Neumografía de impedancia para la medición mínimamente invasiva de la frecuencia cardíaca en invertebrados en etapa tardía
Summary
La medición de la frecuencia cardíaca durante un desafío térmico proporciona información sobre las respuestas fisiológicas de los organismos como consecuencia de un cambio ambiental agudo. Utilizando la langosta americana (Homarus americanus) como organismo modelo, este protocolo describe el uso de neumografía de impedancia como un enfoque relativamente no invasivo y no letal para medir la frecuencia cardíaca en invertebrados de etapa tardía.
Abstract
Las temperaturas en los océanos están aumentando rápidamente como consecuencia de los cambios generalizados en los climas mundiales. Como la fisiología del organismo está fuertemente influenciada por la temperatura ambiental, esto tiene el potencial de alterar el rendimiento fisiológico térmico en una variedad de organismos marinos. Usando la langosta americana (Homarus americanus) como organismo modelo, este protocolo describe el uso de neumografía de impedancia para entender cómo el rendimiento cardíaco en invertebrados de etapa tardía cambia bajo estrés térmico agudo. El protocolo presenta una técnica mínimamente invasiva que permite la recolección en tiempo real de la frecuencia cardíaca durante un experimento de rampa de temperatura. Los datos se manipulan fácilmente para generar una gráfica de Arrhenius que se utiliza para calcular la temperatura de rotura de Arrhenius (ABT), la temperatura a la que la frecuencia cardíaca comienza a disminuir con el aumento de las temperaturas. Esta técnica se puede utilizar en una variedad de invertebrados de etapa tardía (es decir, cangrejos, mejillones o camarones). Aunque el protocolo se centra únicamente en el impacto de la temperatura en el rendimiento cardíaco, se puede modificar para comprender el potencial de que los factores de estrés adicionales (por ejemplo, hipoxia o hipercapnia) interactúen con la temperatura para influir en el rendimiento fisiológico. Por lo tanto, el método tiene potencial para aplicaciones de amplio alcance para comprender mejor cómo los invertebrados marinos responden a cambios agudos en el medio ambiente.
Introduction
En las últimas décadas, el aumento de la entrada de gases de efecto invernadero (es decir, dióxido de carbono, metano y óxido nitroso) a la atmósfera ha dado lugar a patrones generalizados de cambio ambiental1. Los océanos del mundo se están calentando rápidamente2,3, una tendencia que puede tener graves impactos en la fisiología del organismo. La temperatura influye en gran medida en las tasas fisiológicas, y los organismos tienen un rango de temperatura óptimo para el rendimiento4,5,6. Como tal, individuos pueden encontrar dificultades para mantener la entrega adecuada de oxígeno a los tejidos como temperaturas se desvían fuera de este rango. Esto tiene el potencial de conducir a la disminución del rendimiento aeróbico frente al calentamiento de las temperaturas del océano5,7.
En un entorno de laboratorio, un método para entender los impactos fisiológicos del cambio ambiental es examinar el rendimiento cardíaco en el contexto del estrés térmico. Esto proporciona una idea de cómo la exposición a las condiciones de calentamiento previstas puede alterar las curvas de rendimiento5,,6, así como el potencial de plasticidad de aclimatación8. Se han implementado con éxito una variedad de métodos para medir previamente la frecuencia cardíaca en los invertebrados marinos. Sin embargo, muchas de estas técnicas implican la extracción quirúrgica o manipulación mayor del exoesqueleto y la implantación prolongada de dispositivos de medición99,10,,11, que introduce estrés adicional al sujeto de prueba y aumenta el tiempo necesario para una recuperación exitosa antes de la experimentación. Además, las técnicas menos invasivas (por ejemplo, observación visual, videografía) pueden limitarse a las primeras etapas de la historia de la vida, cuando los organismos pueden ser totalmente o semitransparentes12. Además, se pueden presentar desafíos adicionales a los investigadores que no están bien versados en metodologías más avanzadas tecnológicamente (por ejemplo, observaciones a través de transductores infrarrojos o perfusión Doppler8,11).
Este protocolo utiliza la langosta americana (Homarus americanus) como un modelo de invertebrado marino en etapa tardía para demostrar el uso de neumografía de impedancia para evaluar los cambios en la frecuencia cardíaca durante un experimento de rampa de temperatura. La neumografía de impedancia implica el paso de una corriente eléctrica oscilante (AC) a través de dos electrodos colocados a ambos lados del pericardio para medir los cambios de voltaje a medida que el corazón se contrae y se relaja13,14. Esta técnica es mínimamente invasiva, ya que emplea el uso de pequeños electrodos (es decir, 0,10–0,12 mm de diámetro) que se implantan suavemente justo debajo del exoesqueleto. Por último, proporciona evaluaciones en tiempo real tanto de la frecuencia cardíaca como de la temperatura del agua durante la rampa mediante el uso de un registrador de datos.
El protocolo también proporciona instrucciones para calcular la temperatura de rotura de Arrhenius (ABT), la temperatura a la que la frecuencia cardíaca comienza a disminuir con el aumento de las temperaturas13,15. El ABT sirve como un indicador no letal del límite térmico de la capacidad en sujetos de ensayo que pueden ser favorecidos sobre la medición del máximo térmico crítico (CTmax, el límite superior de la función cardíaca5,6), ya que los límites letales son a menudo extremos y rara vez se encuentran en el entorno natural5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el uso de neumografía de impedancia para medir los cambios en la frecuencia cardíaca de los invertebrados en etapa tardía durante un experimento de rampa de temperatura. El principal beneficio de esta técnica en comparación con otros enfoques basados en laboratorio9,,10,11 es que es mínimamente invasivo y no implica una manipulación quirúrgica importante del exoesqueleto, reduciendo así la cantid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Paul Rawson por la asistencia de laboratorio y el premio IIA-1355457 de la National Science Foundation a Maine EPSCoR en la Universidad de Maine por fondos para comprar equipos. Este proyecto fue apoyado por el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA, el número de proyecto Hatch MEO-21811 a través de la Estación Experimental Agrícola y Forestal de Maine, así como el Servicio Nacional de Pesca Marina de la NOAA Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Los autores también agradecen a tres revisores anónimos por sus comentarios sobre una versión anterior de este manuscrito. Maine Estación Experimental Agrícola y Forestal Publicación Número 3733.
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
Referências
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