Viral Kaynaklı Nöroinflamatuar Yanıtları İncelemek Için Fare Ayak Takımı Aşılama Modeli
Summary
Ayak takımı aşılama modeli in vivo viral kaynaklı nöroinflamatuar yanıtları karakterize etmek için değerli bir araçtır. Özellikle, viral kinetik ve ilgili immünopatolojik süreçlerin periferik sinir sisteminde başlatılan net bir değerlendirme sağlar.
Abstract
Bu protokol farelerde alfaherpesvirus enfeksiyonu sırasında nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve geliştirilmesi için kullanılan bir footpad aşılama modeli açıklar. Alfaherpesvirüsler periferik sinir sisteminin ana işgalciler ilerler gibi (PNS), Bu model viral çoğaltma kinetik karakterize etmek için uygundur, CNS PNS onun yayılması, ve ilişkili nöroinflamatuar yanıtlar. Ayak takımı aşılama modeli virüs parçacıkları nın ayak takımı epidermisindeki birincil enfeksiyon bölgesinden epidermisin, ter bezlerini ve dermisi innerve eden duyusal ve sempatik sinir liflerine yayılmasını sağlar. Enfeksiyon dorsal kök gangliyonu siyatik sinir yoluyla yayılır (DRG) ve sonuçta beyne omurilik yoluyla. Burada, bir fare footpad pseudorabies virüs (PRV), bir alfaherpesvirüs yakından herpes simpleks virüsü (HSV) ve varisella-zoster virüsü (VZV) ile ilgili aşılanır. Bu model PRV enfeksiyonu ciddi inflamasyon neden olduğunu göstermektedir, ayak ve DRG nötrofil infiltrasyon ile karakterize. Yüksek inflamatuar sitokin konsantrasyonları daha sonra ELISA tarafından homojendokularda saptanır. Buna ek olarak, DRG’de PRV geni ile protein ekspresyonu (qPCR ve IF boyama yoluyla) ile pro-inflamatuar sitokin üretimi arasında güçlü bir korelasyon gözlenmektedir. Bu nedenle, ayak takımı aşılama modeli alfaherpesvirüs kaynaklı nöropatilerin altında yatan süreçlerin daha iyi anlaşılmasını sağlar ve yenilikçi tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir. Buna ek olarak, model periferik nöropatiler üzerinde araştırma rehberlik edebilir, multipl skleroz ve PNS ilişkili viral kaynaklı hasar gibi. Sonuçta, uyuşturucu gelişimi için bir maliyet-etkin in vivo aracı olarak hizmet verebilir.
Introduction
Bu çalışma, PNS’den CNS’ye ve ilişkili nöroinflamatuar yanıtlara kadar virüslerin replikasyonve yayılmasını araştırmak için bir footpad aşılama modelini açıklamaktadır. Ayak takımı aşılama modeli yoğun nöronlarda alfahiçvirüs enfeksiyonu çalışmak için kullanılmıştır1,2,3. Bu modelin temel amacı nörotropik virüsler CNS ulaşmadan önce PNS ile maksimal bir mesafe seyahat etmek için izin vermektir. Burada, bu model psödorabis virüsü (PRV) ile enfekte farelerde belirli bir nöropati (nöropatik kaşıntı) gelişiminde yeni anlayışlar elde etmek için kullanılır.
PRV birkaç iyi bilinen patojenler ile ilgili bir alfaherpesvirus (yani, herpes simpleks tip 1 ve 2 [HSV1 ve HSV2] ve varisella-zoster virüsü [VZV]), hangi soğuk yaralar, genital lezyonlar ve su çiçeği neden, sırasıyla4. Bu virüslerin hepsi pantropik ve belirli bir doku tipi için yakınlık göstermeden birçok farklı hücre tipleri enfekte edebiliyoruz. Ancak, hepsi ev sahibi türlerin PNS (ve bazen, CNS) işgal ederek karakteristik bir nörotropizm sergiler. Doğal konak domuz, ama PRV en memeliler bulaştırmak olabilir. Bu doğal olmayan konaklarda, PRV PNS enfekte ve şiddetli bir pruritus indükler “deli kaşıntı”, perakut ölüm takip5,6. PRV enfeksiyonunun klinik sonucu ve patogenezinde nöroimmün yanıtın rolü tam olarak anlaşılamamıştır.
Ayak takımı aşılama modeli PRV footpad epidermal hücrelerde enfeksiyon başlatmak için izin verir. Daha sonra, enfeksiyon epidermis innerve duyusal ve sempatik sinir lifleri içine yayılır, ter bezleri, ve dermis. Enfeksiyon yaklaşık 60 saat içinde DRG siyatik sinir yoluyla hareket eden virüs parçacıkları tarafından yayılır. Enfeksiyon omurilik yoluyla yayılır, sonuçta hayvanlar moribund (82 h post-enfeksiyon) haline geldiğinde arka beyne ulaşan. Bu süre zarfında doku örnekleri toplanabilir, işlenebilir ve virüs replikasyonu ve immün yanıt ın belirteçleri için analiz edilebilir. Örneğin, PRV patogenezinde klinik, virolojik ve nöroinflamatuar süreçlerin başlatılması ve gelişimi arasında korelasyon lar kurmak için farklı dokularda histolojik inceleme ve viral yük nicelliği yapılabilir.
Ayak takımı aşılama modeli kullanılarak farelerde PRV’ye bağlı pruritusun hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırılabilir. Ayrıca, Bu model herpesvirus enfeksiyonları sırasında virüs kaynaklı nöroinflamasyon başlatılması ve gelişimi içine yeni bir fikir sağlayabilir. Alfaherpesvirüs kaynaklı nöropatilerin altında yatan süreçlerin daha iyi anlaşılması yenilikçi tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir. Örneğin, bu model post-herpezik lezyonları olan hastalarda nöropatik kaşıntı mekanizmaları araştırmak için yararlıdır (örneğin, herpes zoster, zona) ve ilgili insan hastalıkları için farelerde yeni terapötik hedefleri test.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan ayak takımı aşılama modeli alfaherpesvirüs enfeksiyonu sırasında nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve gelişimini araştırmak için yararlıdır. Ayrıca, bu in vivo modeli çoğaltma kinetik kurmak ve PNS CNS alfaherpesvirus yayılması nı kurmak için kullanılır. Bu diğer aşılama modelleri için bir alternatif, yan deri aşılama modeli gibi, hangi derin dermal çizilme dayanır13, veya intrakranial rota, doğrudan CNS içine virüs tanıttı<sup clas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar histopatoloji analizleri yürüten mükemmel teknik destek için Charles River laboratuvarları kabul. Bu çalışma Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) (RO1 NS033506 ve RO1 NS060699) tarafından finanse edilmiştir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
Referências
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
- Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
