Подготовка малых РНК-библиотек для секвенирования ранних эмбрионов мыши
Summary
Мы описываем метод профилирования микроРНК в ранних эмбрионах мышей. Этот протокол преодолевает проблему низкого ввода клеток и небольшого обогащения РНК. Этот анализ может быть использован для анализа изменений экспрессии miRNA с течением времени в различных клеточных линиях раннего эмбриона мыши.
Abstract
МикроРНК (миРНК) имеют важное значение для комплексного регулирования решений судьбы клеток и сроков развития. In vivo исследования вклада miRNAs во время раннего развития являются технически сложными из-за ограничения числа клеток. Кроме того, многие подходы требуют, чтобы в таких анализах, как северная blotting, microarray и qPCR, была определена мирная РНК, представляющих интерес. Таким образом, выражение многих miRNAs и их изоформы не были изучены в начале развития. Здесь мы демонстрируем протокол для небольшого РНК-секвенирования отсортированных клеток ранних эмбрионов мышей, чтобы обеспечить относительно объективное профилирование миРНК в ранних популяциях нервных клеток гребня. Мы преодолеваем трудности низкого ввода клеток и выбора размеров во время подготовки библиотеки с использованием усиления и очистки на основе геля. Мы определяем эмбриональный возраст как переменную, учитывая различия между репликациями и сценическими эмбрионами мыши, которые должны использоваться для точного профиля миРНК в биологических репликациях. Наши результаты показывают, что этот метод может быть широко применен для профиля выражения miRNAs из других линий клеток. Таким образом, этот протокол может быть использован для изучения того, как миРНК регулируют программы развития в различных клеточных линиях раннего эмбриона мыши.
Introduction
Центральным вопросом биологии развития является то, как одна недифференцированная клетка может привести к развитию всего организма с многочисленными сложными типами клеток. Во время эмбриогенеза, потенциал развития клеток становится постепенно ограничен, как организм развивается. Одним из примеров является линия нервного гребня, которая постепенно отличается от многопотентной популяции клеток на различные производные терминала, такие как периферические нейроны, глиа, черепная кость и хрящ. Нейронные клетки гребня указаны от эктодерма во время гастрипуляции, а затем проходят эпителиальный мезенхимальный переход и мигрируют через эмбрион в дискретные места по всему телу, где они будут неизлечимодифференцировать 1. Десятилетия работы выявили транскрипционные гены нормативной сети, но гораздо меньше известно о механизмах пост-транскрипционные регулирования, которые контролируют сроки развития нервного гребня.
Предыдущая работа предполагает, что микроРНК (миРНК) подавляют экспрессию генов для правильного времени развитияи решения судьбы клеток 2,,3,,4,,5,,6. Исследования миРНК в развитии нервного гребня в значительной степени сосредоточены на более поздних стадиях черепно-мозгового развития. Например, miR-17-92 и miR-140 имеют решающее значение для небогенеза во время черепно-мозгового развития у мыши изебры, соответственно 7,8. Вклад миРНК в самые ранние решения судьбы нервного гребня эмбриона не был тщательно исследован. Исследования миРНК в ранних решениях судьбы были ограничены техническими проблемами, такими как низкое число клеток, присутствующих в ранних эмбрионах.
MiRNAs были профилированы в пробирке от клеточных линий с использованием эмбриональных тел на разных стадиях дифференциации для моделирования раннейразработки мыши 9. Исследование малых РНК in vivo во время раннего развития млекопитающих было относительно ограниченным. Предыдущие методы профиля miRNAs привели к предвзятости, как известная последовательность используется для анализа экспрессии конкретной миРНК в таких методах, как qPCR, microarrays, и северныепятна 10. Секвенирование следующего поколения и постоянно совершенствующиеся молекулярные инструменты теперь позволяют относительно объективному анализу экспрессии миРНК изучить их вклад в раннее развитие млекопитающих и решения судьбы клеток.
Здесь мы сообщаем о технике сбора и последовательности малых РНК, выраженных в нервных клетках гребня от ранних эмбрионов мыши, охватывающих гастрипуляцию (E7.5) до начала органогенеза (E9.5). Этот метод прост и сочетает в себе отслеживание линий, сортировку клеток и выбор размеров на основе геля для подготовки небольших библиотек секвенирования РНК из минимального количества ячеек для секвенирования следующего поколения. Мы подчеркиваем важность строгого сопоставления стадии сомитов эмбрионов для разрешения 6-часовых интервалов времени для получения всестороннего представления о миРНК во время быстрых изменений раннего развития. Этот метод может быть широко применен к генетическим исследованиям и исследованиям в области развития и позволяет избежать объединения эмбрионов. Мы описываем способ преодоления проблем, связанных с современными методами, такими как обогащение миРНК с помощью очистки на основе геля, библиотечной количественной оценки и минимизации предубеждений, связанных с ПЦР. Этот метод был использован для выявления моделей экспрессии miRNA с течением времени, чтобы изучить, как miRNAs контролировать время развития в нейронной линии гребня эмбрионов мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процессы развития могут происходить быстро, и клетки проходят много последовательных спецификаций, таких как, чтобы захватить всеобъемлющее представление о miRNAs способствует ранней судьбы решений, более конкретные постановки необходимо, чем широко используется полдня приращения. Недавнее исследование провело РНК секвенирования из Theiler этапе 12 эмбрионов, которые варьируются от 3 до 6 somites11. Мы находим, что в течение этого периода времени, нервные клетки гребня указаны (3 сомитов возраста), delaminate (4 сомитов возраста), и мигрировать (5-6 somites возраста). Мы также находим, что помимо Cre-драйвера, используемого для отслеживания популяций клеток, возраст является крупнейшим источником вариаций между биологическими образцами, и только сомитные эмбрионы должны рассматриваться как репликации. Это также следует принимать во внимание при сравнении трансгенных эмбрионов с контролем дикоготипа.
Предыдущие методы профиля miRNAs во время раннего развития использовали между 10-100 нг РНК ввода для небольшой РНК секвенирования библиотеки подготовки и объединили несколько эмбрионов водин образец 13,14. Мы демонстрируем изоляцию РНК и подготовку библиотеки от одного эмбриона E7.5 или от отсортированных нейронных клеток гребня на E8.5 и E9.5, используя приблизительно 100 нг общей РНК в качестве входного сигнала. При диссоциации эмбрионов для сортировки, следует позаботиться, чтобы наблюдать за диссоциацией под микроскопом и утолить реакцию наблюдать, когда одиночные клетки получены. Мы находим, что диссоциация черепной области эмбрионов E8.5-E9.5 почти мгновенно с нежным ручным пипетки, как описано в протоколе. Для больших тканей и все более старых эмбрионов время диссоциации может быть больше в зависимости от части диссоциации эмбриона. Для эмбрионов E7.5-E9.5 скопления клеток легко видны под микроскопом, и диссоциация должна продолжаться до тех пор, пока не будут видны больше сгустки. Одиночные ячейки видны в растворе, если вы отрегулируете фокус через раствор в вашем амо где угодно от 5-10x. Предыдущие методы сортировки ячеек непосредственно в буфер лиза для секвенирования РНК для подготовки объемных РНК из небольшого числа ячеек14. Здесь мы сортим непосредственно в растворе лиза извлечения РНК, так что РНК может быть изолирована до начала подготовки библиотеки. Использование мини-столбцов с объемом элюции 11 МКЛ позволило проработать достаточно высокую концентрацию РНК, так что одна РНК-подготовка могла быть разделена между небольшой РНК и секвенированием рнк навалом.
Одним из нынешних ограничений большинства малых методов секвенирования РНК является усиление ПЦР преобразованного кДНК. Наш метод не преодолевает это ограничение, но мы смогли свести к минимуму количество циклов ПЦР с 25-максимально рекомендованных до 16 циклов. Это сокращение усиления уменьшает искусственное усиление смещения, введенной ПЦР. Другим источником смещения является перевязка адаптеров, где известно, что конкретные последовательности, расположенные на концах адаптеров и miRNAs может ligate вместе с большей эффективностью, чем другие последовательности. Чтобы избежать этого, адаптеры, используемые в этом протоколе, имеют 4 случайные базы, включенные в конце каждого адаптера, чтобы предотвратить предвзятость в реакциях перевязки. Кроме того, другой распространенной проблемой является количество адаптерных димеров, которые образуются при низком входе РНК. Комплект подготовки библиотеки включает в себя шаги по сокращению образования адаптера димера, такие как инактивация адаптера и очистка бисера для удаления избыточных адаптеров после каждой перевязки. Мы также разбавили 3′ и 5′ 4N адаптеры на 1/4, чтобы уменьшить количество адаптера димер, который может образовываться. Мы обнаружили, что, когда не разбавленный, 130 bp интенсивность полосы увеличивается, что затрудняет отличить от 150 bp полоса, содержащая желаемые небольшие библиотеки РНК на гель.
Еще одной текущей проблемой подготовки библиотек секвенирования является точная количественная оценка продукта до секвенирования. Мы обнаружили, что различные методы дают различные результаты в одной библиотеке. Мы предлагаем исследователям использовать несколько методов количественной оценки, чтобы получить точную оценку концентрации.
Этот протокол может быть широко применен к генетическим исследованиям, исследованиям в области развития или другим приложениям, где РНК собирается из небольшого количества клеток. Этот подход упрощает височные исследования, избегая объединения эмбрионов и может быть легко применен как к не сортированы и отсортированы клетки.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан Фондом Эндрю МакДоноу БЗ и NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. является стипендиатом CPRIT в области исследований рака (RR150106) и V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Авторы также хотели бы отметить цитометрию и ядро сортировки клеток в BCM за предоставление оборудования, необходимого для этого проекта.
Materials
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
Referências
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P. Potential pitfalls in microRNA profiling. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 3 (5), 601-616 (2012).
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
