبر هو المقايسة النووية الدقيقة ، وهي تقنية موثوقة ومتعددة الأوجه تقيس الضرر الكروموسومي الإجمالي9. وهو تقنية معيار الذهب التي وصفها اختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي المبدأ التوجيهي 487، لتقييم تلف الحمض النووي في المختبر والسمية الجينية وجزء من متطلبات بطارية الاختبار لتقييم المخاطر التنظيمية10،11.
يستخدم خط الخلية السرطانية الكبدية البشرية ، HepG2 ، على نطاق واسع لفحص تقييم المخاطر الأولي حيث أن الخلايا متاحة بسهولة ، وغير مكلفة نسبيا للمصدر ، وبسيطة للثقافة وقابلة لفحص الإنتاجية العالية12،13. عندما مثقف في الهياكل كروية 3D، وقد ثبت أن تلخيص البيئة الدقيقة الكبد بشكل جيد وتقديم نموذج كبدي مع قدرات الانتشار كافية لدعم المقايسة micronucleus3. 10- وقد أنشئ مزيد من التطوير لنماذج كروية HepG2 لتحسين طول العمر والأداء الوظيفي الشبيه بالكبد للنموذج من أجل دعم تقييم مخاطر السمية الجينية على مدى نظم التعرض المتكررة الطويلة الأجل (≤14 يوما). وهكذا، وتمشيا مع مبادئ 3Rs لاستبدال وتقليل وصقل التجارب على الحيوانات، تم وضع هذا البروتوكول لتوفير نموذج متقدم ثلاثي الأبعاد في المختبر الكبدي قادر على تقييم نقاط النهاية السمية المتعددة بشكل موثوق (على سبيل المثال، وظائف الكبد، (المؤيدة) علامات الالتهاب، السمية الخلوية والسمية الجينية) بعد التعرض الحاد والطويل الأجل والمتكرر للمواد الكيميائية وENM بطريقة روتينية وسهلة الوصول إليها.
هنا، نقدم طريقة لإنشاء خط خلايا كبدية ثلاثية الأبعاد ذات صلة من الناحية الفسيولوجية تستند إلى نظام نموذج المختبر لتقييم مخاطر السمية الجينية بعد التعرض الحاد أو الطويل الأجل ل ENM المتكرر. يمكن تقسيم البروتوكول إلى 6 مراحل رئيسية: زراعة خلايا HepG2 المبردة؛ وزراعة خلايا 10000000000000000000000000000000000000000000000000 إعداد كروية HepG2; نقل كروية HepG2 من إسقاط شنقا لتعليق agarose; حصاد كروية HepG2; المقايسة micronucleus والتهديف؛ وتحليل البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تختلف تطبيقات النماذج الكبدية ثلاثية الأبعاد بشكل كبير اعتمادا على نقطة النهاية الكيميائية الحيوية الخاصة أو مسار النتائج السلبية المستهدف. كل نموذج له فوائده وحدوده، من الاختلاف بين الدونور في الخلايا الكبدية البشرية الأولية (PHH) نماذج لخفض نشاط السيتوكروم P450 في النماذج القائمة على خط الخلية، ولكن كلها قيمة في حد ذاتها6،12،18،19. عند تقييم السمية الجينية هناك قيود في النماذج التوافق مع نقاط النهاية المعتمدة التنظيمية مثل المقايسة النووية الدقيقة في المختبر، كما هو مطلوب الانتشار النشط. وهذا ضروري، حيث يتطلب تقييم السمية الجينية تقييم كمية تلف الحمض النووي الثابت بعد انقسام الخلايا عندما تكون هناك فرصة لإصلاح الحمض النووي لتصحيح الآفات العابرة. لسوء الحظ، خلايا الكبد المتباينة للغاية (أي هيبارج) القائمة على كرويدات أو الخلايا المجهرية PHH، والتي تعتبر لإظهار الخصائص الأكثر صلة من الناحية الفسيولوجية تشبه الكبد تشكل نماذج ثابتة (غير التكاثرية)12،19،20. ونتيجة لذلك، يوفر نموذج كروية HepG2 ثلاثي الأبعاد المعروض هنا نموذجا بديلا مناسبا قادرا على دعم اختبار السمية الجينية. HepG2 الخلية خط القائم على كرويدات لديها ما يكفي من الخلايا تقسيم بنشاط على السطح الخارجي للسفيرويدات مع الحفاظ على خصائص أساسية تشبه الكبد، مثل إنتاج الألبومين واليوريا وبعض النشاط CYP4505،12،19. أساسا هذا النموذج في الكبد المختبر وقد وضعت لاستكمال المقايسة micronucleus، وهذا هو واحد من اثنين في المختبر المقايسات الموصى بها في البطارية لاختبار السمية الجينية8،10،11،21. ومع ذلك، يمكن تطبيق النموذج بسهولة على تحليل تسلسل الحمض النووي وتقنيات التعبير الجيني (RNA)، في حين أن لديه القدرة على زيادة تكييفه واستخدامه لنقاط نهائية أخرى لتلف الحمض النووي، مثل فحص المذنب. ومع ذلك، من المهم النظر في الدور الذي يلعبه تدخل ENM في بعض تحليلات نقاط النهاية. على سبيل المثال، قد لا تكون التحليلات المستندة إلى قياس التدفق الخلوي مناسبة لتقييم السمية الجينية ENM على وجه التحديد بسبب تداخل الجسيمات22.
أحد العوامل المقيدة لنماذج كروية تخضع بنشاط لتقسيم الخلايا هو حجمها. تحسين كثافة البذر أمر بالغ الأهمية حيث يجب أن يكون هناك ما يكفي من الخلايا التي تسمح للنموذج بالاستمرار في الانتشار؛ ولكن ليس عدد الخلايا عالية جدا، مما يؤدي إلى كروية تصبح مدمجة بشكل مفرط، مما يؤدي إلى زيادة النواة النخرية. ويعتقد أن سبب هذا النخر هو تقييد الأكسجين ونشر المواد الغذائية ، حيث يعتقد أن الحد الأقصى لهذا الانتشار هو حوالي 100 – 150 ميكرومتر من الأنسجة23،24. ومع ذلك، هذا يعتمد على نوع الخلية، رقم الخلية، التفاعلات سقالة وظروف الثقافة25. منذ ذلك الحين ، فقد ثبت أن قطرها حوالي 700 ميكرومتر هو الحد الأقصى لتجنب ظهور مبكر للنخر في وسط كرويدات C3A ، البذر 4000 خلايا HepG2 لكل كروية يضمن قطر النموذج في وقت التعرض هو ≤500 ميكرومتر26. وعلاوة على ذلك، أثبت شاه وآخرون أن خلايا HepG2 المصنفة فوق 5000 خلية لكل كروية أظهرت انخفاضا بنسبة 25٪ في الجدوى بعد 7 أيام في الثقافة، والتي يمكن أن تتعلق بمتوسط قطر 680 ميكرومتر والتوافر المحدود للمغذيات في قطرة معلقة 20 ميكرولتر5. للتغلب على ذلك ، يخضع النموذج الذي تم وضعه في البروتوكول الحالي لخطوة حاسمة حيث يتم نقل قطرة الشنق إلى آبار مغلفة ب agarose بعد التكوين الأولي للسفيرويد. وهذا يضمن وجود حجم أكبر من وسيط الثقافة للحفاظ على العدد المتزايد من الخلايا داخل كرويدات. ونتيجة لذلك، فإن نموذج كروية HepG2 لا يزال أكثر من 70٪ قابلة للحياة بعد 10 أيام في الثقافة ويمكن استخدامها لتقييم المخاطر على المدى الطويل في المختبر.
في حين أن نموذج كروية HepG2 يمكن أن يدعم أنظمة التعرض الحادة والطويلة الأجل ، فإن متوسط ثقافة الخلايا المنعشة خلال فترات الثقافة الممتدة مقيد لهذا النموذج حيث لا ينصح باستبدال الوسط بالكامل بسبب الخسارة المحتملة للشفرات. ومن المفترض أنه مع التعرض ل ENM، فإن الميل إلى تشتت ENM متجانس للتكتجمعات والرواسب مرتفع. ومع ذلك، فمن الجدير بالذكر أن المعدل الذي يمكن أن تختلف به رواسب ENM اعتمادا على معلمات الجسيمات (على سبيل المثال، الحجم والشكل والكثافة) ويمكن تحديده نظريا باستخدام نموذج الترسيب في المختبر ونشره وقياس الجرعات (ISDD)، أو مشتقاته الحديثة، والتي يشار إليها غالبا عند اقتراب التعرض ل ENM (التعليق)من 27و28. مع هذا هو العقل, ومن المفترض أنه إذا كان فقط 50٪ من الخلايا ثقافة المتوسطة تتم إزالتها بعناية من سطح ثقافة الخلية, وينبغي تعطيل وإزالة لاحقة من جرعة ENM يكون الحد الأدنى من الناحية النظرية. ومع ذلك ، مع الحركة براونيان في اللعب ، وهذا قد لا يكون هو الحال تماما ، وينبغي القيام بمزيد من العمل في ترسب وترسب كل ENM معينة لاختبارها لضمان الاحتفاظ قياس الجرعات الصحيح في جميع أنحاء أنظمة التعرض على المدى الطويل27. وهذا أساسا قيد محتمل ينبغي النظر فيه عند تنفيذ نظم الزم المتكررة لأن ذلك يمكن أن يكون حاسما بالنسبة للتركيز النهائي المتراكم. التعرض على أساس المواد الكيميائية من ناحية أخرى، في حين لا يخلو من القيود الخاصة بهم للنظر، وتقديم نهج أكثر تبسيطا في أن المواد الكيميائية تميل إلى البقاء في الحل، وبالتالي استبدال مباشر للتركيز الكيميائي الأصلي بالإضافة إلى تركيز المضافة حديثا يضمن أن يتم استبدال أي مادة كيميائية فقدت خلال المرطبات وسائل الإعلام وفقا لذلك29. وتشمل التطبيقات المستقبلية تقييم مدى ملاءمة النموذج لنظم التعرض المتكررة على مدى فترات الثقافة الطويلة الأجل، حيث أن استراتيجيات التعاطي المتكررة ذات أهمية حاسمة لتقييم قدرة نظام عضوي معين على تحسين أو التغلب على الآثار الضارة، إن وجدت، الناجمة عن التراكم البيولوجي لمادة زينوبيوتية.
وفي الختام، فإن هذا النموذج الكبدي ثلاثي الأبعاد في المختبر لديه القدرة على الاستفادة منه لتقييم مجموعة من سيناريوهات التعرض الواقعية، وبالتالي توفير نهج مستقبلي في المختبر لدعم أفضل لكل من ENM وتقييم المخاطر الكيميائية بطريقة روتينية وسهلة الوصول إليها.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بأن هذا البحث قد تلقى تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 لمشروع PATROLS، بموجب اتفاق المنح رقم 760813
Materials
| Aflotoxin B1 | Sigma Aldrich, UK | A6636-5MG | |
| Agarose | Sigma Aldrich, UK | A9539-50G | |
| Autoclave Tape | |||
| BCG Albumin Assay | Sigma Aldrich, UK | MAK124 | |
| Bovine Serum Albumin Powder | Sigma Aldrich, UK | A9418 | |
| Cell Freezing Aid | Thermo Fisher Scientific, UK | 5100-0001 – Mr Frosty | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Cytochalasin B | Merck, UK | 250233 | |
| Cytology Metal Clips | |||
| Cytospin 4 Centrifuge | ThermoFisher Scientific, UK | CM00730202 | |
| DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine | GIBCO, Paisley, UK | 41965-039 | |
| DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes | GIBCO, Paisley, UK | 21063-029 | |
| DPX Mounting Medium | FisherScientific, UK | D/5330/05 | |
| Ethanol | FisherScientific, UK | 10048291 | |
| FBS | GIBCO, Paisley, UK | 10270-106 | |
| Filter Cards for Shandon Cytospin | FisherScientific, UK | 15995742 | |
| Frosted Glass Slides | ThermoFisher Scientific, UK | ||
| Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr | VWR Chemicals, UK | MFCD00081642 | |
| Glass Coverslips (24 x 60) | Deckglaser, VWR | ECN631-1575 | |
| Haemocytometer and Coverslip | |||
| Immersion Oil for Microscope | Zeiss, UK | 518F, ISO8034 | |
| Laminar Class II Tissue Culture Hood | Scanlaf Mars | ||
| Light Microscope | Zeiss, UK | Axiovert 40C | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Methanol | FisherScientific, UK | 10284580 | |
| Microwave | |||
| Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips | Greiner-Bio-One, UK | ||
| NuncMicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific, Denmark | 167008 | |
| P1000 and P200 micropipettes | |||
| P300 and P50 multi-channel pipettes | |||
| PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free | GIBCO, Paisley, UK | 14190-094 | |
| Pen/Strep | GIBCO, Paisley, UK | 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml | |
| Phosphatase Buffer Tablets | GIBCO, Paisley, UK | 10582-013 | |
| Pipette Boy | |||
| Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges | FisherScientific, UK | 11690581 | |
| Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe | Branson, USA | 101-063-971R | |
| T-25 and T-75 Tissue Culture Flask | Greiner-Bio-One, UK | T-25 (690175) and T-75 (660175) | |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich, UK | T8154-100mL | |
| Urea Assay Kit | Sigma Aldrich, UK | MAK006 | |
| Virkon Disinfectant | DuPont, UK | Rely+On Virkon | |
| Water Bath (37˚C) | Grant JBNova 18 | ||
| Weighing Balance | |||
| Xylene | FisherScientific, UK | 10588070 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | GIBCO, Paisley, UK | 5300-054 | |
| 0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
| 0.45µm Filter Unit | Millex HA, MF-Millipore, UK | SLHA033SS | |
| 1.0mL Syringe | BD Plastipak, FisherScientific, UK | 300185 | |
| 20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps | DWK Life Sciences GmbH, Germany | WHEA986581 | |
| 37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator | NUAIRE DHD Autoflow | ||
| 3mL Pasteur Pipette | Greiner-Bio-One, UK | ||
| 50mL Conical Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
| 50mL or 100mL Glass Bottles | |||
| 50mL Skirted Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
| 5mL, 10mL and 25mL Pipettes | Greiner-Bio-One, UK | ||
| 9.4cm Square, Petri Dish | Greiner-Bio-One, UK | 688161 |
Referências
- Geiser, M., Kreyling, W. G. Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).
- Modrzynska, J. Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver. Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
- Shah, U. -. K., et al. A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).
- Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates. Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).
- van Grunsven, L. A. 3D in vitro models of liver fibrosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).
- Corvi, R., Madia, F. In vitro genotoxicity testing – can the performance be enhanced. Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).
- Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
- OECD. . OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).
- Sison-Young, R. L., et al. A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity. Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).
- European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines (2019)
- Jensen, K. A. The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG. European Union Grant Agreement n° 2009. 21, 01 (2014).
- Marchese, S., et al. Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development. Toxins. 10, 214 (2018).
- Rushing, B. R., Selim, M. I. Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods. Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).
- Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model. Scientific Reports. 9, 7295 (2019).
- Berger, B., et al. Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail. Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).
- Ramaiahgari, S. C., et al. A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies. Archives of Toxicology. , (2014).
- Li, Y., et al. Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials. Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).
- Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).
- Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).
- Asthana, A., Kisaalita, W. S. Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures. Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).
- Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).
- Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles. Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).
- Hinderliter, P. M., et al. ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies. Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).
- Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies. Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).
