Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real

La transmisión de un virus se basa en la combinación de varios factores. Para un virus secretado en el medio ambiente, su transmisión también depende de la capacidad de persistir en condiciones fuera del huésped. El estudio de la inactivación viral en general es, por lo tanto, un paso crucial para ayudar a las autoridades sanitarias nacionales y a los responsables políticos a implementar medidas de control y bioseguridad.

El conocimiento sobre la persistencia del virus en entornos naturales y de laboratorio ha aumentado considerablemente en la última década. En el caso de los virus de la influenza A (IAV), sus rutas de transmisión someten las partículas virales a una amplia gama de condiciones ambientales. Específicamente, pueden transmitirse a través de 1) vías fecal-orales a través del agua (es decir, virus aviares), o 2) contacto directo o indirecto por fómites contaminados, así como aerosoles y gotitas respiratorias (es decir, virus de aves de corral y mamíferos)¹. En cualquier caso, los IAV se someten a diversos parámetros fisicoquímicos (es decir, pH, salinidad, temperatura y humedad), que afectan más o menos rápidamente a su infectividad2,3,4,5,6,7,8,9. Es de gran importancia, especialmente en lo que respecta a los virus zoonóticos y pandémicos, evaluar el potencial de los factores ambientales para afectar la dinámica del virus y los riesgos de exposición y transmisión entre especies.

Hasta ahora, las técnicas tradicionales de virología (es decir, la determinación del título viral a través de ensayos de placa o la estimación de la dosis infecciosa del cultivo de tejidos al 50%) se han utilizado para evaluar la infectividad de IAV a lo largo del tiempo; pero estas técnicas requieren mucho tiempo y requieren muchos suministros10,11,12. La medición de la impedancia de las células infectadas a lo largo del tiempo con microelectrodos sirve como una herramienta útil para monitorear la supervivencia de IAV en diferentes condiciones ambientales, así como la inactivación viral en general. Este método proporciona datos objetivos en tiempo real que reemplazan la observación humana subjetiva de los efectos citopáticos. Se puede utilizar para determinar la titulación del virus, reemplazando así las mediciones tradicionales con intervalos de confianza más bajos y evitando los ensayos de punto finales que requieren mucha mano de obra.

Existe una correlación lineal entre los resultados de titulación obtenidos mediante la medición de la impedancia celular y mediante el ensayo clásico de placa o los métodos _TCID50. Por lo tanto, los datos obtenidos con el método de titulación basado en impedancia se pueden transformar fácilmente en valores _TCID50 o pfu mediante la creación de una curva estándar con dilución en serie del virus13,14,15,16,17. La detección, cuantificación y eficacia de los anticuerpos neutralizantes presentes en muestras de suero también se puede lograr utilizando este enfoque ^{experimental18,19}. Más recientemente, se han utilizado ensayos celulares basados en impedancia para detectar y evaluar compuestos antivirales contra equid alfaherpesvirus20.

Esta tecnología se ha utilizado para evaluar la persistencia de IAV en agua salina a diferentes temperaturas y para identificar mutaciones en la hemaglutinina de IAV que aumentan o disminuyen la persistencia de IAV en el medio ^ambiente21. Dicha detección requeriría un trabajo extenso si se utilizan métodos tradicionales de titulación. Sin embargo, esta metodología se puede utilizar para cualquier virus que tenga un impacto en la morfología celular, el número de células y la fuerza de unión de la superficie celular. También se puede utilizar para controlar la persistencia en diversas condiciones ambientales (es decir, en el aire, en el agua o en superficies).

El protocolo descrito aquí aplica la supervivencia de IAV en el agua como ejemplo. Los virus de la influenza humana están expuestos a diferentes parámetros fisicoquímicos durante períodos prolongados. Se eligió el agua salina (35 g/L NaCl) a 35 °C como modelo ambiental basado en resultados ^anteriores9. La infectividad residual de los virus expuestos se cuantifica en diferentes puntos de tiempo a través de la infección celular. Las células MDCK, el tipo de célula de referencia para la amplificación de IAV, se siembran en placas de microtitulación de 16 pocillos recubiertas con sensores de microelectrodos e infectadas por virus expuestos 24 h después. La impedancia celular se mide cada 15 minutos y se expresa como una unidad arbitraria llamada índice celular (IC). Los efectos citopáticos inducidos por el virus de la gripe, cuya tasa de aparición depende directamente del número de partículas virales infecciosas inoculadas al cultivo celular, conduce a la disminución del IC, que posteriormente se cuantifica como el valor _CIT50 . Este valor corresponde al tiempo necesario para medir una reducción del 50% desde el IC inicial (es decir, antes de la adición del virus). Los valores de _CIT50 calculados para varios tiempos de exposición ambiental permiten deducir la pendiente de inactivación de un virus después de la regresión lineal de los valores de _CIT50 .